Name: cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Z.C.A., Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) 2219- Uluslararası Doktora Sonrası Araştırma Burs Programı tarafından desteklenmiştir. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Ücretsiz ve Bütünleştirici Tıp Merkezi tarafından 1R41AT011716-01 ödül numarası altında desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Amerikan Farmakognozi Araştırma Başlangıç Hibesi Derneği, Regis Technologies tarafından L.C.'ye hibe olarak kısmen desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

1. SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinin hücre kültürü (TrkB ve TrkB-NULL (ebeveyn) hücre hatları)
NOT: Kerafast'tan hücre hatları (SH-SY5Y Hücre Hattı (TrkB, BR6) ve SH-SY5Y Ebeveyn Hücre Hattı (TrkB NULL))49,50 adet satın alınmıştır. Kültürlenmiş hücreler, CMAC kolonlarının hazırlanmasında immobilize edilecek transmembran reseptörlerinin kaynağı olarak kullanılır. Aşağıdaki adımlarda, hü...

Özel metabolitlerin karmaşık karışımlarında bulunan aktif bileşiklerin tanımlanması çok zor bir görevdir23. Geleneksel olarak, bireysel bileşikler izole edilir ve aktiviteleri farklı tahlillerde test edilir. Bu yaklaşım zaman alıcı ve maliyetlidir ve genellikle en bol ve iyi karakterize edilen bileşiklerin izolasyonuna ve tanımlanmasına yol açar23. Şu anda kullanılan yüksek verimli tarama testleri, halihazırda bilinen hedeflere sahip kombinatoryal...

Botanik karışımlar, farmakolojik olarak aktif bileşikler1 bakımından zengindir ve yeni ilaç isabetlerinin tanımlanması için iyi bir kaynak görevi görür ve 2,3,4,5'e yol açar. Doğal ürünlerden yeni ilaçların keşfi verimli bir yaklaşım olmuştur ve şu anda onaylanmış birçok ilaç, ilk olarak doğada tanımlanan bileşiklerden kaynaklanmaktadır. Doğal bileşiklerin kimyasal çeşitliliğinin, kimyasal olarak sentezlenmiş moleküllerin insan yapımı kütüphaneleri ile eşleştirilmesi zordur. Birçok doğal bileşik, insan protein hedefleriyle etkileşime girer ve modüle eder ve evrimsel olarak optimize edilmiş ilaç benzeri moleküller olarak düşünülebilir6. Bu doğal bileşikler, nörolojik bozukluklarda kullanılmak üzere ilaç kurşun tanımlaması için özellikle uygundur6. Alzheimer hastalığının (AD) yönetimi için şu anda FDA onaylı ilaçlardan ikisi doğal alkaloitlerden türetilmiştir, yani: galantamin ve rivastigmin (fizikostigmin türevi)6. Şu anda Parkinson hastalığı için en sık reçete edilen ilaç olan L-DOPA, ilk olarak geniş fasulyeden (Vicia faba L.) tanımlanmıştır. 7. Pergolid ve lisürid, dopaminerjik reseptör agonistleri, parazitik mantar Claviceps purpurea8'den doğal ergot alkaloidlerinin türevleridir. Hint yılan kökünden izole edilmiş bir alkaloid olan Reserpin (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) ilk antipsikotik ilaçlardan biriydi9. Son zamanlarda, düzensiz immün yanıt ve sistemik inflamasyon, majör depresif bozukluk veya nörodejeneratif hastalıklar gibi çok sayıda nörolojik rahatsızlığın gelişimi ile ilişkilendirilmiştir10. Diğer yaşam tarzı müdahaleleriyle birlikte bitki bazlı bir diyetin yaşlılarda bilişsel ve işlevsel yetenekleri geliştirdiği bulunmuştur 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Triterpenlere ve polifenollere ait bazı elektrofilik moleküllerin hem in vitro hem de in vivo modellerde inflamatuar yanıtları modüle ettiği bulunmuştur12. Örneğin, α.β doymamış karbonil (örneğin, kurkumin, sinnamaldehit) veya izotiyosiyanat grubu (örneğin, sülforafan) içeren doğal bileşikler, murin interlökin-3 bağımlı pro-B hücre hattında pro-inflamatuar sitokinlerin aşağı akış sentezini inhibe eden Toll benzeri reseptör-4 (TLR4) dimerizasyonuna müdahale eder12,22 . Epidemiyolojik kanıtlar, karmaşık gıda matrislerinde bulunan diyet fitokimyasallarının da yeni ilaç kurşunlarının uygulanabilir bir kaynağını oluşturabileceğini güçlü bir şekilde göstermektedir6.
