Name: cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Z.C.A. fue apoyado por el Consejo de Investigación Científica y Tecnológica de Turquía (TUBITAK) 2219- Programa Internacional de Becas de Investigación Postdoctoral. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Centro Nacional de Medicina Complementaria e Integrativa de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio 1R41AT011716-01. Este trabajo también fue parcialmente apoyado por la American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, regis Technologies grant to L.C. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Cultivo celular de células de neuroblastoma SH-SY5Y (líneas celulares TrkB y TrkB-NULL (parentales))
NOTA: Las líneas celulares (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) y SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 fueron compradas a Kerafast. Las células cultivadas se utilizan como fuente de los receptores transmembrana a inmovilizar para la preparación de columnas CMAC. Los siguientes pasos describen cómo obtener fragm...

La identificación de compuestos activos presentes en mezclas complejas de metabolitos especializados es una tarea muy desafiante23. Tradicionalmente, los compuestos individuales se aíslan y su actividad se prueba en diferentes ensayos. Este enfoque requiere mucho tiempo y es costoso y a menudo conduce al aislamiento y la identificación de los compuestos más abundantes y bien caracterizados23. Los ensayos de cribado de alto rendimiento utilizados actualmente dependen en...

Las mezclas botánicas son ricas en compuestos farmacológicamente activos1, sirviendo como una buena fuente para la identificación de nuevos fármacos golpea y conduce 2,3,4,5. El descubrimiento de nuevos medicamentos a partir de productos naturales ha sido un enfoque fructífero y muchos medicamentos actualmente aprobados se originaron a partir de compuestos identificados por primera vez en la naturaleza. La diversidad química de los compuestos naturales es difícil de igualar por las bibliotecas artificiales de moléculas sintetizadas químicamente. Muchos compuestos naturales interactúan y modulan los objetivos de proteínas humanas y pueden considerarse moléculas similares a fármacos optimizadas evolutivamente6. Estos compuestos naturales son particularmente adecuados para la identificación de plomo de fármacos para su uso en trastornos neurológicos6. Dos de los medicamentos actualmente aprobados por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) se derivan de alcaloides naturales, a saber: galantamina y rivastigmina (un derivado de la fisostigmina)6. L-DOPA, actualmente el medicamento más comúnmente recetado para la enfermedad de Parkinson, se identificó por primera vez a partir del frijol ancho (Vicia faba L.) 7. Pergolida y lisurida, agonistas del receptor dopaminérgico son los derivados de los alcaloides naturales del cornezuelo de centeno del hongo parásito Claviceps purpurea8. La reserpina, un alcaloide aislado de la raíz de serpiente india (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) fue uno de los primeros fármacos antipsicóticos9. Recientemente, la respuesta inmune desregulada y la inflamación sistémica se han relacionado con el desarrollo de numerosas dolencias neurológicas, como el trastorno depresivo mayor o las enfermedades neurodegenerativas10. Se ha encontrado que una dieta basada en plantas junto con otras intervenciones de estilo de vida mejora las capacidades cognitivas y funcionales en los ancianos 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Se ha encontrado que ciertas moléculas electrofílicas pertenecientes a triterpenos y polifenoles modulan las respuestas inflamatorias tanto en modelos in vitro como in vivo 12. Por ejemplo, los compuestos naturales que contienen α,β carbonilo insaturado (por ejemplo, curcumina, cinamaldehído) o grupo isotiocianato (por ejemplo, sulforafano) interfieren con la dimerización del receptor Toll-4 (TLR4) que inhibe la síntesis aguas abajo de citoquinas proinflamatorias en una línea celular pro-B dependiente de interleucina-3 murina12,22 . La evidencia epidemiológica apunta fuertemente a que los fitoquímicos dietéticos, presentes en matrices alimentarias complejas, también pueden constituir una fuente viable de nuevos fármacos6.
Uno de los principales obstáculos en la identificación de moléculas biológicamente activas presentes en los extractos de plantas, incluidos los alimentos de origen vegetal, es la complejidad de las muestras investigadas. Tradicionalmente, los compuestos individuales se aíslan, purifican y posteriormente se prueban para la actividad biológica. Este enfoque generalmente conduce a la identificación de los compuestos más abundantes y bien caracterizados. Los enfoques de descubrimiento de fármacos fenotípicos sin una diana molecular definida se basan en el fraccionamiento bioguiado de mezclas complejas23. En este enfoque, un extracto se fracciona en subfracciones menos complejas que posteriormente se prueban en ensayos fenotípicos. El aislamiento y la purificación de los compuestos activos se guían por la actividad biológica verificada en el ensayo. El conocimiento de la identidad de un objetivo farmacológico específico puede acelerar significativamente la identificación de compuestos farmacológicamente activos presentes en mezclas complejas. Esos enfoques generalmente se basan en la inmovilización del objetivo molecular, por ejemplo, una enzima, en una superficie sólida, como las perlas magnéticas23. Los objetivos inmovilizados se utilizan posteriormente en los experimentos de detección, lo que resulta en el aislamiento de compuestos que interactúan con el objetivo. Si bien este enfoque se ha utilizado ampliamente en la identificación de compuestos dirigidos a proteínas citosólicas, se ha aplicado con menos frecuencia en la identificación de sustancias químicas que interactúan con proteínas transmembrana (TMP)23. Un desafío adicional en la inmovilización de TMP se deriva del hecho de que la actividad de la proteína depende de su interacción con fosfolípidos de membrana celular y otras moléculas en la bicapa como el colesterol23,24. Es importante preservar estas interacciones sutiles entre las proteínas y su entorno de bicapa de fosfolípidos nativos cuando se intenta inmovilizar el objetivo transmembrana.
