Name: control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy
Uploaded: 2022-01-29T14:00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy at JoVE.com

ونشكر السيدة ريبيكا ألفارادو على الدعم المقدم في إنتاج الفيديو البروتوكولي والسيد ستيفن كاسالي على النقد البناء على المخطوطة. نشكر زملاء قسم الفيزياء الحيوية الخلوية، معهد ماكس بلانك للبحوث الطبية على المناقشات المفيدة. الدعم المالي من ماكس بلانك-جيسلشافت إلى E.A.C.-A. ودويتشه Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129، projektnummer 240245660، P15 إلى E.A.C.-A. و P4 إلى الولايات المتحدة؛ DFG EXC 2082/1-390761711 إلى الولايات المتحدة) هو أيضا معترف به إلى حد كبير. J.B. يشكر مؤسسة كارل زايس على الدعم المالي. E.A.C.-A., C.S. والولايات المتحدة تعترف التمويل من خلال ماكس بلانك مدرسة المسألة إلى الحياة بدعم من وزارة التعليم والبحوث الاتحادية الألمانية (BMBF). C.S. مدعوم من قبل مجلس البحوث الأوروبي (الموحد منحة PHOTOMECH, no.101001797).

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+neighborhood:+adhesion-coupled+cell+mechanosensors.">Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors.</a> Cell. 110 (2), 139-142 (2002).</li><li>Beningo, K. A., Hamao, K., Dembo, M., Wang, Y. -. l., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+of+fibroblasts+are+regulated+by+the+Rho-dependent+kinase+but+not+by+the+myosin+light+chain+kinase.">Traction forces of fibroblasts are regulated by the Rho-dependent kinase but not by the myosin light chain kinase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 456 (2), 7 (2006).</li><li>Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+traction+force+in+relation+to+cell+shape+and+focal+adhesions.">The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions.</a> Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).</li><li>Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+spread+area+and+traction+forces+determine+myosin-II-based+cortex+thickness+regulation.">Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation.</a> Biochimica Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123, 4201-4213 (2010).</li><li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+printing+by+light-induced+molecular+adsorption.">Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption.</a> Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).</li><li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microtubules: in vivo Methods in Cell Biology. , 133-146 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogel+micropatterning.">Polyacrylamide hydrogel micropatterning.</a> Methods Cell Biology. 120, 93-116 (2014).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Polacheck, W. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell-generated+forces:+a+guide+to+the+available+tools.">Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools.</a> Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1853, 3095-3104 (2015).</li><li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+forces+in+cell+biology.">Quantifying forces in cell biology.</a> Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).</li><li>Hanke, J., Probst, D., Zemel, A., Schwarz, U. S., Koster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+force+generation+by+spreading+platelets.">Dynamics of force generation by spreading platelets.</a> Soft Matter. 14 (31), 6571-6581 (2018).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+particle+image+velocimetry.">Digital particle image velocimetry.