Bitki bazlı gıdalar da dahil olmak üzere bitki özlerinde bulunan biyolojik olarak aktif moleküllerin tanımlanmasındaki en büyük engellerden biri, araştırılan örneklerin karmaşıklığıdır. Geleneksel olarak, bireysel bileşikler izole edilir, saflaştırılır ve daha sonra biyolojik aktivite için test edilir. Bu yaklaşım genellikle en bol ve iyi karakterize edilen bileşiklerin tanımlanmasına yol açar. Tanımlanmış bir moleküler hedef olmadan fenotipik ilaç keşif yaklaşımları, karmaşık karışımların biyo-kılavuzlu fraksiyonasyonuna dayanır23. Bu yaklaşımda, bir ekstrakt, daha sonra fenotipik tahlillerde test edilen daha az karmaşık alt fraksiyonlara bölünür. Aktif bileşiklerin izolasyonu ve saflaştırılması, tahlilde doğrulanan biyolojik aktivite tarafından yönlendirilir. Belirli bir ilaç hedefinin kimliğinin bilinmesi, karmaşık karışımlarda bulunan farmakolojik olarak aktif bileşiklerin tanımlanmasını önemli ölçüde hızlandırabilir. Bu yaklaşımlar genellikle moleküler hedefin, örneğin bir enzimin, manyetik boncuklar gibi katı bir yüzeyde immobilizasyonuna dayanır23. Hareketsiz hedefler daha sonra tarama deneylerinde kullanılır ve hedef ile etkileşime giren bileşiklerin izolasyonu ile sonuçlanır. Bu yaklaşım, sitozolik proteinleri hedef alan bileşiklerin tanımlanmasında yaygın olarak kullanılmasına rağmen, transmembran proteinleri (TMP'ler) ile etkileşime giren kimyasalların tanımlanmasında daha az yaygın olarak uygulanmıştır.23. TMP'lerin immobilizasyonundaki ek bir zorluk, proteinin aktivitesinin hücre zarı fosfolipitleri ve kolesterol23,24 gibi çift katmandaki diğer moleküllerle etkileşimine bağlı olmasından kaynaklanmaktadır. Transmembran hedefini hareketsiz hale getirmeye çalışırken proteinler ve doğal fosfolipid çift katmanlı ortamları arasındaki bu ince etkileşimleri korumak önemlidir.
Hücresel membran afinite kromatografisinde (CMAC) hücre zarı fragmanları ve saflaştırılmış proteinler değil, yapay membran (IAM) sabit faz parçacıkları23 üzerinde hareketsiz hale getirilir. IAM durağan fazları, fosfatidilkolin analoglarının silika üzerine kovalent olarak bağlanmasıyla hazırlanır. Son zamanlarda, serbest amin ve silanol gruplarının uçtan kapatıldığı yeni IAM durağan faz sınıfları geliştirilmiştir (IAM. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları). CMAC kolonları sırasında hücre zarı fragmanları hazırlanması, adsorpsiyon yoluyla IAM parçacıklarının yüzeyine hareketsiz hale getirilir.
CMAC sütunları, iyon kanalları (örneğin, nikotinik reseptörler), GPCR'ler (örneğin, opioid reseptörleri), protein taşıyıcıları (örneğin, p-glikoprotein) vb. dahil olmak üzere farklı TMP sınıflarını immobilize etmek için bugüne kadar kullanılmıştır. İmmobilize protein hedefleri, farmakodinamiklerin karakterizasyonunda (örneğin, ayrışma sabiti, Kd) veya hedefle etkileşime giren küçük moleküllü ligandların bağlanma kinetiğinin (kaçık ve kkapalı) belirlenmesinde ve ayrıca karmaşık matrislerde bulunan potansiyel yeni ilaç uçlarının tanımlanması sürecinde kullanılmıştır24 . Burada, çok sayıda sinir sistemi bozukluğu için ilaç keşfi için uygun bir hedef olarak ortaya çıkan immobilize tropomiyozin kinaz reseptörü B (TrkB) ile CMAC kolonlarının hazırlanması sunulmaktadır.
