Name: cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Z.C.A. stöddes av Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2219- International Postdoctoral Research Fellowship Program. Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes av National Center for Complimentary and Integrative Medicine vid National Institutes of Health under prisnummer 1R41AT011716-01. Detta arbete stöddes också delvis av American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, Regis Technologies bidrag till L.C. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.

1. Cellodling av SH-SY5Y neuroblastomceller (TrkB och TrkB-NULL (föräldra) cellinjer)
OBS: Cellinjer (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) och SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 köptes från Kerafast. Odlade celler används som en källa till transmembranreceptorerna som ska immobiliseras för framställning av CMAC-kolumner. Följande steg beskriver hur man får cellmembranfragment och monterar funktionella CMAC-k...

Identifiering av aktiva föreningar som finns i komplexa blandningar av specialiserade metaboliter är en mycket utmanande uppgift23. Traditionellt isoleras enskilda föreningar och deras aktivitet testas i olika analyser. Detta tillvägagångssätt är tidskrävande och kostsamt och leder ofta till isolering och identifiering av de vanligaste och väl karakteriserade föreningarna23. Screeninganalyser som för närvarande används med hög kapacitet är starkt beroende av...

Botaniska blandningar är rika på farmakologiskt aktiva föreningar1, som fungerar som en bra källa för identifiering av nya läkemedelsträffar och leder 2,3,4,5. Upptäckten av nya läkemedel från naturprodukter har varit ett fruktbart tillvägagångssätt och många för närvarande godkända läkemedel härstammar från föreningar som först identifierades i naturen. Den kemiska mångfalden av naturliga föreningar är svår att matcha av konstgjorda bibliotek av kemiskt syntetiserade molekyler. Många naturliga föreningar interagerar med och modulerar mänskliga proteinmål och kan betraktas som evolutionärt optimerade läkemedelsliknande molekyler6. Dessa naturliga föreningar är särskilt väl lämpade för läkemedelsledaridentifiering för användning vid neurologiska störningar6. Två av de för närvarande FDA-godkända läkemedlen för hantering av Alzheimers sjukdom (AD) härrör från naturliga alkaloider, nämligen: galantamin och rivastigmin (ett derivat av fysostigmin)6. L-DOPA, för närvarande det vanligaste förskrivna läkemedlet för Parkinsons sjukdom, identifierades först från den breda bönan (Vicia faba L.) 7. Pergolid och lisurid, dopaminerga receptoragonister är derivat av naturliga ergotalkaloider från parasitsvampen Claviceps purpurea8. Reserpin, en alkaloid isolerad från indisk ormrot (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) var ett av de första antipsykotiska läkemedlen9. Nyligen har dysreglerat immunsvar och systemisk inflammation kopplats till utvecklingen av många neurologiska sjukdomar, såsom egentlig depression eller neurodegenerativa sjukdomar10. En växtbaserad kost tillsammans med andra livsstilsinterventioner har visat sig förbättra kognitiva och funktionella förmågor hos äldre 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Vissa elektrofila molekyler som tillhör triterpener och polyfenoler har visat sig modulera inflammatoriska svar i både in vitro- och in vivo-modeller 12. Till exempel stör naturliga föreningar som innehåller α,β-omättad karbonyl (t.ex. curcumin, kanelaldehyd) eller isotiocyanatgrupp (t.ex. sulforafan) Toll-liknande receptor-4 (TLR4) dimerisering som hämmar nedströmssyntesen av proinflammatoriska cytokiner i en murin interleukin-3 beroende pro-B-cellinje12,22 . Epidemiologiska bevis pekar starkt på att fytokemikalier i kosten, som finns i komplexa livsmedelsmatriser, också kan utgöra en livskraftig källa till nya läkemedelsledningar6.
Ett av de största hindren för identifiering av biologiskt aktiva molekyler som finns i växtextrakt, inklusive växtbaserad mat, är komplexiteten hos de undersökta proverna. Traditionellt isoleras, renas de enskilda föreningarna och testas därefter för biologisk aktivitet. Detta tillvägagångssätt leder vanligtvis till identifiering av de mest rikliga och väl karakteriserade föreningarna. Fenotypiska läkemedelsupptäcktsmetoder utan ett definierat molekylärt mål förlitar sig på biostyrd fraktionering av komplexa blandningar23. I detta tillvägagångssätt fraktioneras ett extrakt i mindre komplexa delfraktioner som därefter testas i fenotypiska analyser. Isoleringen och reningen av aktiva föreningar styrs av biologisk aktivitet verifierad i analysen. Kunskapen om identiteten hos ett specificerat läkemedelsmål kan avsevärt påskynda identifieringen av farmakologiskt aktiva föreningar som finns i komplexa blandningar. Dessa tillvägagångssätt är vanligtvis baserade på immobilisering av det molekylära målet, till exempel ett enzym, på en fast yta, som magnetiska pärlor23. De immobiliserade målen används därefter i screeningexperimenten vilket resulterar i isolering av föreningar som interagerar med målet. Även om detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning vid identifiering av föreningar som riktar sig mot cytosoliska proteiner, har det varit mindre vanligt vid identifiering av kemikalier som interagerar med transmembranproteiner (TMP)23. En ytterligare utmaning i immobiliseringen av TMP härrör från det faktum att proteinets aktivitet beror på dess interaktion med cellmembranfosfolipider och andra molekyler i dubbelskiktet, såsom kolesterol23,24. Det är viktigt att bevara dessa subtila interaktioner mellan proteiner och deras inhemska fosfolipid dubbelskiktsmiljö när man försöker immobilisera transmembranmålet.