</a> Experiments in Fluids. 10, 181-193 (1991).</li><li>Lourenco, L., Krothapalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+accuracy+of+velocity+and+corticity+measurements+with+PIV.">On the accuracy of velocity and corticity measurements with PIV.</a> Experiments in Fluids. 18, 421-428 (1995).</li><li>Adrian, R. J., Westerweel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Particle Image Velocimetry. , (2011).</li><li>Westerweel, J., Scarano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+outlier+detection+for+PIV+data.">Universal outlier detection for PIV data.</a> Experiments in Fluids. 39 (6), 1096-1100 (2005).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+forces+at+focal+adhesions+from+elastic+substrate+data:+the+effect+of+localized+force+and+the+need+for+regularization.">Calculation of forces at focal adhesions from elastic substrate data: the effect of localized force and the need for regularization.</a> Biophysical Journal. 83 (3), 1380-1394 (2002).</li><li>Huang, Y., Gompper, G., Sabass, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bayesian+traction+force+microscopy+method+with+automated+denoising+in+a+user-friendly+software+package.">A Bayesian traction force microscopy method with automated denoising in a user-friendly software package.</a> Computer Physics Communications. 256, 107313 (2020).</li><li>Vedadghavami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+hydrogel+biomaterials+with+controlled+mechanical+properties+for+tissue+engineering+applications.">Manufacturing of hydrogel biomaterials with controlled mechanical properties for tissue engineering applications.</a> Acta Biomaterialia. 62, 42-63 (2017).</li><li>Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+soft+hydrogel+microindentation:+Impact+of+various+indentation+parameters+on+the+measurement+of+Young's+modulus.">Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus.</a> PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).</li><li>Oria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+loading+explains+spatial+sensing+of+ligands+by+cells.">Force loading explains spatial sensing of ligands by cells.</a> Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).</li><li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+cells+feel:+methods+for+thin+gels.">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).</li><li>Sen, S., Engler, A. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+strains+induced+by+cells:+Computing+how+far+cells+can+feel.">Matrix strains induced by cells: Computing how far cells can feel.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 2 (1), 39-48 (2009).</li><li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing.">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Letters. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li><li>Galluzzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+methodology+and+AFMech+Suite+software+for+nanomechanics+on+heterogeneous+soft+materials.">Atomic force microscopy methodology and AFMech Suite software for nanomechanics on heterogeneous soft materials.</a> Nat Communications. 9 (1), 3584 (2018).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

