Name: cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Z.C.A. была поддержана Советом по научным и технологическим исследованиям Турции (TUBITAK) 2219 - Международная программа постдокторских исследований. Исследование, о котором сообщается в этой публикации, было поддержано Национальным центром комплементарной и интегративной медицины Национальных институтов здравоохранения под номером 1R41AT011716-01. Эта работа также была частично поддержана грантом Американского общества фармакогнозии, грантом Regis Technologies для Лос-Анджелеса. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

1. Клеточная культура клеток нейробластомы SH-SY5Y (клеточные линии TrkB и TrkB-NULL (родительские))
ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовые линии (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) и SH-SY5Y Родительская клеточная линия (TrkB NULL))49,50 были приобретены у Kerafast. Культивируемые клетки испол...

Идентификация активных соединений, присутствующих в сложных смесях специализированных метаболитов, является очень сложной задачей23. Традиционно выделяют отдельные соединения, а их активность тестируют в разных анализах. Такой подход является трудоемким и дорогостоящим...

Ботанические смеси богаты фармакологически активными соединениями1, служащими хорошим источником для идентификации новых лекарственных хитов и свинец 2,3,4,5. Открытие новых лекарств из натуральных продуктов было плодотворным подходом, и многие одобренные в настоящее время лекарства произошли из соединений, впервые идентифицированных в природе. Химическое разнообразие природных соединений трудно сопоставить с искусственными библиотеками химически синтезированных молекул. Многие природные соединения взаимодействуют и модулируют мишени человеческого белка и могут считаться эволюционно оптимизированными лекарственными молекулами6. Эти природные соединения особенно хорошо подходят для идентификации лекарственного свинца для использования при неврологических расстройствах6. Два из одобренных в настоящее время FDA препаратов для лечения болезни Альцгеймера (БА) получены из природных алкалоидов, а именно: галантамин и ривастигмин (производное физостигмина)6. L-DOPA, в настоящее время наиболее часто назначаемый препарат при болезни Паркинсона, был впервые идентифицирован из широкой фасоли (Vicia faba L.) 7. Перголид и лизурид, агонисты дофаминергических рецепторов являются производными природных алкалоидов спорыньи из паразитического гриба Claviceps purpurea8. Резерпин, алкалоид, выделенный из индийского змеиного корня (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz), был одним из первых антипсихотических препаратов9. В последнее время дисрегулируемый иммунный ответ и системное воспаление были связаны с развитием многочисленных неврологических заболеваний, таких как большое депрессивное расстройство или нейродегенеративные заболевания10. Было обнаружено, что растительная диета вместе с другими вмешательствами в образ жизни улучшает когнитивные и функциональные способности у пожилых людей 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Было обнаружено, что некоторые электрофильные молекулы, принадлежащие тритерпенам и полифенолам, модулируют воспалительные реакции как в моделях in vitro, так и in vivo 12. Например, природные соединения, содержащие α β-ненасыщенного карбона (например, куркумин, циннамальдегид) или изотиоцианатную группу (например, сульфорафан), препятствуют димеризации Toll-подобного рецептора-4 (TLR4), ингибируя последующий синтез провоспалительных цитокинов в мышиной интерлейкин-3-зависимой про-В клеточной линии12,22 . Эпидемиологические данные убедительно указывают на то, что диетические фитохимические вещества, присутствующие в сложных пищевых матрицах, также могут представлять собой жизнеспособный источник новых лекарственных проводов6.
Одним из основных препятствий в идентификации биологически активных молекул, присутствующих в растительных экстрактах, включая растительную пищу, является сложность исследуемых образцов. Традиционно отдельные соединения выделяют, очищают и впоследствии проверяют на биологическую активность. Такой подход обычно приводит к выявлению наиболее распространенных и хорошо охарактеризованных соединений. Подходы к открытию фенотипических лекарств без определенной молекулярной мишени основаны на био-управляемом фракционировании сложных смесей23. При таком подходе экстракт фракционируется на менее сложные субфракции, которые впоследствии тестируются в фенотипических анализах. Выделение и очистка активных соединений определяются биологической активностью, проверенной в анализе. Знание идентичности указанной лекарственной мишени может значительно ускорить идентификацию фармакологически активных соединений, присутствующих в сложных смесях. Эти подходы обычно основаны на иммобилизации молекулярной мишени, например, фермента, на твердой поверхности, такой как магнитные шарики23. Иммобилизованные мишени впоследствии используются в скрининговых экспериментах, что приводит к выделению соединений, взаимодействующих с мишенью. Хотя этот подход широко использовался при идентификации соединений, нацеленных на цитозольные белки, он реже применялся при идентификации химических веществ, взаимодействующих с трансмембранными белками (TMP)23. Дополнительная проблема в иммобилизации TMP связана с тем, что активность белка зависит от его взаимодействия с фосфолипидами клеточной мембраны и другими молекулами в бислое, такими как холестерин23,24. Важно сохранить эти тонкие взаимодействия между белками и их нативной фосфолипидной двухслойной средой при попытке обездвижить трансмембранную мишень.