I cellulär membranaffinitetskromatografi (CMAC) är cellmembranfragment, och inte renade proteiner, immobiliserade på det artificiella membranet (IAM) stationära faspartiklar23. IAM stationära faser framställs genom kovalent bindning av fosfatidylkolinanaloger på kiseldioxid. Nyligen har nya klasser av IAM stationära faser utvecklats där fria amin- och silanolgrupper är sluttäckta (IAM. Persondator. DD2-partiklar). Under CMAC-kolonner förbereds cellmembranfragment på ytan av IAM-partiklar genom adsorption.
CMAC-kolumner har hittills använts för att immobilisera olika klasser av TMP inklusive jonkanaler (t.ex. nikotinreceptorer), GPCR (t.ex. opioidreceptorer), proteintransportörer (t.ex. p-glykoprotein), etc.24. De immobiliserade proteinmålen har använts vid karakterisering av farmakodynamik (t.ex. dissociationskonstant, Kd) eller bestämning av bindningskinetik (kpå och kav) av småmolekylära ligander som interagerar med målet samt i processen att identifiera potentiella nya läkemedelsledningar som finns i komplexa matriser24 . Här presenterar vi beredningen av CMAC-kolumner med den immobiliserade tropomyosinkinasreceptorn B (TrkB), som har framstått som ett livskraftigt mål för läkemedelsupptäckt för många nervsystemet.
Tidigare studier visade att aktiveringen av den hjärnhärledda neurotrofiska faktorn (BDNF) / TrkB-vägen är associerad med förbättring av vissa neurologiska sjukdomar, såsom AD eller egentlig depression 25,26,27,28. Det rapporterades att BDNF-nivåerna och dess receptor TrkB-uttryck minskar i AD, och liknande minskningar försämrar hippocampusfunktionen i djurmodeller av AD29. Minskade nivåer av BDNF rapporterades i serum och hjärna hos AD-patienter 30,31,32. Tau-överuttryck eller hyperfosforylering visade sig nedreglera BDNF-uttryck i primära neuroner och AD-djurmodeller 33,34,35. Dessutom rapporterades BDNF ha skyddande effekter på β-amyloidinducerad neurotoxicitet in vitro och in vivo36. Direkt administrering av BDNF i råtthjärnan visade sig öka inlärning och minne hos kognitivt nedsatta djur37. BDNF/TrkB framstod som ett giltigt mål för att förbättra neurologiska och psykiatriska störningar inklusive AD 28,38. Att rikta in sig på BDNF/ TrkB-signalvägen för utveckling av terapier i AD kommer potentiellt att öka vår förståelse av sjukdomen39. Tyvärr kan BDNF i sig inte användas som behandling på grund av dess dåliga farmakokinetiska egenskaper och negativa biverkningar40. Småmolekylaktivatorer av TrkB/ BDNF-vägar har undersökts som potentiella TrkB-ligander 41,42,43. Bland testade småmolekylära agonister har 7,8-dihydroxiflavon (7,8-DHF) visat sig aktivera BDNF/TrkB-vägen 41,44,45,46. Ett derivat av 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenyl-4H-kromen-7,8-diyl bis(metylkarbamat)) övervägs för närvarande som ett möjligt läkemedel för AD47. Nyligen visades det att flera antidepressiva medel fungerar genom direkt bindning till TrkB och främjande av BDNF-signalering, vilket ytterligare betonar vikten av att driva TrkB som ett giltigt mål för att behandla olika neurologiska störningar48.
Protokollet beskriver processen för montering av funktionell TrkB-kolumn och TrkB-NULL negativ kontrollkolonn. Kolonnerna karakteriseras med användning av en känd naturlig produkt småmolekylär ligand: 7,8-DHF. Dessutom beskriver vi processen för screening av komplexa matriser, med hjälp av växtextrakt som ett exempel, för identifiering av föreningar som interagerar med TrkB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5446-10 mg</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9204-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-15198-400 &#956;L</td>
			<td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6506-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3795-10 &#956;g</td>
			<td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9224-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid sodium salt</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62050-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-516</td>
			<td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH-9232-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500 mL</td>
			<td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulfate salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8168-100 mL</td>
			<td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &#956;m filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E520-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td>
			<td>Regis Technologies, Inc.</td>
			<td>1-771050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9244-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (10%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978-5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>K812-500 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>0395-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR Life Science Ambreso</td>
			<td>M221-1 mL</td>
			<td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &#181;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-500 mL</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snake skin dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88245</td>
			<td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH VWR Analytical</td>
			<td>BDH9286-2.5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricorn 5/20 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>24-4064-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500 mL</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b