في هذا البروتوكول، ونحن نصف إعداد micropatterned PA الهيدروجيلات التي تحتوي على حبات الفلورسنت، والتي تستخدم كعلامات fiducial لدراسات TFM. ويستند نهجنا على ثلاث خطوات: 1) إعداد هيدروجيل السلطة الفلسطينية مزدوجة الطبقات؛ (2) إعداد الهيدروجيلات السلطة الفلسطينية ذات الطبقات المزدوجة؛ (2) إعادة تنظيم الهيئة؛ (3) إعداد الكبسولات الهيدرولوجية ذات الطبقات المزدوجة؛ ( 2) micropatterning من البروتينات ECM ونقلها على سطح الهيدروجيل؛ 3) استخدام منقوشة بالقرب من الأشعة فوق البنفسجية ضوء لتي اف ام. الإعداد التجريبي لتحليل الجر الخلية إلى الركيزة يتطلب استخدام مواد مرنة خطية مع قيم صلابة معروفة لحساب القوى المتعلقة بإزاحة الخرز الفلوري26. السلطة الفلسطينية هيدروجيلس سهلة التحضير، صلابة يمكن ضبطها بسهولة، وأنها تستخدم عادة لاستشعار صلابة و TFM18،28. ومع ذلك ، للحصول على مرات البلمرة القابلة للاستنساخ والبوليمرة المتجانسة للهيدرجيل بأكمله ، ينبغي إيلاء الاهتمام لتخزين الظروف والوقت للكواشف ، على سبيل المثال ، يجب الاحتفاظ APS في مجفف لتجنب فقدان نشاطها ؛ يجب حماية TEMED من الضوء المباشر. استخدام HEA المؤتأكسدة يسمح الربط التساهمي للبروتينات مصفوفة على سطح الهيدروجيل، والتي قد تكون مفيدة لتحقيق تشكيل طبقة بروتين كامل ومستقر. وينبغي إعداد حل HEA المؤتأكسدة طازجة في كل مرة يتم فيها تصنيع الهيدروجيلات السلطة الفلسطينية. يوفر هيدروجيل السلطة الفلسطينية ثنائي الطبقات ثلاث مزايا رئيسية: 1) أنه يوفر طريقة بديلة للحصول على توزيع متجانس للخرزات ال fiducial بالقرب من سطح الهيدروجيل ، دون الحاجة إلى جعل الجل رقيقا للغاية (أي <20 ميكرومتر). السيطرة على سمك الهيدروجيل أمر بالغ الأهمية للحصول على قياسات دقيقة مع TFM. عندما تكون الركيزة المرنة رقيقة جدا ، قد تشعر الخلايا القوية الملتصقة مثل الخلايا الليفية وتستجيب ميكانيكيا للركيزة الزجاجية الصلبة الأساسية29،30. الهيدروجيلات سميكة جعل الحصول على صورة لإعادة بناء القوة أكثر تحديا. وعلاوة على ذلك، فإن العديد من المجاهر ليس لديها مساحة كافية لاستيعابها، بالنظر إلى سمك إضافي من الركيزة الزجاجية المستخدمة لإرفاق الهيدروجيل، ما لم يتم استخدام الشرائح المجهرية فائقة الصغر. 2) في هيدروجيل السلطة الفلسطينية ذات الطبقات المزدوجة، يتم تحقيق التوزيع المتجانس للخرزات fiducial بالقرب من سطح هيدروجيل السلطة الفلسطينية دون استخدام جهاز طرد مركزي، ولكن بدلا من ذلك مع حضانة بسيطة من كميات دقيقة من حلول الهيدروجيل والخرز الفلوري. كثافة حبة عالية هي ذات فائدة كبيرة عند إجراء تحليل PIV لأنه يزيد من دقة قوى الجر ونسبة الإشارة إلى الضوضاء دون الحاجة إلى المجهر confocal. 3) حصر الخرز في طبقة رقيقة قريبة من واجهة الخلية والمواد تمكن التصوير من قوى الجر مع المجاهر epifluorescence فضلا عن المجاهر confocal. عند إعداد الهيدروجيل، يجب على المستخدم التأكد من أنه يلتزم بقوة بالزجاج السفلي قبل الشروع في الخطوات اللاحقة للبروتوكول. نوصي باتباع وقت الحضانة المشار إليه لبوليمرة طبقات الهيدروجيل ، لأنه قد يكون من الصعب إزالة الزجاج فوق السطح دون الإضرار بسطح الهيدروجيل.
التقنيات الأكثر شهرة لقياس الخصائص المرنة هي AFM ، المسافات النانوية ، اختبارات الشد ، وقياس الريوميتري. ومع ذلك ، فإن المسافات النانوية تحفز ضغوطا عالية جدا على المواد التي يمكن أن تؤثر على تحديد الخصائص المرنة. اختبارات الشد وقياس الريوميتري من ناحية أخرى هي تقنيات قياس العيان، في حين تتفاعل الخلايا على مقياس مجهري31،32. يسمح AFM بالقياسات على النطاق الدقيق مع انخفاض السلالات في ظل الظروف الفسيولوجية. يمكن أن تتأثر موثوقية قياسات AFM سلبا إذا كانت التفاصيل التجريبية مفقودة (على سبيل المثال، قوة المسافة البادئة والسرعة) أو تم تسجيل بيانات غير كافية27. يصف Huth وآخرون خوارزمية لاستخراج معامل يونغ من بيانات AFM ، والتي تؤكد الحفاظ على تفاصيل القياس constant27. تقدم هذه الخوارزمية تحديدا دقيقا وموثوقا لمعامل يونغ واستخدمت في تجاربنا. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بقياس العديد من المنحنيات على عينات ملفقة في أيام مختلفة واكتسبنا نتائج مشابهة جدا (تباين متوسط القيم من كاليفورنيا 1-2 كيلو باسكال). وهذا يدل على أن صلابة المواد الهلامية لدينا يمكن التنبؤ بها بشكل موثوق.