При сродстве клеточной мембраны (CMAC) фрагменты клеточной мембраны, а не очищенные белки, иммобилизуются на искусственной мембране (IAM) частиц стационарной фазы23. Стационарные фазы IAM получают путем ковалентного связывания аналогов фосфатидилхолина с кремнеземом. В последнее время были разработаны новые классы стационарных фаз IAM, в которых свободные аминные и силаноловые группы являются концевыми (IAM. ПК. Частицы DD2). При подготовке колонок CMAC фрагменты клеточной мембраны иммобилизуются на поверхность частиц IAM путем адсорбции.
Колонки CMAC до настоящего времени использовались для иммобилизации различных классов TMP, включая ионные каналы (например, никотиновые рецепторы), GPCR (например, опиоидные рецепторы), переносчики белка (например, p-гликопротеин) и т.д.24. Иммобилизованные белковые мишени были использованы для характеристики фармакодинамики (например, константа диссоциации, Kd) или определения кинетики связывания (kon и koff) лигандов малых молекул, взаимодействующих с мишенью, а также в процессе идентификации потенциальных новых лекарственных проводов, присутствующих в комплексных матрицах24 . Здесь мы представляем подготовку колонок CMAC с иммобилизованным тропомиозинкиназным рецептором B (TrkB), который стал жизнеспособной мишенью для открытия лекарств для многочисленных расстройств нервной системы.
Предыдущие исследования показали, что активация нейротрофического фактора мозга (BDNF) / пути TrkB связана с улучшением некоторых неврологических заболеваний, таких как AD или большое депрессивное расстройство 25,26,27,28. Сообщалось, что уровни BDNF и экспрессия TrkB рецептора TrkB снижаются при AD, и аналогичные снижения ухудшают функцию гиппокампа на животных моделях AD29. Снижение уровня BDNF было зарегистрировано в сыворотке крови и головном мозге пациентов с БА 30,31,32. Было обнаружено, что сверхэкспрессия тау или гиперфосфорилирование снижают экспрессию BDNF в первичных нейронах и животных моделях AD 33,34,35. Кроме того, сообщалось, что BDNF оказывает защитное воздействие на нейротоксичность in vitro и in vivo36, индуцированную β-амилоидом. Было показано, что прямое введение BDNF в мозг крысы улучшает обучение и память у животных с когнитивными нарушениями37. BDNF / TrkB стал действительной мишенью для улучшения неврологических и психических расстройств, включаяAD 28,38. Нацеливание на сигнальный путь BDNF / TrkB для разработки методов лечения при БА потенциально улучшит наше понимание заболевания39. К сожалению, сам BDNF не может быть использован в качестве лечения из-за его плохих фармакокинетических свойств и неблагоприятных побочных эффектов40. Низкомолекулярные активаторы путей TrkB/BDNF были исследованы в качестве потенциальных лигандов TrkB 41,42,43. Среди протестированных агонистов малых молекул было показано, что 7,8-дигидроксифлавон (7,8-DHF) активирует путь BDNF / TrkB 41,44,45,46. Производное 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-фенил-4H-хромен-7,8-диил-бис(метилкарбамат)) в настоящее время рассматривается в качестве возможного лекарственного средства для AD47. Недавно было показано, что несколько антидепрессантов работают через прямое связывание с TrkB и содействие передаче сигналов BDNF, что еще больше подчеркивает важность использования TrkB в качестве действительной цели для лечения различных неврологических расстройств48.
Протокол описывает процесс сборки функциональной колонки TrkB и отрицательной управляющей колонки TrkB-NULL. Колонки характеризуются использованием известного натурального продукта мелкомолекулярного лиганда: 7,8-DHF. Дополнительно описан процесс скрининга сложных матриц, используя в качестве примера растительный экстракт, для идентификации соединений, взаимодействующих с TrkB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5446-10 mg</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9204-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-15198-400 &#956;L</td>
			<td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6506-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3795-10 &#956;g</td>
			<td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9224-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid sodium salt</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62050-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-516</td>
			<td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH-9232-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500 mL</td>
			<td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulfate salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8168-100 mL</td>
			<td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &#956;m filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E520-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td>
			<td>Regis Technologies, Inc.</td>
			<td>1-771050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9244-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (10%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978-5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>K812-500 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>0395-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR Life Science Ambreso</td>
			<td>M221-1 mL</td>
			<td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &#181;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-500 mL</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snake skin dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88245</td>
			<td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH VWR Analytical</td>
			<td>BDH9286-2.5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricorn 5/20 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>24-4064-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500 mL</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b