Önceki çalışmalar, beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) / TrkB yolunun aktivasyonunun, AD veya majör depresif bozukluk25,26,27,28 gibi bazı nörolojik rahatsızlıkların iyileşmesi ile ilişkili olduğunu göstermiştir. BDNF düzeylerinin ve reseptör TrkB ekspresyonunun AD'de azaldığı, benzer azalmaların MS29 hayvan modellerinde hipokampal fonksiyonu bozduğu bildirilmiştir. AD hastalarının serum ve beyninde BDNF düzeylerinde azalma bildirilmiştir30,31,32. Tau aşırı ekspresyonu veya hiperfosforilasyonun, primer nöronlarda BDNF ekspresyonunu aşağı regüle ettiği ve AD hayvan modellerinde33,34,35 olduğu bulunmuştur. Ek olarak, BDNF'nin β-amiloid kaynaklı nörotoksisite in vitro ve in vivo36 üzerinde koruyucu etkileri olduğu bildirilmiştir. Sıçan beynine doğrudan BDNF uygulanmasının bilişsel olarak bozulmuş hayvanlarda öğrenme ve hafızayı arttırdığı gösterilmiştir37. BDNF/TrkB, AD28,38 dahil olmak üzere nörolojik ve psikiyatrik bozuklukların iyileştirilmesinde geçerli bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. AD'de tedavilerin geliştirilmesi için BDNF / TrkB sinyal yolunu hedeflemek, potansiyel olarak hastalık hakkındaki anlayışımızı geliştirecektir39. Ne yazık ki, BDNF'nin kendisi zayıf farmakokinetik özellikleri ve olumsuz yan etkileri nedeniyle bir tedavi olarak kullanılamaz40. TrkB/BDNF yolaklarının küçük molekül aktivatörleri potansiyel TrkB ligandları 41,42,43 olarak araştırılmıştır. Test edilen küçük molekül agonistleri arasında, 7,8-dihidroksiflavonun (7,8-DHF), BDNF / TrkB yolunu41,44,45,46 aktive ettiği gösterilmiştir. 7,8-DHF'nin bir türevi (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-kromen-7,8-diyl bis (metilkarbamat)) şu anda AD47 için olası bir ilaç olarak değerlendirilmektedir. Son zamanlarda, birkaç antidepresanın TrkB'ye doğrudan bağlanarak ve BDNF sinyallemesini teşvik ederek çalıştığı ve TrkB'yi çeşitli nörolojik bozuklukları tedavi etmek için geçerli bir hedef olarak takip etmenin önemini vurguladığı gösterilmiştir48.
Protokol, işlevsel TrkB sütunu ve TrkB-NULL negatif kontrol sütununun birleştirilmesi işlemini açıklar. Kolonlar, bilinen bir doğal ürün küçük-moleküler ligand kullanılarak karakterize edilir: 7,8-DHF. Ek olarak, TrkB ile etkileşime giren bileşiklerin tanımlanması için bitki ekstraktını örnek olarak kullanarak karmaşık matrislerin taranması sürecini açıklıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5446-10 mg</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9204-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-15198-400 &#956;L</td>
			<td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6506-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3795-10 &#956;g</td>
			<td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9224-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid sodium salt</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62050-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-516</td>
			<td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH-9232-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500 mL</td>
			<td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulfate salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8168-100 mL</td>
			<td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &#956;m filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E520-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td>
			<td>Regis Technologies, Inc.</td>
			<td>1-771050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9244-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (10%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978-5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>K812-500 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>0395-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR Life Science Ambreso</td>
			<td>M221-1 mL</td>