Kemikalier som syntetiseras av växter, svampar, bakterier och marina ryggradslösa djur har varit en rik källa till nya läkemedelsträffar och ledningar. Läkemedel såsom statiner, penicillin, paklitaxel, rapamycin, eller artemisinin, vanligen används i medicinsk praxis, har först identifierats och isolerats från naturliga produkter. Identifiering och isolering av biologiskt aktiva specialiserade metaboliter från naturliga källor är dock en utmanande och tidskrävande process. Traditionellt isoleras och renas enskilda metaboliter från komplexa blandningar efter extraktion av biomassa. Därefter testas de isolerade molekylerna i funktionella analyser för att verifiera deras biologiska aktivitet. Här presenterar vi användningen av cellulära membranaffinitetskromatografikolonner (CMAC) för att identifiera biologiskt aktiva föreningar direkt från komplexa blandningar. CMAC-kolumner möjliggör identifiering av föreningar som interagerar med immobiliserade funktionella transmembranproteiner (TMP) inbäddade i deras ursprungliga fosfolipid-dubbelskiktsmiljö. Detta är ett målinriktat tillvägagångssätt, vilket kräver att man känner till TMP vars aktivitet man avser att modulera med den nyligen identifierade småmolekylära läkemedelskandidaten. I detta protokoll presenterar vi ett tillvägagångssätt för att förbereda CMAC-kolumner med immobiliserad tropomyosinkinasreceptor B (TrkB), som har framstått som ett livskraftigt mål för läkemedelsupptäckt för många nervsystemet. I den här artikeln tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att montera CMAC-kolonnen med immobiliserade TrkB-receptorer med hjälp av neuroblastomcellinjer som överuttrycker TrkB-receptorer. Vi presenterar vidare tillvägagångssättet för att undersöka kolonnens funktionalitet och dess användning vid identifiering av specialiserade växtmetaboliter som interagerar med TrkB-receptorer.

Efter protokollet monterades två CMAC-kromatografiska kolumner: en med de immobiliserade SH-SY5Y-neuroblastomcellmembranfragmenten med överuttryckt TrkB och en med SH-SY5Y TrkB-NULL-cellmembranfragment. Den korrekt monterade CMAC-kolonnen presenteras i figur 1 och stegen som är involverade i immobilisering av cellmembranfragment presenteras i figur 2.
Sedan immobiliseringen av TrkB-receptorer på IAM. Persondator. DD2-kromatografis...

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Protokollet beskriver beredningen av cellmembranaffinitetskromatografikolonner (CMAC) med immobiliserade cellmembranfragment innehållande funktionella transmembrantropomyosinkinasreceptor B-proteiner. Användningen av CMAC-kolumner vid identifiering av specialiserade växtmetaboliter som interagerar med dessa receptorer och närvarande i komplexa naturliga blandningar förklaras också.

