Name: cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Z.C.A. ble støttet av Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2219- International Postdoctoral Research Fellowship Program. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Center for Complimentary and Integrative Medicine of the National Institutes of Health under tildeling nummer 1R41AT011716-01. Dette arbeidet ble også delvis støttet av American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, Regis Technologies grant til L.C. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

1. Cellekultur av SH-SY5Y nevroblastomceller (TrkB og TrkB-NULL (foreldre) cellelinjer)
MERK: Cellelinjer (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) og SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 ble kjøpt fra Kerafast. Kultiverte celler brukes som en kilde til transmembranreseptorene som skal immobiliseres for fremstilling av CMAC-kolonner. Trinnene nedenfor beskriver hvordan du får tak i cellemembranfragmenter og monterer funks...

Identifisering av aktive forbindelser tilstede i komplekse blandinger av spesialiserte metabolitter er en svært utfordrende oppgave23. Tradisjonelt er individuelle forbindelser isolert, og deres aktivitet testes i forskjellige analyser. Denne tilnærmingen er tidkrevende og kostbar og fører ofte til isolasjon og identifisering av de mest tallrike og godt karakteriserte forbindelsene23. For tiden brukes screeninganalyser med høy gjennomstrømning og er avhengige av scree...

Botaniske blandinger er rike på farmakologisk aktive forbindelser1, og tjener som en god kilde for identifisering av nye legemiddeltreff og fører 2,3,4,5. Oppdagelsen av nye medisiner fra naturlige produkter har vært en fruktbar tilnærming, og mange for tiden godkjente legemidler stammer fra forbindelser som først ble identifisert i naturen. Det kjemiske mangfoldet av naturlige forbindelser er vanskelig å bli matchet av menneskeskapte biblioteker av kjemisk syntetiserte molekyler. Mange naturlige forbindelser samhandler med og modulerer menneskelige proteinmål og kan betraktes som evolusjonært optimaliserte legemiddellignende molekyler6. Disse naturlige forbindelsene er spesielt godt egnet for legemiddelledningsidentifikasjon til bruk i nevrologiske lidelser6. To av de for tiden FDA-godkjente legemidlene for håndtering av Alzheimers sykdom (AD) er avledet fra naturlige alkaloider, nemlig: galantamin og rivastigmin (et derivat av physostigmine)6. L-DOPA, for tiden det mest foreskrevne stoffet for Parkinsons sykdom, ble først identifisert fra den brede bønnen (Vicia faba L.) 7. Pergolide og lisurid, dopaminerge reseptoragonister er derivater av naturlige ergot alkaloider fra den parasittiske soppen Claviceps purpurea8. Reserpin, en alkaloid isolert fra indisk snakeroot (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) var en av de første antipsykotika9. Nylig har dysregulert immunrespons og systemisk betennelse vært knyttet til utviklingen av mange nevrologiske plager, for eksempel stor depressiv lidelse eller nevrodegenerative sykdommer10. Et plantebasert kosthold sammen med andre livsstilsintervensjoner har vist seg å forbedre kognitive og funksjonelle evner hos eldre 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Visse elektrofile molekyler som tilhører triterpener og polyfenoler har vist seg å modulere inflammatoriske responser i både in vitro- og in vivo-modeller 12. For eksempel naturlige forbindelser som inneholder α,β-umettet karbonyl (f.eks. curcumin, cinnamaldehyd) eller isothiocyanatgruppe (f.eks. sulforaphane) forstyrrer tolllignende reseptor-4 (TLR4) dimerisering som hemmer nedstrøms syntesen av proinflammatoriske cytokiner i en murin interleukin-3 avhengig pro-B cellelinje12,22 . Epidemiologiske bevis peker sterkt på at kostholdsfytokjemikalier, tilstede i komplekse matmatriser, også kan utgjøre en levedyktig kilde til nye legemiddelledninger6.
En av de største hindringene for identifisering av biologisk aktive molekyler tilstede i planteekstrakter, inkludert plantebasert mat, er kompleksiteten til de undersøkte prøvene. Tradisjonelt er de enkelte forbindelsene isolert, renset og deretter testet for biologisk aktivitet. Denne tilnærmingen fører vanligvis til identifisering av de mest tallrike og godt karakteriserte forbindelsene. Fenotypisk legemiddeloppdagelse nærmer seg uten et definert molekylært mål, avhengig av biostyrt fraksjonering av komplekse blandinger23. I denne tilnærmingen er et ekstrakt fraksjonert i mindre komplekse underfraksjoner som senere testes i fenotypiske analyser. Isolering og rensing av aktive forbindelser styres av biologisk aktivitet verifisert i analysen. Kunnskapen om identiteten til et bestemt legemiddelmål kan øke hastigheten på identifiseringen av farmakologisk aktive forbindelser som finnes i komplekse blandinger. Disse tilnærmingene er vanligvis basert på immobilisering av det molekylære målet, for eksempel et enzym, på en solid overflate, som magnetiske perler23. De immobiliserte målene brukes deretter i screeningforsøkene, noe som resulterer i isolering av forbindelser som samhandler med målet. Selv om denne tilnærmingen har blitt mye brukt i identifisering av forbindelser rettet mot cytosoliske proteiner, har den blitt mindre vanlig brukt i identifisering av kjemikalier som samhandler med transmembranproteiner (TMPer)23. En ekstra utfordring i immobiliseringen av TMPer stammer fra det faktum at proteinets aktivitet avhenger av samspillet med cellemembranfolipider og andre molekyler i bilayeren som kolesterol23,24. Det er viktig å bevare disse subtile interaksjonene mellom proteiner og deres innfødte fosfolipid bilayermiljø når de prøver å immobilisere transmembranmålet.