			<td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &#181;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-500 mL</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snake skin dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88245</td>
			<td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH VWR Analytical</td>
			<td>BDH9286-2.5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricorn 5/20 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>24-4064-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500 mL</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b

Bitkiler, mantarlar, bakteriler ve deniz omurgasızları tarafından sentezlenen kimyasallar, yeni ilaç isabetleri ve kurşunları için zengin bir kaynak olmuştur. Tıbbi uygulamada yaygın olarak kullanılan statinler, penisilin, paklitaksel, rapamisin veya artemisinin gibi ilaçlar ilk önce tanımlanmış ve doğal ürünlerden izole edilmiştir. Bununla birlikte, biyolojik olarak aktif uzmanlaşmış metabolitlerin doğal kaynaklardan tanımlanması ve izole edilmesi zorlu ve zaman alıcı bir süreçtir. Geleneksel olarak, bireysel metabolitler, biyokütlenin ekstraksiyonunu takiben karmaşık karışımlardan izole edilir ve saflaştırılır. Daha sonra, izole moleküller biyolojik aktivitelerini doğrulamak için fonksiyonel testlerde test edilir. Burada, biyolojik olarak aktif bileşikleri doğrudan karmaşık karışımlardan tanımlamak için hücresel membran afinite kromatografisi (CMAC) sütunlarının kullanımını sunuyoruz. CMAC sütunları, doğal fosfolipid çift katmanlı ortamlarına gömülü immobilize fonksiyonel transmembran proteinleri (TMP'ler) ile etkileşime giren bileşiklerin tanımlanmasına izin verir. Bu, aktivitesi yeni tanımlanan küçük moleküllü ilaç adayı ile modüle etmeyi amaçlayan TMP'yi bilmeyi gerektiren hedefli bir yaklaşımdır. Bu protokolde, çok sayıda sinir sistemi bozukluğu için ilaç keşfi için uygun bir hedef olarak ortaya çıkan immobilize tropomiyozin kinaz reseptörü B (TrkB) ile CMAC kolonlarının hazırlanmasına yönelik bir yaklaşım sunuyoruz. Bu makalede, CMAC kolonunu, TrkB reseptörlerini aşırı eksprese eden nöroblastom hücre hatları kullanılarak immobilize TrkB reseptörleri ile birleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, kolonun işlevselliğini ve TrkB reseptörleriyle etkileşime giren özel bitki metabolitlerinin tanımlanmasında kullanımını araştırmak için yaklaşımı sunuyoruz.

Protokolü takiben, iki CMAC kromatografik kolon birleştirildi: biri aşırı eksprese TrkB ile immobilize SH-SY5Y nöroblastom hücre zarı fragmanları ve diğeri SH-SY5Y TrkB-NULL hücre zarı fragmanları ile. Doğru şekilde monte edilmiş CMAC sütunu Şekil 1'de sunulmuştur ve hücre zarı fragmanı immobilizasyonunda yer alan adımlar Şekil 2'de sunulmuştur.
TrkB reseptörlerinin IAM üzerindeki immobilizasyonundan bu yana...

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Protokol, fonksiyonel transmembran tropomiyozin kinaz reseptörü B proteinlerini içeren immobilize hücre zarı fragmanları ile hücre zarı afinite kromatografisi (CMAC) kolonlarının hazırlanmasını açıklar. CMAC kolonlarının, bu reseptörlerle etkileşime giren ve karmaşık doğal karışımlarda bulunan özel bitki metabolitlerinin tanımlanmasında kullanımı da açıklanmaktadır.

İmmobilize Tropomiyozin Kinaz Reseptörü B ile Etkileşime Giren Özel Bitki Metabolitlerini Tanımlamak için Hücresel Membran Afinite Kromatografisi Sütunları