En la cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) los fragmentos de membrana celular, y no las proteínas purificadas, se inmovilizan en las partículas de fase estacionaria de membrana artificial (IAM)23. Las fases estacionarias de IAM se preparan uniendo covalentemente análogos de fosfatidilcolina a sílice. Recientemente se han desarrollado nuevas clases de fases estacionarias de IAM en las que los grupos de amina libre y silanol tienen un límite final (IAM. PC. Partículas DD2). Durante la preparación de las columnas CMAC, los fragmentos de membrana celular se inmovilizan en la superficie de las partículas de IAM a través de la adsorción.
Las columnas de CMAC se han utilizado hasta la fecha para inmovilizar diferentes clases de TMP, incluidos los canales iónicos (por ejemplo, receptores nicotínicos), GPCR (por ejemplo, receptores opioides), transportadores de proteínas (por ejemplo, p-glicoproteína), etc.24. Las dianas proteicas inmovilizadas se han utilizado en la caracterización de la farmacodinámica (por ejemplo, constante de disociación, Kd) o en la determinación de la cinética de unión (kon y koff) de ligandos de moléculas pequeñas que interactúan con el objetivo, así como en el proceso de identificación de posibles nuevas derivaciones farmacológicas presentes en matrices complejas24 . Aquí presentamos la preparación de columnas CMAC con el receptor inmovilizado de tropomiosina quinasa B (TrkB), que ha surgido como un objetivo viable para el descubrimiento de fármacos para numerosos trastornos del sistema nervioso.
Estudios previos demostraron que la activación de la vía del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)/TrkB se asocia con la mejoría de ciertas dolencias neurológicas, como la EA o el trastorno depresivo mayor 25,26,27,28. Se informó que los niveles de BDNF y su receptor TrkB de expresión disminuyen en la EA, y reducciones similares perjudican la función del hipocampo en modelos animales de AD29. Se notificó disminución de los niveles de BDNF en suero y cerebro de pacientes con EA 30,31,32. Se encontró que la sobreexpresión de Tau o la hiperfosforilación regulan a la baja la expresión de BDNF en neuronas primarias y modelos animales de EA 33,34,35. Además, se informó que el BDNF tiene efectos protectores sobre la neurotoxicidad inducida por β-amiloide in vitro e in vivo36. Se demostró que la administración directa de BDNF en el cerebro de la rata aumenta el aprendizaje y la memoria en animales con deterioro cognitivo37. BDNF / TrkB surgió como un objetivo válido para mejorar los trastornos neurológicos y psiquiátricos, incluido el28,38 d.C. Dirigirse a la vía de señalización BDNF / TrkB para el desarrollo de terapias en la EA mejorará potencialmente nuestra comprensión de la enfermedad39. Desafortunadamente, el BDNF en sí no se puede usar como tratamiento debido a sus pobres propiedades farmacocinéticas y efectos secundarios adversos40. Se han explorado activadores de moléculas pequeñas de las vías TrkB/BDNF como ligandos TrkB potenciales 41,42,43. Entre los agonistas de moléculas pequeñas probados, se ha demostrado que la 7,8-dihidroxiflavona (7,8-DHF) activa la vía BDNF/TrkB 41,44,45,46. Un derivado de 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-cromona-7,8-diil bis(metilcarbamato)) está actualmente bajo consideración como un posible fármaco para la EA47. Recientemente, se demostró que varios antidepresivos funcionan a través de la unión directa a TrkB y la promoción de la señalización bdNF, enfatizando aún más la importancia de perseguir TrkB como un objetivo válido para tratar diversos trastornos neurológicos48.
El protocolo describe el proceso de ensamblaje de la columna TrkB funcional y la columna de control negativo TrkB-NULL. Las columnas se caracterizan utilizando un conocido ligando de pequeño molecular de producto natural: 7,8-DHF. Además, describimos el proceso de cribado de matrices complejas, utilizando extracto de planta como ejemplo, para la identificación de compuestos que interactúan con TrkB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5446-10 mg</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9204-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-15198-400 &#956;L</td>
			<td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6506-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3795-10 &#956;g</td>
			<td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9224-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid sodium salt</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62050-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-516</td>
			<td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH-9232-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500 mL</td>
			<td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulfate salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8168-100 mL</td>
			<td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &#956;m filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E520-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td>
			<td>Regis Technologies, Inc.</td>
			<td>1-771050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9244-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (10%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978-5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>K812-500 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>0395-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR Life Science Ambreso</td>
			<td>M221-1 mL</td>
			<td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &#181;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-500 mL</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snake skin dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88245</td>
			<td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH VWR Analytical</td>
			<td>BDH9286-2.5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricorn 5/20 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>24-4064-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500 mL</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b