I cellulær membran affinitet kromatografi (CMAC) cellemembran fragmenter, og ikke renset proteiner, er immobilisert på kunstig membran (IAM) stasjonære fase partikler23. IAM stasjonære faser fremstilles ved å binde fosfatidylkolinanaloger kovalent på silika. Nylig er det utviklet nye klasser av IAM stasjonære faser der gratis amin- og silanolgrupper er end-capped (IAM. Pc. DD2 partikler). Under CMAC kolonner forberedelse cellemembran fragmenter er immobilisert på overflaten av IAM partikler gjennom adsorpsjon.
CMAC-kolonner har blitt brukt til å immobilisere forskjellige klasser av TMPer, inkludert ionkanaler (f.eks. nikotinreseptorer), GPCR-er (f.eks. opioidreseptorer), proteintransportører (f.eks. p-glykoprotein), etc.24. De immobiliserte proteinmålene har blitt brukt i karakteriseringen av farmakodynamikk (f.eks. dissosiasjonskonstant, Kd) eller å bestemme bindende kinetikk (kpå og koff) av små molekylligander som samhandler med målet, samt i prosessen med identifisering av potensielle nye legemiddelledninger tilstede i komplekse matriser24 . Her presenterer vi utarbeidelsen av CMAC-kolonner med den immobiliserte tropomyosin kinase reseptoren B (TrkB), som har dukket opp som et levedyktig mål for narkotikaoppdagelse for mange nervesystemforstyrrelser.
Tidligere studier viste at aktiveringen av den hjerneavledede nevrotrofiske faktoren (BDNF)/TrkB-banen er forbundet med forbedring av visse nevrologiske plager, som AD eller stor depressiv lidelse 25,26,27,28. Det ble rapportert at BDNF nivåer og dens reseptor TrkB uttrykk nedgang i AD, og lignende reduksjoner svekke hippocampal funksjon i dyremodeller av29 e.Kr. Reduserte nivåer av BDNF ble rapportert i serum og hjerne hos AD-pasienter 30,31,32. Tau overekspressjon eller hyperfosforylering ble funnet å nedregulere BDNF-uttrykk i primære nevroner og AD-dyremodeller 33,34,35. I tillegg ble BDNF rapportert å ha beskyttende effekter på β-amyloid indusert nevrotoksisitet in vitro og in vivo36. Direkte BDNF-administrasjon i rottehjernen ble vist å øke læring og hukommelse hos kognitivt svekkede dyr37. BDNF/TrkB fremstod som et gyldig mål for å forbedre nevrologiske og psykiatriske lidelser, inkludert28,38 e.Kr. Å målrette BDNF/TrkB-signalveien for utvikling av terapier i AD vil potensielt forbedre vår forståelse av sykdommen39. Dessverre kan BDNF selv ikke brukes som behandling på grunn av sine dårlige farmakokinetiske egenskaper og bivirkninger40. Små molekylaktivatorer av TrkB/BDNF-veier har blitt utforsket som potensielle TrkB-ligander 41,42,43. Blant testede små molekylagonister har 7,8-dihydroksyflavon (7,8-DHF), vist seg å aktivere BDNF /TrkB-banen 41,44,45,46. Et derivat på 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenyl-4H-krom-7,8-diyl bis (metylkarbamat)) er for tiden under vurdering som et mulig legemiddel for47 e.Kr. Nylig ble det vist at flere antidepressiva jobber gjennom direkte binding til TrkB og fremme BDNF-signalering, og understreker ytterligere viktigheten av å forfølge TrkB som et gyldig mål for å behandle ulike nevrologiske lidelser48.
Protokollen beskriver prosessen med å sette sammen funksjonell TrkB-kolonne og TrkB-NULL negativ kontrollkolonne. Kolonnene er preget av et kjent naturlig produkt småmolekylær ligand: 7,8-DHF. I tillegg beskriver vi prosessen med å screene komplekse matriser, ved hjelp av planteekstrakt som eksempel, for identifisering av forbindelser som samhandler med TrkB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5446-10 mg</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9204-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-15198-400 &#956;L</td>
			<td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6506-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3795-10 &#956;g</td>
			<td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9224-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid sodium salt</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62050-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-516</td>
			<td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH-9232-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500 mL</td>
			<td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulfate salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8168-100 mL</td>
			<td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &#956;m filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E520-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td>
			<td>Regis Technologies, Inc.</td>
			<td>1-771050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9244-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (10%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978-5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>K812-500 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>0395-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR Life Science Ambreso</td>
			<td>M221-1 mL</td>
			<td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &#181;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-500 mL</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snake skin dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88245</td>
			<td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH VWR Analytical</td>
			<td>BDH9286-2.5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricorn 5/20 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>24-4064-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500 mL</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b