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Bu dikey, hücre zarı afinitesi kromatografisi kolonlarının fonksiyonel transmembran reseptörleri ile birleştirilmesinde önemli adımlar sunmaktadır. Bu sütunlar, karmaşık ekstraktlarda bulunan ve immobilize transmembran reseptörleri ile etkileşime giren küçük moleküllerin tanımlanması için kullanılabilir. Hücresel membran afinite kromatografisi sütunları, karmaşık karışımlarda bulunan biyolojik olarak aktif bileşiklerin tanımlanmasını hızlandırır.Hücresel membran afinite kromatografisi sütunlarının kullanımı, bitki, mantar veya bakteri ekstraktları gibi karmaşık doğal matrislerde bulunan farmakolojik olarak aktif bileşiklerin tanımlanmasıyla ilgilenenler için özellikle ilgi çekici olabilir. Başlamak için, beş mililitre ultra saf deiyonize suda 120 benzamidin çözerek 200 milimolar benzamidin stok çözeltisi hazırlayın. Bir duman davlumbazında 10 mililitre etanol içinde 0.017 gram PMSF'yi çözerek 10 milimolar PMSF stok çözeltisi hazırlayın.Ticari olarak temin edilebilen proteaz inhibitörü karışımını bir mililitre ultra saf deiyonize suda çözerek 100X proteaz inhibitörü kokteyli hazırlayın. İyice karıştırın ve kokteylin 200 ila 300 mikrolitresini alın. 55.114 miligram ATP disodyum tuzu hidratını bir mililitre iyonize ultra saf suda çözerek 100 milimolar ATP stok çözeltisi hazırlayın.İyice karıştırın ve karışımın 100 mikrolitresini alın. 3.03 gram Tris-HCL, 2.9 gram sodyum klorür, 0.22 gram kalsiyum klorür susuz, 0.2 gram magnezyum klorür hekzahidrat ve 0.19 gram potasyum klorürü 500 mililitre ultra saf deiyonize suda çözerek tampon hazırlayın. 17.3 mililitre Tris tamponunu 0.3 mililitre benzamidin stok çözeltisi, 0.2 mililitre PMSF stok çözeltisi, 0.2 mililitre proteaz inhibitörü kokteyli, 20 mikrolitre ATP stok çözeltisi, iki mililitre gliserol ve 0.029 gram EDTA ile karıştırarak homojenizasyon tamponunu hazırlayın.Hidroklorik asit çözeltisi kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın. Dört santigrat derecede hasat edilen hücreleri 400 x g'de beş dakika boyunca döndürün ve süpernatantı çıkarın ve kalan hücre peletini 10 mililitre 1X pH 7.4 buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Süpernatantı atın ve 20 mililitre homojenizasyon tamponu ekleyin.Konik tüpü buzun üzerine yerleştirin. Hücre süspansiyonunu 40 mililitrelik bir Zıplama homojenizatörü doku öğütücüye aktarın, 40 yukarı ve aşağı havane darbesi kullanarak süspansiyonu buz üzerinde manuel olarak homojenize edin. Homojenize hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın, peleti atın ve süpernatantı yeni bir konik tüpe aktarın.Hücre zarı peletini kaydedin ve süpernatanı atın. 8.7 mililitre tampon çözeltisini 0.1 mililitre PMSF stok çözeltisi, 0.15 mililitre benzamid stok çözeltisi, 0.1 mililitre proteaz inhibitörü kokteyli, 10 mikrolitre ATP stok çözeltisi, bir mililitre gliserol ve 0.2 gram sodyum kolat ile karıştırarak çözünür tamponunu hazırlayın. Çözünürizasyon tamponunu hücre zarı parçaları ile konik tüpe aktarın.Ve peleti yeniden askıya alın. Elde edilen karışımı 18 saat boyunca dört santigrat derecede 150 RPM'de döndürün. 18 saat sonra, çözünür karışımını 47.900 x g'de 30 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj yapın.100 miligram IAM ekleyin. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıklarını süpernatanta çevirir ve elde edilen süspansiyon karışımını bir saat boyunca dört santigrat derecede 150 RPM'de döndürür. 24 gram Tris-HCl, 23.4 gram sodyum klorür, 0.06 gram kalsiyum klorür, 5.85 gram EDTA ve 0.07 gram PMSF ekleyerek dört litre ultra saf deiyonize suda diyaliz tamponu hazırlayın.PMSF'yi önce küçük bir etanol hacminde çözün ve ardından tamponla beherin içine yavaşça ekleyin. Diyaliz tüpü hazırlamak için 10 santimetrelik selüloz membran diyaliz tüpünü kesin ve IAM içeren süspansiyonu aktarın. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları ve hücre zarı parçaları diyaliz tüpüne girer.Diyaliz tüpünün her iki ucunu diyaliz tüp klipsleriyle kapatın. Diyaliz tüpünü diyaliz tamponuna yerleştirin. 24 saat sonra, diyaliz tüpünü taze hazırlanmış diyaliz tamponuna yerleştirin ve 24 saat daha diyalize devam edin.IAM'yi yıkamak için kullanılacak 10 milimolar pH 7.4 amonyum asetat tamponu hazırlayın. Kişisel bilgisayar. DD2 partikülleri ve kolon karakterizasyon deneylerinde 0.778 gram amonyum asetat bir litre ultra saf deiyonize suda çözülür. 