Химические вещества, синтезируемые растениями, грибами, бактериями и морскими беспозвоночными, были богатым источником новых лекарственных средств и свинец. Лекарства, такие как статины, пенициллин, паклитаксел, рапамицин или артемизинин, обычно используемые в медицинской практике, были впервые идентифицированы и выделены из натуральных продуктов. Однако идентификация и выделение биологически активных специализированных метаболитов из природных источников является сложным и трудоемким процессом. Традиционно отдельные метаболиты выделяют и очищают от сложных смесей после экстракции биомассы. Впоследствии выделенные молекулы тестируются в функциональных анализах для проверки их биологической активности. Здесь мы представляем использование колонок клеточной мембранной аффинной хроматографии (CMAC) для идентификации биологически активных соединений непосредственно из сложных смесей. Колонки CMAC позволяют идентифицировать соединения, взаимодействующие с иммобилизованными функциональными трансмембранными белками (TMP), встроенными в их нативную фосфолипидную двухслойную среду. Это целенаправленный подход, который требует знания TMP, активность которого предполагается модулировать с недавно идентифицированным кандидатом на низкомолекулярное лекарство. В этом протоколе мы представляем подход к подготовке колонок CMAC с иммобилизованным тропомиозинкиназным рецептором B (TrkB), который стал жизнеспособной мишенью для открытия лекарств для многочисленных расстройств нервной системы. В этой статье мы предоставляем подробный протокол для сборки колонки CMAC с иммобилизованными рецепторами TrkB с использованием клеточных линий нейробластомы, чрезмерно экспрессирующих рецепторы TrkB. Далее представлен подход к исследованию функциональности колонки и ее использование при идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с рецепторами TrkB.

В соответствии с протоколом были собраны две хроматографические колонки CMAC: одна с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны нейробластомы SH-SY5Y с гиперэкспрессированным TrkB и одна с фрагментами клеточной мембраны SH-SY5Y TrkB-NULL. Правильно собранная колонна CMAC представлена <strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Протокол описывает получение колонок клеточной мембранно-аффинной хроматографии (CMAC) с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны, содержащими функциональные трансмембранные тропомиозинкиназные рецепторы В-белки. Также объясняется использование колонок CMAC для идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с этими рецепторами и присутствующих в сложных природных смесях.

Колонки клеточной мембранной аффинности хроматографии для идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с иммобилизованным рецептором тропомиозинкиназы B