Kjemikalier syntetisert av planter, sopp, bakterier og marine hvirvelløse dyr har vært en rik kilde til nye narkotika treff og fører. Legemidler som statiner, penicillin, paclitaxel, rapamycin eller artemisinin, som vanligvis brukes i medisinsk praksis, har først blitt identifisert og isolert fra naturlige produkter. Imidlertid er identifisering og isolasjon av biologisk aktive spesialiserte metabolitter fra naturlige kilder en utfordrende og tidkrevende prosess. Tradisjonelt er individuelle metabolitter isolert og renset fra komplekse blandinger, etter utvinning av biomasse. Deretter testes de isolerte molekylene i funksjonelle analyser for å verifisere deres biologiske aktivitet. Her presenterer vi bruken av cellulære membranaffinitetskromatografi (CMAC) kolonner for å identifisere biologisk aktive forbindelser direkte fra komplekse blandinger. CMAC-kolonner tillater identifisering av forbindelser som samhandler med immobiliserte funksjonelle transmembranproteiner (TMPer) innebygd i deres opprinnelige fosfolipid bilayermiljø. Dette er en målrettet tilnærming, som krever å kjenne TMP hvis aktivitet man har til hensikt å modulere med den nylig identifiserte lille molekylmedisinkandidaten. I denne protokollen presenterer vi en tilnærming for å forberede CMAC-kolonner med immobilisert tropomyosin kinase reseptor B (TrkB), som har dukket opp som et levedyktig mål for narkotikaoppdagelse for mange nervesystemforstyrrelser. I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll for å montere CMAC-kolonnen med immobiliserte TrkB-reseptorer ved hjelp av nevroblastomcellelinjer som overekspresserer TrkB-reseptorer. Vi presenterer videre tilnærmingen til å undersøke funksjonaliteten til kolonnen og dens bruk i identifisering av spesialiserte plantemetabolitter som samhandler med TrkB-reseptorer.

Etter protokollen ble to CMAC kromatografiske kolonner montert: en med de immobiliserte SH-SY5Y nevroblastomcellemembranfragmentene med overekspressert TrkB og en med SH-SY5Y TrkB-NULL cellemembranfragmenter. Den korrekt monterte CMAC-kolonnen presenteres i figur 1 , og trinnene som er involvert i immobilisering av cellemembranfragment, presenteres i figur 2.
Siden immobilisering av TrkB reseptorer på IAM. Pc. DD2 kromatografisk stas...

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Protokollen beskriver fremstillingen av cellemembran affinitet kromatografi (CMAC) kolonner med immobiliserte cellemembranfragmenter som inneholder funksjonelle transmembrane tropomyosin kinase reseptor B-proteiner. Bruken av CMAC-kolonner i identifisering av spesialiserte plantemetabolitter som samhandler med disse reseptorene og tilstede i komplekse naturlige blandinger, forklares også.

