Name: cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00
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A Z.C.A. foi apoiada pelo Conselho de Pesquisa Científica e Tecnológica da Turquia (TUBITAK) 2219- International Postdoctoral Research Fellowship Program. A pesquisa relatada nesta publicação contou com o apoio do Centro Nacional de Medicina Complementar e Integrativa dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio número 1R41AT011716-01. Este trabalho também foi parcialmente apoiado pela American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, a Regis Technologies concedeu a L.C. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Cultura celular das células neuroblastoma SH-SY5Y (linhas celulares TrkB e TrkB-NULL (parental) )
NOTA: As linhas de celular (linha celular SH-SY5Y (TrkB, BR6) e a linha de células parentais SH-SY5Y (TrkB NULL))49,50 foram compradas da Kerafast. As células cultivadas são usadas como fonte dos receptores transmembranos para serem imobilizadas para a preparação de colunas CMAC. As etapas a seguir descrevem como ob...

A identificação de compostos ativos presentes em misturas complexas de metabólitos especializados é uma tarefa muito desafiadora23. Tradicionalmente, compostos individuais são isolados, e sua atividade é testada em diferentes ensaios. Essa abordagem é demorada e cara e muitas vezes leva ao isolamento e identificação dos compostos mais abundantes e bem caracterizados23. Atualmente, os ensaios de triagem de alto rendimento utilizados dependem fortemente da triagem d...