Los productos químicos sintetizados por plantas, hongos, bacterias e invertebrados marinos han sido una rica fuente de nuevos golpes y plomos de drogas. Medicamentos como las estatinas, la penicilina, el paclitaxel, la rapamicina o la artemisinina, comúnmente utilizados en la práctica médica, se han identificado y aislado por primera vez de productos naturales. Sin embargo, la identificación y el aislamiento de metabolitos especializados biológicamente activos de fuentes naturales es un proceso desafiante y lento. Tradicionalmente, los metabolitos individuales se aíslan y purifican a partir de mezclas complejas, después de la extracción de biomasa. Posteriormente, las moléculas aisladas se prueban en ensayos funcionales para verificar su actividad biológica. Aquí presentamos el uso de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) para identificar compuestos biológicamente activos directamente a partir de mezclas complejas. Las columnas CMAC permiten la identificación de compuestos que interactúan con proteínas transmembrana funcionales inmovilizadas (TMP) incrustadas en su entorno de bicapa de fosfolípidos nativos. Este es un enfoque dirigido, que requiere conocer el TMP cuya actividad se pretende modular con el candidato a fármaco de molécula pequeña recientemente identificado. En este protocolo, presentamos un enfoque para preparar columnas de CMAC con el receptor de tropomiosina quinasa B (TrkB) inmovilizado, que se ha convertido en un objetivo viable para el descubrimiento de fármacos para numerosos trastornos del sistema nervioso. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado para ensamblar la columna CMAC con receptores TrkB inmovilizados utilizando líneas celulares de neuroblastoma que sobreexpresan los receptores TrkB. Además, presentamos el enfoque para investigar la funcionalidad de la columna y su uso en la identificación de metabolitos especializados de plantas que interactúan con los receptores TrkB.

Siguiendo el protocolo, se ensamblaron dos columnas cromatográficas CMAC: una con los fragmentos de membrana celular de neuroblastoma SH-SY5Y inmovilizados con TrkB sobreexpresado y otra con fragmentos de membrana celular SH-SY5Y TrkB-NULL. La columna CMAC correctamente ensamblada se presenta en la Figura 1 y los pasos involucrados en la inmovilización de fragmentos de membrana celular se presentan en la Figura 2.
Desde la inmoviliz...

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Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

El protocolo describe la preparación de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) con fragmentos de membrana celular inmovilizados que contienen proteínas funcionales del receptor B de tropomiosina quinasa transmembrana. También se explica el uso de columnas de CMAC en la identificación de metabolitos vegetales especializados que interactúan con estos receptores y están presentes en mezclas naturales complejas.

Columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular para identificar metabolitos especializados de plantas que interactúan con el receptor B inmovilizado de tropomiosina quinasa

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Esta vertical presenta pasos importantes en el montaje de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular con receptores transmembrana funcionales. Estas columnas se pueden utilizar para la identificación de pequeñas moléculas presentes en extractos complejos e interactuando con receptores transmembrana inmovilizados. Las columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular aceleran la identificación de compuestos biológicamente activos presentes en mezclas complejas.El uso de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular puede ser de particular interés para aquellos interesados en la identificación de compuestos farmacológicamente activos presentes en matrices naturales complejas, como extractos de plantas, hongos o bacterias. Para comenzar, prepare una solución madre de benzamidina de 200 milimolares disolviendo 120 de benzamidina en cinco mililitros de agua desionizada ultrapura. Prepare una solución madre de PMSF de 10 milimolares disolviendo 0.017 gramos de PMSF en 10 mililitros de etanol en una campana de humos.Prepare el cóctel inhibidor de proteasas 100X disolviendo la mezcla de inhibidores de proteasa disponibles comercialmente en un mililitro de agua desionizada ultrapura. Mezclar bien y alícuota de 200 a 300 microlitros del cóctel. Prepare una solución madre de ATP de 100 milimolares disolviendo 55.114 miligramos de hidrato de sal disódica de ATP en un mililitro del agua ultrapura ionizada.Mezclar bien y alícuota 100 microlitros de la mezcla. Prepare el tampón disolviendo 3.03 gramos de Tris-HCL, 2.9 gramos de cloruro de sodio, 0.22 gramos de cloruro de calcio anhidro, 0.2 gramos de cloruro de magnesio hexahidratado y 0.19 gramos de cloruro de potasio en 500 mililitros de agua ultrapura desionizada. Prepare el tampón de homogeneización mezclando 17,3 mililitros del tampón Tris con 0,3 mililitros de solución madre de benzamidina, 0,2 mililitros de solución madre de PMSF, 0,2 mililitros de cóctel inhibidor de proteasas, 20 microlitros de solución madre de ATP, dos mililitros de glicerol y 0,029 gramos de EDTA.Ajuste el pH a 7.4 usando solución de ácido clorhídrico. Gire hacia abajo las células cosechadas a cuatro grados Celsius durante cinco minutos a 400 x g y retire el sobrenadante y lave el pellet celular restante con 10 mililitros de PBS helado de 1X pH 7.4. Deseche el sobrenadante y agregue 20 mililitros de tampón de homogeneización.Coloque el tubo cónico sobre hielo. Transfiera la suspensión celular a una amoladora de tejido homogeneizador Dounce de 40 mililitros, homogeneice la suspensión manualmente en hielo utilizando 40 golpes de mortero hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión celular homogeneizada a un tubo cónico de 50 mililitros, deseche el pellet y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico.Guarde el pellet de membrana celular y deseche el sobrenadante. Prepare el tampón de solubilización mezclando 8,7 mililitros de la solución tampón con 0,1 mililitros de solución madre de PMSF, 0,15 mililitros de solución madre de benzamidina, 0,1 mililitros de cóctel inhibidor de proteasas, 10 microlitros de solución madre de ATP, un mililitro de glicerol y 0,2 gramos de colato de sodio. Transfiera el tampón de solubilización al tubo cónico con fragmentos de membrana celular.Y resuspendir el pellet. Gire la mezcla resultante a 150 RPM a cuatro grados Centígrados durante 18 horas. Después de 18 horas, centrífuga la mezcla de solubilización a cuatro grados Celsius durante 30 minutos a 47, 900 x g.Agregue 100 miligramos de IAM. PC. Partículas DD2 al sobrenadante y girar la mezcla de suspensión resultante a 150 RPM a cuatro grados centígrados durante una hora. Prepare el tampón de diálisis en cuatro litros de agua desionizada ultrapura agregando 24 gramos de Tris-HCl, 23.4 gramos de cloruro de sodio, 0.06 gramos de cloruro de calcio, 5.85 gramos de EDTA y 0.07 gramos de PMSF.Disuelva la PMSF primero en un pequeño volumen de etanol y luego agregue lentamente al vaso de precipitados con el tampón. Corte 10 centímetros de tubo de diálisis de membrana de celulosa para preparar el tubo de diálisis y transfiera la suspensión que contiene IAM. PC. Partículas DD2 y fragmentos de membrana celular en el tubo de diálisis.Cierre ambos extremos del tubo de diálisis con clips de tubo de diálisis. Coloque el tubo de diálisis en el tampón de diálisis. Después de 24 horas, coloque el tubo de diálisis