Cellulær membran affinitet kromatografi kolonner for å identifisere spesialiserte plante metabolitter samhandler med immobilisert tropomyosin kinase reseptor B

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Denne vertikale presenterer viktige trinn i montering av cellemembranaffinitetskromatografikolonner med funksjonelle transmembranreseptorer. Disse kolonnene kan brukes til identifisering av små molekyler tilstede i komplekse ekstrakter og interaksjon med immobiliserte transmembranreseptorer. Cellulære membranaffinitetskromatografikolonner fremskynder identifiseringen av biologisk aktive forbindelser som finnes i komplekse blandinger.Bruken av cellulære membranaffinitetskromatografikolonner kan være av spesiell interesse for de som er interessert i identifisering av farmakologisk aktive forbindelser som finnes i komplekse naturlige matriser, for eksempel plante-, sopp- eller bakterieekstrakter. Til å begynne med, forberede 200 millimolar benzamidin lagerløsning ved å oppløse 120 benzamidin i fem milliliter ultrarent deionisert vann. Forbered en 10 millimolar PMSF lagerløsning ved å oppløse 0,017 gram PMSF i 10 milliliter etanol i en avtrekkshette.Forbered 100X proteaser inhibitorcocktail ved å oppløse kommersielt tilgjengelig proteasehemmerblanding i en milliliter ultrarent deionisert vann. Bland grundig og aliquot 200 til 300 mikroliter av cocktailen. Forbered 100 millimolar ATP lagerløsning ved å oppløse 55.114 milligram ATP disodium salthydrat i en milliliter av det ioniserte ultrarenvannet.Bland grundig og aliquot 100 mikroliter av blandingen. Forbered buffer ved å oppløse 3,03 gram Tris-HCL, 2,9 gram natriumklorid, 0,22 gram kalsiumklorid vannfri, 0,2 gram magnesiumklorid heksahydrat og 0,19 gram kaliumklorid i 500 milliliter ultrapure deionisert vann. Forbered homogeniseringsbuffer ved å blande 17,3 milliliter trisbuffer med 0,3 milliliter benzamidinbestandsløsning, 0,2 milliliter PMSF-lagerløsning, 0,2 milliliter proteaser hemmercocktail, 20 mikroliter ATP-lagerløsning, to milliliter glyserol og 0,029 gram EDTA.Juster pH til 7,4 ved hjelp av saltsyreoppløsning. Snurr ned cellene som høstes ved fire grader Celsius i fem minutter ved 400 x g og fjern supernatanten og vask den gjenværende cellepelleten med 10 milliliter 1X pH 7,4 iskald PBS. Kast supernatanten og tilsett 20 milliliter homogeniseringsbuffer.Plasser det koniske røret på isen. Overfør cellefjæringen til en 40 milliliter Dounce homogenisator vevskvern, homogeniser suspensjonen manuelt på is ved hjelp av 40 opp og ned pestle slag. Overfør homogenisert cellefjæring til et 50 milliliter konisk rør, kast pelletsen og overfør supernatanten til et nytt konisk rør.Lagre cellemembranpellet og kast supernatanten. Forbered solubiliseringsbuffer ved å blande 8,7 milliliter av bufferløsningen med 0,1 milliliter PMSF-lagerløsning, 0,15 milliliter benzamidinbestandsløsning, 0,1 milliliter proteaser hemmer cocktail, 10 mikroliter ATP-lagerløsning, en milliliter glyserol og 0,2 gram natrium kolat. Overfør løselighetsbufferen til det koniske røret med cellemembranfragmenter.Og resuspender pellets. Roter den resulterende blandingen ved 150 RPM ved fire grader Celsius i 18 timer. Etter 18 timer, sentrifuger solubiliseringsblandingen ved fire grader Celsius i 30 minutter ved 47.900 x g.Tilsett 100 milligram IAM. Pc. DD2 partikler til supernatanten og roter den resulterende suspensjonsblandingen ved 150 RPM ved fire grader Celsius i en time. Forbered dialysebuffer i fire liter ultrarent deionisert vann ved å tilsette 24 gram Tris-HCl, 23,4 gram natriumklorid, 0,06 gram kalsiumklorid, 5,85 gram EDTA og 0,07 gram PMSF.Løs opp PMSF først i et lite volum etanol og legg deretter sakte inn i begeret med bufferen. Klipp 10 centimeter cellulosemembrandialyseslange for å forberede dialyserør, og overfør suspensjonen som inneholder IAM. Pc. DD2-partikler og cellemembranfragmenter i dialyserøret.Lukk begge ender av dialyserøret med dialyserørklemmer. Plasser dialyserøret i dialysebufferen. Etter 24 timer plasserer du dialyseslangen i den nylagde dialysebufferen og fortsetter dialysen i ytterligere 24 timer.Forbered 10 millimolar pH 7,4 ammoniumacetatbuffer som skal brukes til å vaske IAM. Pc. DD2-partikler og i kolonnekarakteriseringseksperimenter ved å oppløse 0,778 gram ammoniumacetat i en liter ultrarent deionisert vann. Etter 48 timers dialyse, fjern dialyserøret fra dialysebufferen og overfør innholdet i dialyserøret til et 15 milliliter konisk rør.Kast supernatanten og vask den