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Эта вертикаль представляет собой важные этапы в сборке хроматографических колонок сродства клеточной мембраны с функциональными трансмембранными рецепторами. Эти колонки могут быть использованы для идентификации малых молекул, присутствующих в сложных экстрактах и взаимодействующих с иммобилизованными трансмембранными рецепторами. Колонки клеточной мембранной хроматографии ускоряют идентификацию биологически активных соединений, присутствующих в сложных смесях.Использование колонок хроматографии сродства клеточной мембраны может представлять особый интерес для тех, кто заинтересован в идентификации фармакологически активных соединений, присутствующих в сложных природных матрицах, таких как растительные, грибковые или бактериальные экстракты. Для начала приготовьте 200 миллимолярных растворов бензамидина, растворив 120 бензамидина в пяти миллилитрах сверхчистой деионизированной воды. Приготовьте 10-миллимолярный раствор PMSF, растворив 0,017 г PMSF в 10 миллилитрах этанола в вытяжке.Приготовьте коктейль ингибиторов протеаз 100X, растворив коммерчески доступную смесь ингибиторов протеазы в одном миллилитре сверхчистой деионизированной воды. Тщательно перемешать и аликвотировать от 200 до 300 микролитров коктейля. Готовят 100 миллимолярных спиртовых растворов АТФ, растворяя 55,114 миллиграммов гидрата динатриевой соли АТФ в одном миллилитре ионизированной сверхчистой воды.Тщательно перемешать и аликвотировать 100 микролитров смеси. Приготовьте буфер, растворив 3,03 г Tris-HCL, 2,9 г хлорида натрия, 0,22 г безводного хлорида кальция, 0,2 г гексагидрата хлорида магния и 0,19 г хлорида калия в 500 миллилитрах сверхчистой деионизированной воды. Готовят буфер гомогенизации путем смешивания 17,3 миллилитра буфера Триса с 0,3 миллилитрами раствора бензамидина, 0,2 миллилитрами раствора PMSF, 0,2 миллилитрами коктейля ингибитора протеаз, 20 микролитрами раствора АТФ, двумя миллилитрами глицерина и 0,029 г ЭДТА.Отрегулируйте рН до 7,4 с помощью раствора соляной кислоты. Открутите клетки, собранные при четырех градусах Цельсия, в течение пяти минут при 400 х г и удалите супернатант и промыте оставшуюся ячейку гранулы 10 миллилитрами 1X рН 7,4 ледяного холода PBS. Отбросьте супернатант и добавьте 20 миллилитров буфера гомогенизации.Поместите коническую трубку на лед. Перенесите клеточную суспензию в 40-миллилитровый гомогенизатор ткани Dounce, гомогенизируйте суспензию вручную на льду, используя 40 ударов пестика вверх и вниз. Перенесите гомогенизированную клеточную суспензию в коническую трубку объемом 50 миллилитров, выбросьте гранулу и перенесите супернатант в новую коническую трубку.Сохраните гранулу клеточной мембраны и выбросьте супернатант. Готовят солюбилизационный буфер путем смешивания 8,7 миллилитра буферного раствора с 0,1 миллилитрами раствора PMSF, 0,15 миллилитрами раствора бензамидина, 0,1 миллилитрами коктейля ингибитора протеаз, 10 микролитрами раствора АТФ, одним миллилитрами глицерина и 0,2 г холата натрия. Перенесите буфер солюбилизации в коническую трубку с фрагментами клеточной мембраны.И повторно суспендировать гранулу. Вращайте полученную смесь со скоростью 150 оборотов в минуту при четырех градусах Цельсия в течение 18 часов. Через 18 часов центрифугируют солюбилизационную смесь при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут при 47 900 х г.Добавьте 100 миллиграммов IAM. ПК. Частицы DD2 относят к надосадочному веществу и вращают полученную суспензионную смесь со скоростью 150 об/мин при четырех градусах Цельсия в течение одного часа. Приготовьте диализный буфер в четырех литрах сверхчистой деионизированной воды, добавив 24 грамма Tris-HCl, 23,4 г хлорида натрия, 0,06 г хлорида кальция, 5,85 г ЭДТА и 0,07 г PMSF.Растворите PMSF сначала в небольшом объеме этанола, а затем медленно добавьте в стакан с буфером. Отрежьте 10 сантиметров диализной трубки целлюлозной мембраны, чтобы подготовить диализную трубку, и перенесите суспензию, содержащую IAM. ПК. Частицы DD2 и фрагменты клеточной мембраны попадают в диализную трубку.Закройте оба конца диализной трубки зажимами диализных трубок. Поместите диализную трубку в диализный буфер. Через 24 часа поместите диализную трубку в свежеприготовленный диализный буфер и продолжайте диализ еще 24 часа.Приготовьте 10 миллимоляров pH 7,4 аммонатного ацетатного буфера, который будет использоваться для промывки IAM. ПК. Частицы DD2 и эксперименты по характеристике колонн путем растворения 0,778 грамма ацетата аммония в одном литре сверхчистой деионизированной воды. После 48 часов диализа извлеките диализную трубку из диализного буфера и перенесите содержимое диализной трубки в коническую трубку объемом 15 миллилитров.