48 saatlik diyalizden sonra, diyaliz tüpünü diyaliz tamponundan çıkarın ve diyaliz tüpünün içeriğini 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.Süpernatantı atın ve kalan peleti 10 mililitre amonyum asetat tamponu ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, kalan peleti bir mililitre amonyum asetat tamponunda yeniden askıya alın. İyice karıştırın ve CMAC kromatografi sütununu elde etmek için 5 x 20 cam sütunu paketlemek için elde edilen bulamacı kullanın.Sütunu paketlemek için, daha önce amonyum asetat tamponu ile ıslatılmış bir alt filtreyi filtre tutucuya yerleştirin. Filtre tutucuyu cam kolona takın ve tutucunun konumunu sabitlemek için kolon kapağını vidalayın. Kolonu dikey olarak bir parmak kelepçesine yerleştirin ve laboratuvar standına sabitleyin.Kolonun altına bir beher yerleştirin, bulamacın küçük bir hacmini, pipet ucunu cam sütun duvarına doğru tutan tek kanallı bir pipetleyici ile yavaşça cam sütuna aktarın. Paketleme işlemini hızlandırmak için, tamponu sabit yatağın üstünden her adım arasında bir mikropipetle çıkarın. Bir üst filtre yerleştirin ve adaptör ünitesini, sabit fazın üzerinde kalan tampon kalmayacak şekilde vidalayın.Adaptör ünitesinin konumunu adaptör kilidi ile sabitleyin. Kolonu yüksek performanslı bir sıvı kromatografi pompasına bağlayın ve kolonunu gece boyunca amonyum asetat tamponuyla yıkamak için akış hızını dakikada 0,2 mililitreye ayarlayın. Daha uzun süre saklamak için, kolonu, amonyum asetat tamponunda% 0.05 sodyum azid çözeltisi ile çalıştırın, sodyum azid ile çalışırken bir laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri ve eldivenler giyin ve dört santigrat derecede saklayın.IAM.Kişisel bilgisayar. DD2 partikülleri ile immobilize nöroblastom TrkB hücre zarı fragmanları ve BDNF varlığında floresan partiküller ile sonuçlandı. TrkB null hücre zarı kapsüllenmiş IAM partiküllerinde veya TrkB hücre zarı kapsüllenmiş IAM partiküllerinde olduğu gibi BDNF kullanılmadığında floresan gözlenmedi. İmmobilize TrkB reseptörlerine bir milimolar, 750 nanomolar, 500 nanomolar ve 300 nanomolar'ın 7, 8-DHF konsantrasyonlarını artıran fonksiyonel bir CMAC kolonu, retansiyon süresinde konsantrasyona bağlı bir değişiklik gösteren tipik bir frontal afinite kromatogramı gösterilmiştir.İşlevsel olmayan bir CMAC kolonu, marker ligandın retansiyonunda konsantrasyona bağlı değişikliklerin eksikliğini gösterdi. Bir CMAC negatif kontrol kolonu, spesifik olmayan etkileşimleri dışlamak için hedeflenen proteini ifade etmeyen, hücre zarı fragmanlarını hareketsiz hale getirerek hazırlandı. % 0.2 sulu Gotu kola ekstraktının eklenmesi, agonist bağlanma bölgesi için rakip ligandların varlığını gösteren 7, 8-DHF retansiyonunda önemli bir azalma ile sonuçlandı.CMAC negatif TrkB null kolonunda 7, 8-DHF retansiyonunun azalmaması, bu kolonda fonksiyonel TrkB reseptörlerinin eksikliğini daha da doğruladı. Eksik pik kromatografi yaklaşımı, TrkB sütununda güçlü bir şekilde tutulan bir bileşiği tanımlarken, TrkB null sütununda erken salınım yaparak spesifik etkileşimi gösterir. Hızlı hücresel membran afinitesi kromatografi sütunu için reseptör kaynağınızı bilmek çok önemlidir.Homojenizasyon ve çözündürme tamponlarını doğru şekilde tasarlamak için literatürü kontrol ettiğinizden emin olun. Bu protokolde hazırlanan hücresel membran afinite kromatografisi kolonu, yeni potansiyel ilaç isabetlerini tanımlamak ve immobilize reseptör ile doğal ligandları arasındaki etkileşimin doğasını karakterize etmek için kullanılmıştır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Yaprak sprey kütle spektrometresi: Doğrudan metabolitleri bitki doku üzerinden değerlendirmek için bir hızlı ortam iyonlaşma tekniği

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli.

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...