As misturas botânicas são ricas em compostos farmacologicamente ativos1, servindo como uma boa fonte para a identificação de novos hits de drogas e leva 2,3,4,5. A descoberta de novos medicamentos a partir de produtos naturais tem sido uma abordagem frutífera e muitos medicamentos atualmente aprovados originaram-se de compostos identificados pela primeira vez na natureza. A diversidade química de compostos naturais é difícil de ser comparada por bibliotecas feitas pelo homem de moléculas quimicamente sintetizadas. Muitos compostos naturais interagem e modulam alvos de proteína humana e podem ser considerados moléculas evolutivamente otimizadas como drogas6. Estes compostos naturais são particularmente adequados para a identificação de chumbo de drogas para uso em distúrbios neurológicos6. Dois dos medicamentos atualmente aprovados pela FDA para o manejo da doença de Alzheimer (DA) são derivados de alcaloides naturais, a ver: galantamina e rivastigmina (um derivado da fisstigmina)6. L-DOPA, atualmente o medicamento mais comumente prescrito para doença de Parkinson, foi identificado pela primeira vez a partir do feijão largo (Vicia faba L.) 7. Pergolida e lisúride, agonistas receptores dopaminérgicos são os derivados de alcaloides naturais do fungo parasita Claviceps purpurea8. Reserpine, um alcaloide isolado da raiz de cobra indiana (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) foi uma das primeiras drogas antipsicóticas9. Recentemente, a resposta imune disregulada e a inflamação sistêmica têm sido ligadas ao desenvolvimento de inúmeras doenças neurológicas, como transtorno depressivo grave ou doenças neurodegenerativas10. Uma dieta à base de plantas, juntamente com outras intervenções de estilo de vida, tem sido encontrada para melhorar as habilidades cognitivas e funcionais em idosos 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Algumas moléculas eletrofílicas pertencentes a triterpenos e polifenóis foram encontradas para modular respostas inflamatórias nos modelos in vitro e in vivo 12. Por exemplo, compostos naturais contendo carbonilo α.β insaturados (por exemplo, curcumina, cinnamaldeído), ou grupo isothiocyanato (por exemplo, sulforaphane) interfere com a dimerização do receptor-4 (TLR4) que inibe a síntese a jusante de citocinas pró-inflamatórias em uma linha de células pró-B dependentesde maça . Evidências epidemiológicas apontam fortemente que fitoquímicos dietéticos, presentes em matrizes alimentares complexas, também podem constituir uma fonte viável de novas drogas leva6.
Um dos principais obstáculos na identificação de moléculas biologicamente ativas presentes nos extratos vegetais, incluindo alimentos à base de plantas, é a complexidade das amostras investigadas. Tradicionalmente, os compostos individuais são isolados, purificados e posteriormente testados para atividade biológica. Essa abordagem geralmente leva à identificação dos compostos mais abundantes e bem caracterizados. A descoberta de drogas fenotípicas se aproxima sem um alvo molecular definido, depende do fracionamento bioguisticuto de misturas complexas23. Nesta abordagem, um extrato é fracionado em sub frações menos complexas que são posteriormente testadas em ensaios fenotípicos. O isolamento e purificação dos compostos ativos são orientados pela atividade biológica verificada no ensaio. O conhecimento da identidade de um alvo de drogas especificado pode acelerar significativamente a identificação de compostos farmacologicamente ativos presentes em misturas complexas. Essas abordagens são geralmente baseadas na imobilização do alvo molecular, por exemplo, uma enzima, em uma superfície sólida, como as contas magnéticas23. Os alvos imobilizados são posteriormente usados nos experimentos de triagem, resultando no isolamento de compostos interagindo com o alvo. Embora essa abordagem tenha sido amplamente utilizada na identificação de compostos voltados para proteínas citosóicas, tem sido menos comumente aplicada na identificação de produtos químicos interagindo com proteínas transmembranas (TMPs)23. Um desafio adicional na imobilização dos TMPs decorre do fato de que a atividade da proteína depende de sua interação com fosfolipídios de membrana celular e outras moléculas na bicamada, como o colesterol 23,24. É importante preservar essas interações sutis entre proteínas e seu ambiente bicamfato fosfolipídico nativo ao tentar imobilizar o alvo transmembrano.
Na membrana celular a cromatografia de afinidade de membrana (CMAC) fragmentos de membrana celular, e não proteínas purificadas, são imobilizados nas partículas de fase estacionárias da membrana artificial (IAM)23. As fases estacionárias do IAM são preparadas por análogos de fosfatialina em sílica. Recentemente, novas classes de fases estacionárias do IAM foram desenvolvidas nas quais grupos gratuitos de amina e silanol são end-capped (IAM. Computador pessoal. Partículas DD2). Durante as colunas CMAC, fragmentos de membrana celular de preparação são imobilizados na superfície das partículas IAM através de adsorção.