Cellulära membranaffinitetskromatografikolonner för att identifiera specialiserade växtmetaboliter som interagerar med immobiliserad tromboyosinkinasreceptor B

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Denna vertikal presenterar viktiga steg för att sätta ihop cellmembranaffinitetskromatografikolonner med funktionella transmembranreceptorer. Dessa kolumner kan användas för identifiering av små molekyler som finns i komplexa extrakt och interagerar med immobiliserade transmembranreceptorer. Cellulära membranaffinitetskromatografikolonner påskyndar identifieringen av biologiskt aktiva föreningar närvarande i komplexa blandningar.Användningen av cellulära membranaffinitetskromatografikolonner kan vara av särskilt intresse för dem som är intresserade av identifiering av farmakologiskt aktiva föreningar närvarande i komplexa naturliga matriser, såsom växt-, svamp- eller bakterieextrakt. För att börja, förbered 200 millimolar bensamidin stamlösning genom att lösa 120 bensamidin i fem milliliter ultrarent avjoniserat vatten. Förbered en 10 millimolär PMSF-stamlösning genom att lösa upp 0,017 gram PMSF i 10 ml etanol i en dragskåp.Förbered 100X proteashämmare cocktail genom att lösa upp kommersiellt tillgänglig proteashämmare blandning i en milliliter ultrarent avjoniserat vatten. Blanda noggrant och alikvotera 200 till 300 mikroliter av cocktailen. Förbered 100 millimolär ATP-stamlösning genom att lösa upp 55,114 milligram ATP-dinatriumsalthydrat i en milliliter av det joniserade ultrarena vattnet.Blanda noggrant och alikvotera 100 mikroliter av blandningen. Förbered bufferten genom att lösa upp 3,03 gram Tris-HCL, 2,9 gram natriumklorid, 0,22 gram vattenfri kalciumklorid, 0,2 gram magnesiumkloridhexahydrat och 0,19 gram kaliumklorid i 500 ml ultrarent avjoniserat vatten. Förbered homogeniseringsbufferten genom att blanda 17,3 ml av Tris-bufferten med 0,3 ml bensamidinlösning, 0,2 ml PMSF-stamlösning, 0,2 ml proteashämmarecocktail, 20 mikroliter ATP-stamlösning, två milliliter glycerol och 0,029 gram EDTA.Justera pH till 7,4 med saltsyralösning. Snurra ner cellerna som skördats vid fyra grader Celsius i fem minuter vid 400 x g och ta bort supernatanten och tvätta den återstående cellpelleten med 10 ml 1X pH 7,4 iskall PBS. Kassera supernatanten och tillsätt 20 ml homogeniseringsbuffert.Placera det koniska röret på is. Överför cellsuspensionen till en 40 ml Dounce homogenisatorvävnadskvarn, homogenisera suspensionen manuellt på is med 40 upp och ner stötslag. Överför homogeniserad cellsuspension till ett 50 ml koniskt rör, kassera pelleten och överför supernatanten till ett nytt koniskt rör.Spara cellmembranpelleten och kassera supernatanten. Förbered solubiliseringsbufferten genom att blanda 8,7 ml av buffertlösningen med 0,1 ml PMSF-stamlösning, 0,15 ml bensamidinlösning, 0,1 ml proteashämmarecocktail, 10 mikroliter ATP-stamlösning, en milliliter glycerol och 0,2 gram natriumkolat. Överför solubiliseringsbufferten till det koniska röret med cellmembranfragment.Och återsuspendera pelleten. Rotera den resulterande blandningen vid 150 rpm vid fyra grader Celsius i 18 timmar. Efter 18 timmar centrifugerar du solubiliseringsblandningen vid fyra grader Celsius i 30 minuter vid 47 900 x g.Tillsätt 100 milligram IAM. Persondator. DD2-partiklar till supernatanten och rotera den resulterande suspensionsblandningen vid 150 rpm vid fyra grader Celsius i en timme. Förbered dialysbufferten i fyra liter ultrarent avjoniserat vatten genom att tillsätta 24 gram Tris-HCl, 23,4 gram natriumklorid, 0,06 gram kalciumklorid, 5,85 gram EDTA och 0,07 gram PMSF.Lös först upp PMSF i en liten volym etanol och tillsätt sedan långsamt i bägaren med bufferten. Skär 10 centimeter cellulosamembrandialysslang för att förbereda dialysröret och överför suspensionen som innehåller IAM. Persondator. DD2-partiklar och cellmembranfragment i dialysröret.Stäng båda ändarna av dialysröret med dialysslangklämmor. Placera dialysröret i dialysbufferten. Efter 24 timmar placerar du dialysslangen i den nyberedda dialysbufferten och fortsätter dialysen i ytterligare 24 timmar.Förbered 10 millimolar pH 7,4 ammoniumacetatbuffert som kommer att användas för att tvätta IAM. Persondator. DD2-partiklar och i kolonnkarakteriseringsexperiment genom att lösa upp 0,778 gram ammoniumacetat i en liter ultrarent avjoniserat vatten. Efter 48 timmars dialys, ta bort dialysröret från dialysbufferten och överför innehållet i dialysröret till ett 15 ml koniskt rör.Kassera supernatanten och tvätta den återstående pelleten tre gånger