في هذا البروتوكول، نستخدم وحدة فوتوباترنينج لإنشاء مناطق مجهرية على الزجاج، والتي يتم نقلها بعد ذلك إلى أسطح الهيدروجيل. ويستند micropatterning هو مبين في هذا البروتوكول على DMD (جهاز المرآة الدقيقة الرقمية) القائم على قناع شبه الأشعة فوق البنفسجية الطباعة الحجرية (λ = 375 نانومتر)7. وDMD يتكون من عدد كبير من الميرات الصغيرة على رقاقة. يتوافق بكسل واحد مع مرآة صغيرة واحدة. يتم إسقاط ملف صورة النمط المنقطة من جهاز كمبيوتر من خلال DMD ويركز على السطح باستخدام عدسة موضوعية. بالنسبة ل micropatterning من البروتينات ، يتم استخدام ضوء الليزر المركز لترابط فرش البوليمر الطاردة بمساعدة فوتونيتياتور. بعد ذلك ، تمتلئ المناطق المعرضة ببروتينات ECM. توفر طريقة الاستئصال بدون قناع هذه مرونة كبيرة في تصميم أنماط جديدة ، لأنها لا تعتمد على استخدام قناع ضوئي. تصميم وتطبيق نمط من السهل جدا لأنه يأخذ سوى عدة دقائق باستخدام مجانية مثل Inkscape. ومع ذلك، فإن عدد الأنماط والعينة المنتجة في فترة قصيرة من الزمن هو عيب رئيسي، حيث لا يمكن استخدام هذه الطريقة إلا لأنماط ركيزة واحدة في كل مرة. تستخدم وحدة التصوير الضوئي مصدر ليزر قريب من الأشعة فوق البنفسجية الصلبة التي تنبعث منها عدة ملليواطات. شعاع الليزر غير المهزوا خطير على العينين والجلد. يمكن أن يكون الضوء المنعكس والمتناثر والإشعاع خطيرا أيضا. يجب أن يكون التعامل معها مصحوبا بتعليمات السلامة من ضباط الليزر. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول عند استخدام وحدة فوتوباترنينج هو التأكد من أن أثناء micropatterning والاجتثاث الليزر يركز بشكل صحيح على السطح. تعتمد جرعة الإضاءة المتسقة (الكثافة مضروبة في الوقت) من ضوء الأشعة فوق البنفسجية أثناء النقش على كيفية تركيز الليزر على السطح. قد تؤدي كثافة ضعيفة على السطح بسبب ضعف التركيز إلى فشل نقل ECM إلى سطح الهيدروجيل مما يؤدي إلى عدم تعلق الخلايا بالهيدرجيل.
في تجارب TFM ، بعد التصوير الأولي للخلايا الملتصقة والعلامات الودودولوجية ، يتم إطلاق الخلايا من هيدروجيل السلطة الفلسطينية عن طريق علاج التريبسين لتسجيل حالتها المريحة. عيب في تنفيذ هذه الخطوة هو التعامل مع العينة على مرحلة المجهر. دون غرفة التخبط، وفتح غطاء الطبق، وسبيراتينغ المتوسطة، والشطف، والحل الجربسين pipetting تمثل تحديا للمبتدئين والمستخدمين ذوي الخبرة. في الواقع، هذه الإجراءات هي مصدر رئيسي للانجراف في محاور xyz ، مما أدى إلى فقدان الموقف والتركيز. لدينا بروتوكول الإضاءة الأشعة فوق البنفسجية المحلية يجعل TFM تقنية أكثر سهولة للمبتدئين. وتجدر الإشارة إلى أننا استخدمنا وحدة تصويرية خالية من الأقنعة متاحة تجاريا، ولكن من حيث المبدأ يمكن استخدام أي نظام إضاءة للأشعة فوق البنفسجية- A، في نهاية المطاف بالاشتراك مع قناع لحماية مناطق الركائز، حيث لا ينبغي تسجيل قوى الجر الخلوية. إن تعريض الخلايا بجرعة كبيرة من الضوء المرئي منخفض الطول الموجي (على سبيل المثال، الضوء البنفسجي الذي يثير انبعاث DAPI) سيؤدي إلى زيادة الإجهاد التأكسدي، والذي يمكن أن يؤدي إلى السمية الضوئية وموت الخلايا. لذلك ، يمكن تطبيق هذه التقنية حتى في المجهر epifluorescence دون وحدة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. ومع ذلك ، حيث أن الكثافة أضعف بكثير ، سيكون من الأسهل بكثير إنجاز TFM مع العلاج الأنزيمي في هذه الحالة.