gjenværende pellet tre ganger med 10 milliliter ammoniumacetatbuffer. Etter den tredje vasken, resuspend den gjenværende pellet i en milliliter ammoniumacetatbuffer. Bland den grundig og bruk den resulterende slurryen til å pakke 5 x 20 glasskolonnen for å gi CMAC-kromatografikolonnen.For å pakke kolonnen, plasser et bunnfilter som tidligere var gjennomvåt med ammoniumacetatbuffer i filterholderen. Monter filterholderen i glasssøylen og skru søylehetten for å feste holderens posisjon. Plasser søylen vertikalt i en fingerklemme og fest den i labstativet.Plasser et beger under kolonnen, overfør et lite volum av slammet sakte inn i glasskolonnen med en enkelt kanalpipetter som holder pipettespissen mot glasssøyleveggen. For å øke hastigheten på pakkeprosessen, fjern bufferen fra over den stasjonære sengen med en mikropipette mellom hvert trinn. Plasser et toppfilter og skru adapterenheten slik at det ikke er noen gjenværende buffer over den stasjonære fasen.Fest plasseringen av adapterenheten med adapterlåsen. Koble kolonnen til en høyytelses væskekromatografipumpe, og for å vaske kolonnen over natten med ammoniumacetatbuffer, sett strømningshastigheten til 0,2 milliliter per minutt. For lengre lagring, kjør kolonnen med 0,05% natriumazidoppløsning i ammoniumacetatbuffer, iført labfrakk, vernebriller og hansker når du arbeider med natriumazid og lagre ved fire grader Celsius.IAM.Pc. DD2-partikler med immobilisert nevroblastom TrkB cellemembranfragmenter og i nærvær av BDNF resulterte i fluorescerende partikler. Ingen fluorescens ble observert i TrkB nullcellemembran innkapslede IAM-partikler eller når ingen BDNF ble brukt som i TrkB-cellemembran innkapslede IAM-partikler. En funksjonell CMAC kolonner typisk frontal affinitet kromatogram av økende 7, 8-DHF konsentrasjoner av en millimolar, 750 nanomolar, 500 nanomolar, og 300 nanomolar til immobiliserte TrkB reseptorer er vist, som viste en konsentrasjon avhengig endring i oppbevaringstid.En ikke-fungerende CMAC-kolonne viste mangelen på konsentrasjonsavhengige endringer i oppbevaring av markørligen. En CMAC negativ kontrollkolonne ble utarbeidet ved å immobilisere cellemembranfragmenter, og uttrykte ikke det målrettede proteinet for å utelukke ikke-spesifikke interaksjoner. Tillegg av 0,2% vandig Gotu kola ekstrakt resulterte i en betydelig reduksjon på 7, 8-DHF oppbevaring, noe som indikerer tilstedeværelsen av konkurrerende ligander for agonist binding området.Mangelen på reduksjon av 7, 8-DHF oppbevaring på CMAC negativ TrkB null kolonne ytterligere bekreftet mangelen på funksjonelle TrkB reseptorer på denne kolonnen. Den manglende toppkromatografitilnærmingen identifiserte en forbindelse som var sterkt beholdt på TrkB-kolonnen, mens den tidlig unngikk TrkB-nullkolonnen, noe som indikerer spesifikk interaksjon. Det er viktig å kjenne din kilde til reseptorer for rask cellulær membran affinitet kromatografi kolonne.Sørg for å sjekke litteraturen for å designe homogeniserings- og solubiliseringsbuffere riktig. Cellulær membranaffinitet kromatografi kolonne utarbeidet i denne protokollen ble brukt til å identifisere nye potensielle narkotika treff og å karakterisere arten av samspillet mellom immobilisert reseptor og dens naturlige ligander.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode for å visualisere og analysere Membran samspill proteiner av transmisjonselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analysering av proteinkinaseaktivitet med radiomerket ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraksjonert ekstraksjonsmetode for den omfattende analysen av metabolitter, lipider og proteiner fra en enkelt prøve

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massespektrometri: En rask Ambient ionisering teknikk å vurdere direkte metabolitter fra anlegget vev

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Borstemmaskin immobilisert metall affinitet Ture, rekonstituering og analysen av en Polyhistidine merket Metalloenzyme for Undergraduate laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi for høy gjennomstrømning påvisning av lav affinitet reseptor-Ligand interaksjoner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rensing av Chloroplast Translocon Protein komplekser hjelp av trykk-koden

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifisering av Inositol fosfat eller Fosfoinositid samspill proteiner av affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller Mass massespektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...