As colunas CMAC têm sido usadas até o momento para imobilizar diferentes classes de TMPs, incluindo canais de íons (por exemplo, receptores nicotínicos), GPCRs (por exemplo, receptores opioides), transportadores de proteínas (por exemplo, p-glicoproteína), etc.24. Os alvos de proteína imobilizada têm sido utilizados na caracterização da farmacodinâmica (por exemplo, constante de dissociação, Kd) ou determinando cinética de ligação (kon e koff) de ligantes de moléculas pequenas interagindo com o alvo, bem como no processo de identificação de potenciais novos cabos de droga presentes em matrizes complexas24 . Aqui apresentamos a preparação das colunas CMAC com o receptor de tropomyosina quinase B (TrkB) imobilizado, que emergiu como um alvo viável para a descoberta de drogas para numerosos distúrbios do sistema nervoso.
Estudos anteriores mostraram que a ativação do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)/TrkB está associada à melhora de certas doenças neurológicas, como DA ou transtorno depressivo grave 25,26,27,28. Foi relatado que os níveis de BDNF e sua expressão receptor TrkB diminuem em AD, e reduções semelhantes prejudicam a função hipocampal em modelos animais de AD29. A diminuição dos níveis de BDNF foi relatada em soro e cérebro de pacientes com DA 30,31,32. A superexpressão de Tau ou hiperfosforilação foram encontradas para diminuir a expressão BDNF em neurônios primários e modelos animais AD 33,34,35. Além disso, foi relatado que o BDNF tem efeitos protetores na neurotoxicidade induzida por β amiloide in vitro e in vivo36. A administração direta de BDNF no cérebro de rato mostrou-se aumentar o aprendizado e a memória em animais com deficiência cognitiva37. BDNF/TrkB emergiu como um alvo válido para amenização de distúrbios neurológicos e psiquiátricos, incluindo28,38 d.C. Direcionar o caminho de sinalização BDNF/TrkB para o desenvolvimento de terapias em DDa potencialmente melhorará nossa compreensão da doença39. Infelizmente, o BDNF em si não pode ser usado como tratamento devido às suas más propriedades farmacocinéticas e aos efeitos colaterais adversos40. Pequenos ativadores de moléculas de vias TrkB/BDNF foram explorados como potenciais ligantes TrkB 41,42,43. Entre os agonistas de pequenas moléculas testados, 7,8-dihidroxyflavone (7,8-DHF), foi mostrado para ativar a via BDNF/TrkB 41,44,45,46. Um derivado de 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-cromne-7,8-diyl bis (metilcarbamate)) está atualmente em consideração como uma possível droga para AD47. Recentemente, foi demonstrado que vários antidepressivos trabalham diretamente ligados ao TrkB e promovendo a sinalização BDNF, enfatizando ainda mais a importância de perseguir o TrkB como um alvo válido para tratar vários distúrbios neurológicos48.
O protocolo descreve o processo de montagem da coluna TrkB funcional e da coluna de controle negativo TrkB-NULL. As colunas são caracterizadas por um produto natural conhecido ligante molecular: 7,8-DHF. Além disso, descrevemos o processo de triagem de matrizes complexas, utilizando como exemplo o extrato vegetal, para a identificação de compostos interagindo com trkB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5446-10 mg</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9204-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-15198-400 &#956;L</td>
			<td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6506-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3795-10 &#956;g</td>
			<td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9224-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid sodium salt</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62050-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-516</td>
			<td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH-9232-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500 mL</td>
			<td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulfate salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8168-100 mL</td>
			<td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &#956;m filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E520-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td>
			<td>Regis Technologies, Inc.</td>
			<td>1-771050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9244-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (10%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978-5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>K812-500 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>0395-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR Life Science Ambreso</td>
			<td>M221-1 mL</td>
			<td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &#181;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-500 mL</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snake skin dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88245</td>
			<td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH VWR Analytical</td>
			<td>BDH9286-2.5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricorn 5/20 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>24-4064-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500 mL</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b