مع LUVI-TFM من الممكن استخدام نفس العينة لعدة قياسات بسبب انفصال محلي من خلايا واحدة أو مجموعات صغيرة من الخلايا. ومع ذلك، ينبغي إيلاء الاهتمام لاختيار الخلايا لفصل، لتجنب تسجيل القوات من الخلايا المجاورة. وبالتالي، بالنسبة لقياسات الخلية الواحدة في غياب الترباسات الدقيقة، ينبغي تجنب المناطق المزدحمة؛ بالنسبة للقياسات على الخلايا المصغرة المفردة ، يجب تصميم الأنماط بحيث تكون المسافة بين الهياكل المفردة ضعف قطر المنطقة المنقوشة على الأقل. نوصي أيضا بعدم استخدام خلايا من أنماط متجاورة في التسلسل ، ولكن بدلا من أخذ عينات منها من مناطق بعيدة على الركيزة. يتم إجراء قياسنا بشكل جيد على مجهر epifluorescence مجهز بميزة التحكم في التركيز وعدسة 40 × الهواء NA = 0.9 ، حيث تكون مسافة عمل العدسة طويلة بما فيه الكفاية والحركة السريعة من بئر إلى آخر غير قادرة للغاية. مفرزة الخلايا المستهدفة لتطبيقات TFM فعالة لقياس القوة الخلوية لخلية واحدة أو مجموعة خلايا صغيرة كاملة (على سبيل المثال، يصل قطرها إلى 300 ميكرومتر). باستخدام الإعداد لدينا، لاحظنا التقريب الخلية ومفرزة لعلاج الأشعة فوق البنفسجية من الخلايا المفردة (الشكل 3A)، في حين أن مفرزة نادرا ما حدث لمجموعات الخلايا الصغيرة. وهذا قد يؤدي إلى التقليل من شأن قوى الجر الخلية. بالنسبة لمجموعات الخلايا الكبيرة، يوصى بالانزيم الإنزيمي، حيث يجب على المستخدمين استخدام هدف هواء 20x لتصوير الكتلة بأكملها، وهناك حاجة إلى ميزة التحكم في التركيز البؤري. وبما أن عمق تركيز عدسة الهواء 20x أطول بكثير ، فإن المناولة لن تكون حاسمة مثل هدف التكبير الأعلى. يجب على المستخدم التأكد من أن التركيز يتم ضبطه بشكل صحيح لاجتثاث الخلايا ، لأن جرعة الإضاءة تعتمد على تركيز الليزر على السطح. في حين أننا ندرك القيود المحتملة في استخدام LUVI-TFM في تجمعات الخلايا بسبب التفاعلات الميكانيكية المحتملة مع الخلايا غير المعالجة المجاورة ، يمكن أن يتحول هذا الجانب في الواقع إلى أن يكون مفيدا للدراسات حول آليات قذف الخلايا المستهدفة ، على سبيل المثال ، من الطبقات الأحادية الظهارية.
في الختام، مع نهجنا TFM جنبا إلى جنب مع إطلاق الضوء الناجم عن الخلايا micropatterned، ونحن نقدم بروتوكول قوي وعالي الإنتاجية لقياس قوات الالتصاق الخلية. ويمكن زيادة استغلال براعة هذه الطريقة باستخدام المجهر وإعداد التصوير بهدف تحسين الدقة والحساسية.

عند التفاعل مع بيئتها خارج الخلية ، تمارس الخلايا الملتصقة قوى يتم التوسط فيها بشكل رئيسي من خلال الالتصاقات البؤرية القائمة على integrin التي تربط المصفوفة خارج الخلية (ECM) بالهيكل الخلوي actin. الالتصاقات البؤرية هي تجميعات متعددة الحماية التي تتركز حول ربط integrins إلى بروتينات ECM مثل فيبروكتين والكولاجين. إن تجميع Integrin ونمو التصاقات البؤرية أمر بالغ الأهمية ليس فقط لإنشاء اتصال مستقر ميكانيكيا ، ولكن أيضا لتوظيف بروتينات التصاق بؤرية أخرى ، بما في ذلك تلك التي تنشط مسار RhoA لتنظيم انقباض الخلوية1. تسمح الانقباضات المعتمدة على RhoA للهيكل الخلوي actin للخلايا بالانتشار والهجرة على ECM الأساسي ، وكذلك الشعور بصلابته2. يعتمد توزيع قوى الجر بقوة على منطقة انتشار الخلايا وشكلها ، وكلاهما يعتمد على خصائص المصفوفة وبالتالي يؤثر على التنظيم الهيكل الخلوي ، مما يشكل في نهاية المطاف حلقة تغذية مرتدة مغلقة بين ميكانيكا المصفوفة والتنظيم الهيكل الخلوي3،4.