Откажитесь от супернатанта и трижды промойте оставшуюся гранулу 10 миллилитрами буфера ацетата аммония. После третьей промывки повторно суспендируют оставшуюся гранулу в одном миллилитре буфера ацетата аммония. Тщательно перемешайте его и используйте полученную суспензию, чтобы упаковать стеклянную колонку 5 x 20, чтобы получить колонку хроматографии CMAC.Чтобы упаковать колонну, поместите нижний фильтр, предварительно пропитанный буфером ацетата аммония, в фильтродержатель. Установите фильтродержатель в стеклянную колонну и прикрутите крышку колонны, чтобы закрепить положение держателя. Поместите колонну вертикально в зажим для пальцев и закрепите ее на лабораторной подставке.Поместите стакан под колонну, медленно переложите небольшой объем суспензии в стеклянную колонну с помощью одноканального пипетки, удерживающего наконечник пипетки у стенки стеклянной колонны. Чтобы ускорить процесс упаковки, снимите буфер сверху неподвижного слоя с помощью микропипетки между каждым шагом. Поместите верхний фильтр и прикрутите адаптер так, чтобы над неподвижной фазой не оставалось буфера.Закрепите положение адаптера с помощью замка адаптера. Подключите колонну к высокоэффективному жидкостному хроматографическому насосу, а для промывки колонны на ночь буфером ацетата аммония установите скорость потока на уровне 0,2 миллилитра в минуту. Для более длительного хранения запустите колонну с 0,05% раствором азида натрия в буфере ацетата аммония, надев лабораторный халат, защитные очки и перчатки при работе с азидом натрия и храните при четырех градусах Цельсия.ПК. Частицы DD2 с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны TrkB нейробластомы и в присутствии BDNF приводили к образованию флуоресцентных частиц. Флуоресценция не наблюдалась в инкапсулированных частицами IAM нулевой клеточной мембраны TrkB или когда не использовался BDNF, как в инкапсулированных частицами IAM клеточной мембраны TrkB. Показана функциональная CMAC-колонка типичной фронтальной аффинной хроматограммы увеличения 7, 8-DHF концентраций одного миллимоляра, 750 наномоляра, 500 наномоляра и 300 наномоляра к иммобилизованным рецепторам TrkB, что показало зависящее от концентрации изменение времени удержания.Нефункциональная колонка CMAC показала отсутствие зависящих от концентрации изменений в удержании маркерного лиганда. Отрицательный контрольный столбец CMAC был получен путем иммобилизации фрагментов клеточной мембраны, не экспрессируя целевой белок, чтобы исключить неспецифические взаимодействия. Добавление 0,2% водного экстракта Готу кола приводило к значительному снижению удержания 7, 8-DHF, что указывает на наличие конкурирующих лигандов для сайта связывания агонистов.Отсутствие снижения удержания 7, 8-DHF на нулевом столбце CMAC отрицательного TrkB дополнительно подтвердило отсутствие функциональных рецепторов TrkB на этом столбце. Отсутствующий подход пиковой хроматографии идентифицировал соединение, сильно сохранившееся в колонке TrkB, в то время как элюирование на ранней стадии нулевого столбца TrkB, что указывает на специфическое взаимодействие. Очень важно знать свой источник рецепторов для колонок хроматографии быстрого сродства клеточной мембраны.Обязательно проверьте литературу, чтобы правильно спроектировать буферы гомогенизации и солюбилизации. Колонка клеточной мембранной хроматографии, подготовленная в этом протоколе, была использована для выявления новых потенциальных попаданий препарата и для характеристики характера взаимодействия между иммобилизованным рецептором и его естественными лигандами.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Метод визуализации и анализа Мембранные белков, взаимодействующих с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Анализ активности протеинкиназы с радиоактивно меченым АТФ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Простой фракционированный метод экстракции для комплексного анализа метаболитов, липидов и белков из одного образца

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Масс-спектрометрия спрей лист: Быстрое окружающего ионизации техника непосредственно оценить метаболитов из растительных тканей

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop иммобилизованных металла аффинной хроматографии, воссоздание и меткой, Assay Polyhistidine Metalloenzyme для студентов лаборатории

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Очищение сродства хлоропласта Translocon белковых комплексов с помощью тега крана

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Идентификация фосфата инозитола или фосфонинозидных взаимодействующих белков по хроматографии Affinity в сочетании с Западной погреловой или масс-спектрометрией

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...