en el tampón de diálisis recién preparado y continúe la diálisis durante otras 24 horas.Prepare un tampón de acetato de amonio de 10 milimolares pH 7.4 que se utilizará para lavar el IAM. PC. Partículas DD2 y experimentos de caracterización en columna disolviendo 0,778 gramos de acetato de amonio en un litro de agua ultrapura desionizada. Después de 48 horas de diálisis, retire el tubo de diálisis del tampón de diálisis y transfiera el contenido del tubo de diálisis a un tubo cónico de 15 mililitros.Deseche el sobrenadante y lave el pellet restante tres veces con 10 mililitros de tampón de acetato de amonio. Después del tercer lavado, vuelva a suspender el pellet restante en un mililitro de tampón de acetato de amonio. Mézclelo bien y use la suspensión resultante para empacar la columna de vidrio de 5 x 20 para producir la columna de cromatografía CMAC.Para empacar la columna, coloque un filtro inferior previamente empapado con tampón de acetato de amonio en el soporte del filtro. Coloque el soporte del filtro en la columna de vidrio y atornille la tapa de la columna para asegurar la posición del soporte. Coloque la columna verticalmente en una abrazadera para los dedos y asegúrela en el soporte de laboratorio.Coloque un vaso de precipitados debajo de la columna, transfiera un pequeño volumen de la suspensión a la columna de vidrio lentamente con un pipete de un solo canal que sostenga la punta de la pipeta contra la pared de la columna de vidrio. Para acelerar el proceso de embalaje, retire el búfer de arriba del lecho estacionario con una micropipeta entre cada paso. Coloque un filtro superior y atornille la unidad adaptadora para que no quede un búfer por encima de la fase estacionaria.Asegure la posición de la unidad adaptadora con el bloqueo del adaptador. Conecte la columna a una bomba de cromatografía líquida de alto rendimiento y, para lavar la columna durante la noche con un tampón de acetato de amonio, ajuste el caudal a 0,2 mililitros por minuto. Para un almacenamiento más prolongado, ejecute la columna con una solución de azida de sodio al 0,05% en tampón de acetato de amonio, usando una bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes cuando trabaje con azida de sodio y guárdela a cuatro grados Celsius.IAM.PC. Las partículas DD2 con fragmentos de membrana celular de neuroblastoma TrkB inmovilizados y en presencia de BDNF dieron lugar a partículas fluorescentes. No se observó fluorescencia en las partículas de IAM encapsuladas en la membrana celular nula de TrkB o cuando no se utilizó BDNF como en las partículas de IAM encapsuladas en la membrana celular de TrkB. Se muestra un cromatograma de afinidad frontal típico de columnas CMAC funcionales de concentraciones crecientes de 7, 8-DHF de un milimolar, 750 nanomolar, 500 nanomolar y 300 nanomolares a los receptores TrkB inmovilizados, que mostraron un cambio dependiente de la concentración en el tiempo de retención.Una columna CMAC no funcional mostró la falta de cambios dependientes de la concentración en la retención del ligando marcador. Se preparó una columna de control negativo de CMAC inmovilizando fragmentos de membrana celular, no expresando la proteína objetivo para descartar interacciones no específicas. La adición de extracto acuoso de centella asiática de Centu al 0,2% resultó en una reducción significativa de la retención de 7, 8-DHF, lo que indica la presencia de ligandos competidores para el sitio de unión agonista.La falta de reducción de la retención de 7, 8-DHF en la columna nula TrkB CMAC negativa confirmó aún más la falta de receptores TrkB funcionales en esta columna. El enfoque de cromatografía de pico faltante identificó un compuesto fuertemente retenido en la columna TrkB, mientras que eluía temprano en la columna nula TrkB, lo que indica una interacción específica. Es crucial conocer su fuente de receptores para la columna de cromatografía de afinidad de membrana celular rápida.Asegúrese de revisar la literatura para diseñar adecuadamente los tampones de homogeneización y solubilización. La columna de cromatografía de afinidad de membrana celular preparada en este protocolo se utilizó para identificar nuevos impactos potenciales de fármacos y para caracterizar la naturaleza de la interacción entre el receptor inmovilizado y sus ligandos naturales.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Investigación

Bioquímica

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Identificación de fosfato de inositol o proteínas que interactúan con fosfoinositida por cromatografía de afinidad acoplada a Western Blot o espectrometría de masas

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