med 10 ml ammoniumacetatbuffert. Efter den tredje tvätten, återsuspendera den återstående pelleten i en milliliter ammoniumacetatbuffert. Blanda den noggrant och använd den resulterande uppslamningen för att packa 5 x 20 glaskolonnen för att ge CMAC-kromatografikolonnen.För att packa kolonnen, placera ett bottenfilter som tidigare blötläggts med ammoniumacetatbuffert i filterhållaren. Montera filterhållaren i glaskolonnen och skruva fast pelarlocket för att säkra hållarens position. Placera kolonnen vertikalt i en fingerklämma och säkra den i labbstativet.Placera en bägare under kolonnen, överför en liten volym av flytgödseln långsamt till glaskolonnen med en enkanals pipetter som håller pipettspetsen mot glaskolonnväggen. För att påskynda förpackningsprocessen, ta bort bufferten ovanför den stationära sängen med en mikropipett mellan varje steg. Placera ett toppfilter och skruva fast adapterenheten så att det inte finns någon kvarvarande buffert ovanför den stationära fasen.Säkra adapterenhetens position med adapterlåset. Anslut kolonnen till en högpresterande vätskekromatografipump och för att tvätta kolonnen över natten med ammoniumacetatbuffert, ställ in flödeshastigheten till 0,2 ml per minut. För längre lagring, kör kolonnen med 0,05% natriumazidlösning i ammoniumacetatbuffert, bär en labbrock, skyddsglasögon och handskar när du arbetar med natriumazid och förvara vid fyra grader Celsius.IAM.Persondator. DD2-partiklar med immobiliserat neuroblastom TrkB-cellmembranfragment och i närvaro av BDNF resulterade i fluorescerande partiklar. Ingen fluorescens observerades i TrkB-nollcellsmembran inkapslade IAM-partiklar eller när ingen BDNF användes som i TrkB-cellmembran inkapslade IAM-partiklar. Ett funktionellt CMAC-kolonner typiskt frontal affinitetskromatogram med ökande 7, 8-DHF-koncentrationer av en millimolär, 750 nanomolär, 500 nanomolär och 300 nanomolar till de immobiliserade TrkB-receptorerna visas, vilket visade en koncentrationsberoende förändring i retentionstid.En icke-funktionell CMAC-kolumn visade bristen på koncentrationsberoende förändringar i retentionen av markörliganden. En CMAC-negativ kontrollkolonn framställdes genom att immobilisera cellmembranfragment, vilket inte uttryckte det riktade proteinet för att utesluta icke-specifika interaktioner. Tillsatsen av 0,2% vattenhaltigt Gotu kola-extrakt resulterade i en signifikant minskning av 7, 8-DHF-retention, vilket indikerar närvaron av konkurrerande ligander för agonistbindningsstället.Bristen på reduktion av 7, 8-DHF-retention på CMAC-negativ TrkB-nollkolonn bekräftade ytterligare bristen på funktionella TrkB-receptorer på denna kolumn. Den saknade toppkromatografimetoden identifierade en förening som starkt behölls på TrkB-kolonnen, medan den eluerade tidigt TrkB-nollkolonnen, vilket indikerar specifik interaktion. Det är viktigt att känna till din källa till receptorer för snabb cellulär membranaffinitetskromatografikolonn.Se till att kontrollera litteraturen för att korrekt utforma homogeniserings- och solubiliseringsbuffertar. Cellulär membranaffinitetskromatografikolonn framställd i detta protokoll användes för att identifiera nya potentiella läkemedelsträffar och för att karakterisera arten av interaktionen mellan immobiliserad receptor och dess naturliga ligander.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metod för att visualisera och analysera membraninteragerande proteiner genom transmissionselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analys av proteinkinasaktivitet med radiomärkt ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraktionerad extraktionsmetod för den omfattande analysen av metaboliter, lipider och proteiner från en enda prov

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray masspektrometri: En snabb omgivande jonisering teknik för att direkt bedöma metaboliter från växt vävnader

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Bänkmonterade orörlig metall affinitetskromatografi, beredning och analys av en Polyhistidine Taggad Metalloenzyme för grundutbildning laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulära Protein Mikroarrayteknik för hög genomströmning upptäckt av låg affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rening av kloroplast Translocon proteinkomplex med taggen TAP

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifiering av inositol fosfat eller fosfoinositid samverkande proteiner genom affinitetskromatografi kopplad till Western blot eller masspektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...