Produtos químicos sintetizados por plantas, fungos, bactérias e invertebrados marinhos têm sido uma rica fonte de novos hits e leads de drogas. Medicamentos como estatinas, penicilina, paclitaxel, rapamicina ou artemisina, comumente utilizados na prática médica, foram primeiramente identificados e isolados de produtos naturais. No entanto, a identificação e isolamento de metabólitos especializados biologicamente ativos de fontes naturais é um processo desafiador e demorado. Tradicionalmente, os metabólitos individuais são isolados e purificados a partir de misturas complexas, após a extração da biomassa. Posteriormente, as moléculas isoladas são testadas em ensaios funcionais para verificar sua atividade biológica. Aqui apresentamos o uso de colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular (CMAC) para identificar compostos biologicamente ativos diretamente de misturas complexas. As colunas CMAC permitem a identificação de compostos interagindo com proteínas transmembrana funcionais imobilizadas (TMPs) incorporadas em seu ambiente bicamador nativo fosfolipídico. Trata-se de uma abordagem direcionada, que requer conhecer o TMP cuja atividade se pretende modular com o recém-identificado candidato a pequenas moléculas. Neste protocolo, apresentamos uma abordagem para preparar colunas CMAC com tropomyosina quinase imobilizada receptor B (TrkB), que emergiu como um alvo viável para a descoberta de drogas para numerosos distúrbios do sistema nervoso. Neste artigo, fornecemos um protocolo detalhado para montar a coluna CMAC com receptores TrkB imobilizados usando linhas celulares neuroblastoma superexpressando receptores TrkB. Apresentamos ainda a abordagem para investigar a funcionalidade da coluna e seu uso na identificação de metabólitos de plantas especializadas interagindo com receptores TrkB.

Seguindo o protocolo, foram montadas duas colunas cromatográficas CMAC: uma com fragmentos imobilizados de membrana celular neuroblastoma SH-SY5Y com TrkB superexpresso e outra com fragmentos de membrana celular SH-SY5Y TrkB-NULL. A coluna CMAC corretamente montada é apresentada na Figura 1 e as etapas envolvidas na imobilização do fragmento de membrana celular são apresentadas na Figura 2.
Desde a imobilização dos receptores T...

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Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

O protocolo descreve a preparação de colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular (CMAC) com fragmentos de membrana celular imobilizada contendo proteínas funcionais do receptor B transmembrano. Também é explicado o uso de colunas CMAC na identificação de metabólitos de plantas especializadas interagindo com esses receptores e presentes em complexas misturas naturais.

Colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular para identificar metabólitos de plantas especializadas interagindo com tropomyosina quinase imobilizada receptor B

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Esta vertical apresenta passos importantes na montagem de colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular com receptores de transmembrano funcionais. Estas colunas podem ser utilizadas para a identificação de pequenas moléculas presentes em extratos complexos e interagindo com receptores transmembrano imobilizados. As colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular aceleram a identificação de compostos biologicamente ativos presentes em misturas complexas.O uso de colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular pode ser de particular interesse para os interessados na identificação de compostos farmacologicamente ativos presentes em matrizes naturais complexas, como extratos vegetais, fúngicos ou bacterianos. Para começar, prepare 200 milimães de benzamidina, dissolvendo 120 de benzamidina em cinco mililitros de água desionizada ultrapura. Prepare uma solução de estoque PMSF de 10 milimões dissolvendo 0,017 gramas de PMSF em 10 mililitros de etanol em um capô de fumaça.Prepare o coquetel inibidor de proteases 100X dissolvendo a mistura inibidora de protease comercialmente disponível em um mililitro de água desionizada ultrapure. Misture bem e alíquota de 200 a 300 microliters do coquetel. Prepare 100 milimilhas de solução de ações ATP dissolvendo 55.114 miligramas de sal de disódio ATP hidratar em um mililitro da água ultrapura ionizada.Misture bem e aliquot 100 microlitres da mistura. Prepare o tampão dissolvendo 3,03 gramas de Tris-HCL, 2,9 gramas de cloreto de sódio, 0,22 gramas de cloreto de cálcio anidro, 0,2 gramas de hexahidrato de cloreto de magnésio e 0,19 gramas de cloreto de potássio em 500 mililitros de água desionizada ultrapurina. Prepare o tampão de homogeneização misturando 17,3 mililitros do tampão Tris com 0,3 mililitros de solução de estoque de benzamidina, 0,2 mililitros de solução de estoque PMSF, 0,2 mililitros de coquetel inibidor de proteases, 20 microliters de solução de estoque ATP, dois mililitros de glicerol e 0,029 gramas de EDTA.Ajuste o pH para 7,4 usando solução de ácido clorídrico. Gire as células colhidas a quatro graus Celsius por cinco minutos a 400 x g e remova o supernasce e lave a pelota de célula restante com 10 mililitros de 1X pH 7,4 PBS gelado. Descarte o supernascimento e adicione 20 mililitros de tampão de homogeneização.Coloque o tubo cônico no gelo. Transfira a suspensão celular para um moedor de tecido homogeneizador Dounce de 40 mililitros, homogeneize a suspensão manualmente no gelo usando 40 derrames de pilão para cima e para baixo. Transfira a suspensão celular homogeneizada em um tubo cônico de 50 mililitros, descarte a pelota e transfira o sobrenante para um novo tubo cônico.Salve a pelota da membrana celular e descarte o supernasce. Prepare o tampão de solubilização misturando 8,7 mililitros da solução tampão com 0,1 mililitros de solução de estoque PMSF, 0,15 mililitros de solução de estoque de benzamidina, 0,1 mililitros de coquetel inibidor de proteases, 10 microliters de solução de estoque ATP, um mililitro de glicerol e 0,2 gramas de controcínola de sódio. Transfira o tampão de solubilização para o tubo cônico com fragmentos de membrana celular.E resuspense a pelota. Gire a mistura resultante a 150 RPM a quatro graus Celsius durante 18 horas. Após 18 horas, centrifugar a mistura de solubilização a quatro graus Celsius por 30 minutos a 47.900 x g.Adicione 100 miligramas de IAM. Computador pessoal. Partículas DD2 para o supernante e gire a mistura de suspensão resultante a 150 RPM a quatro graus Celsius por uma hora. Prepare o tampão de diálise em quatro litros de água desionizada ultrapura adicionando 24 gramas de Tris-HCl, 23,4 gramas de cloreto de sódio, 0,06 gramas de cloreto de cálcio, 5,85 gramas de EDTA e 0,07 gramas de TPM.Dissolver o PMSF primeiro em um pequeno volume de etanol e, em seguida, adicionar lentamente no béquer com o buffer. Corte 10 centímetros de tubo de diálise de membrana de celulose para preparar o tubo de diálise e transfira a suspensão contendo IAM. Computador pessoal. Partículas DD2 e fragmentos de membrana celular no tubo de diálise.Feche as duas extremidades do tubo de diálise com clipes de tubo de diálise. Coloque o tubo de diálise no tampão de diálise. Após 24 horas, coloque a tubulação de diálise no tampão de diálise recém-preparado e a diálise continuada por mais 24 horas.Prepare 10 milimões pH 7.4 tampão de acetato de amônio que será usado para lavar o IAM. Computador pessoal. Partículas DD2 e experimentos de caracterização de colunas dissolvendo 0,778 gramas de acetato de amônio em um litro de água ultrapura deionizada. Após 48 horas de diálise, remova o tubo de diálise do tampão de diálise e transfira o conteúdo do tubo de diálise para um tubo cônico de 15 mililitros.Descarte o supernatante e lave a pelota restante três vezes com 10 mililitros de tampão de acetato de amônio. Após a terceira lavagem, resuspenja a pelota restante em um mililitro de tampão de acetato de amônio. Misture bem e use o chorume resultante para embalar a coluna de vidro 5 x 20 para produzir a coluna de cromatografia CMAC.Para embalar a coluna, coloque um filtro inferior previamente encharcado com tampão de acetato de amônio no suporte do filtro. Coloque o suporte do filtro na coluna de vidro e enrosque a tampa da coluna para fixar a posição do titular. Coloque a coluna verticalmente em um grampo de dedo e fixe-a no suporte do laboratório.Coloque um béquer abaixo da coluna, transfira um pequeno volume do chorume para a coluna de vidro lentamente com uma única pipeta de canal segurando a ponta da pipeta contra a parede da coluna de vidro. Para acelerar o processo de embalagem, remova o tampão de cima da cama estacionária com uma micropipette entre cada passo. Coloque um filtro superior e enrosque a unidade adaptador para que não haja um buffer restante acima da fase estacionária.Fixar a posição da unidade adaptadora com a trava do adaptador. Conecte a coluna a uma bomba de cromatografia líquida de alto desempenho e, para lavar a coluna durante a noite com tampão de acetato de amônio, defina a taxa de fluxo para 0,2 mililitros por minuto. Para maior armazenamento, execute a coluna com solução de azida de sódio de 0,05% em tampão de acetato de amônio, usando um jaleco, óculos de segurança e luvas ao trabalhar com azida de sódio e armazene a quatro graus Celsius.IAM.Computador pessoal. Partículas DD2 com fragmentos de membrana celular TrkB de neuroblastoma imobilizado e na presença de BDNF resultaram em partículas fluorescentes. Nenhuma fluorescência foi observada na membrana de células nulas TrkB encapsuladas partículas IAM ou quando nenhum BDNF foi usado como na membrana celular TrkB encapsulada partículas IAM. Um cromatograma típico de afinidade frontal de 7, 8-DHF funciona de um mililitro, 750 nanomolar, 500 nanomolar e 300 nanomolar aos receptores TrkB imobilizados, que mostraram uma mudança dependente de concentração no tempo de retenção.Uma coluna CMAC não funcional mostrou a falta de concentração de alterações dependentes na retenção do ligante marcador. Uma coluna de controle negativo do CMAC foi preparada pela imobilização de fragmentos de membrana celular, não expressando a proteína alvo para excluir interações não específicas. A adição de extrato de Gotu kola 0,2% aquoso resultou em uma redução significativa da retenção de 7, 8-DHF, indicando a presença de ligantes concorrentes para o local de ligação agonista.A falta de redução da retenção de 7, 8-DHF na coluna nula CMAC negative TrkB confirmou ainda a falta de receptores TrkB funcionais nesta coluna. A abordagem cromatografia de pico ausente identificou um composto fortemente retido na coluna TrkB, enquanto eluvava-se cedo na coluna nula TrkB, indicando interação específica. É crucial saber sua fonte de receptores para uma coluna de cromatografia de afinidade de membrana celular rápida.Certifique-se de verificar a literatura para projetar corretamente buffers de homogeneização e solubilização. A coluna de cromatografia de afinidade de membrana celular preparada neste protocolo foi utilizada para identificar novos potenciais impactos medicamentosos e caracterizar a natureza da interação entre receptor imobilizado e seus ligantes naturais.

Research

JoVE Journal

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