تقنيات micropatterning السطح تسمح لمراقبة محددة لشكل الخلية من خلال خلق مناطق بحجم ميكرون تقديم البروتينات اللاصقة ECM; وفقا لحجم هذه المناطق، خلايا مفردة، أو مجموعات من الخلايا التي تلتزم micropattern5. يمكن أن تكون منقوشة البروتينات ECM على الركائز الزجاجية من قبل نهج مختلفة مثل الطباعة microcontact، ونقش الصور أو الليزر النقش6. استخدام الأشعة فوق البنفسجية ضوء (λ = 185 أو 375 نانومتر) جنبا إلى جنب مع استراتيجيات السطح المضادة للضروب يوفر المرونة لتصميم مختلف الأشكال والأحجام وشل حركة أنواع البروتين متعددة مع دقة عالية بالقرب من حواف السطح7،8. المناطق المغلفة بالمواد الكيميائية الطاردة للبروتين مثل جليكول البولي إيثيلين (PEG) محمية إما بقناع ضوئي كروم أو نظام مطبوع رقمي بدون قناع (DMD). تسمح الأنماط الموجودة في الأقنعة بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية للمناطق التي سيتم نقشها بعد ذلك ببروتينات ECM. يتطلب نقش أسطح الهيدروجيل مع بروتينات ECM خطوة نقل لإزالة البروتينات من سطح الزجاج وربطها بالأنماط. بدلا من ذلك ، يمكن تحقيق النقش على المواد الناعمة من خلال طلاء قناع الصورة أولا ببروتين طارد ، يليه حرق المناطق غير المقنعة باستخدام إضاءة الأشعة فوق البنفسجية العميقة. منذ الأشعة فوق البنفسجية العميقة يولد الأوزون ويجعل سطح رد الفعل لربط البروتين، ومغطاة المناطق غير المقنعة مع بروتينات ECM وأخيرا هو بلمرة هلام مباشرة على رأس المناطق غير المقنعة9،10.
يمكن استخدام الهيدروجيلات المنقوشة لأداء TFM ، وهي تقنية تقيس قوى الخلية في واجهة الخلية والمواد11. في 2D-TFM، يستخدم المرء السطح المسطح لفيلم بوليمر سميك، حيث تم تضمين حبات العلامة لتتبع التشوهات12،13،14،15. من أجل استخراج ناقلات الإزاحة ، من الضروري الجمع بين صورتين ، واحدة من الحالة المشوهة وصورة مرجعية واحدة دون تشوهات. ثم يتم تعيين الصورتين على بعضهما البعض مع معالجة الصور. في كثافة علامة عالية، ويتم ذلك عادة مع الجسيمات صورة Velocimetry (PIV)، وهو أسلوب راسخ لإعادة بناء التدفق الهيدروديناميكي. في كثافة علامة منخفضة وفي 3D-TFM، ويتم ذلك عادة مع تتبع الجسيمات Velocimetry (PTV)، والذي يتضمن ميزات محددة من مجموعة البيانات التجريبية. مثال على بديل أرخص حسابيا هو التدفق البصري ، مثل خوارزمية كاناد لوكاس توماسي (KLT)16. في حالة الركائز الهيدروجيل، وعادة ما تكون جزءا لا يتجزأ من الخرز الفلورسنت في كثافة عالية أثناء البلمرة المادية، ويتم تسجيل الصور قبل وبعد إطلاق الخلية عند مفرزة الأنزيمية. يؤدي الانفصال الأنزيمي للخلايا الملتصقة ، على سبيل المثال ، عن طريق المحاولة ، إلى إطلاق الجر الخلوي في وقت واحد من جميع الخلايا على الهيدروجيلات ، مما يجعل من الصعب الحصول على تحليل مفصل من عدد كبير من الخلايا.
هنا نقدم بروتوكولا لإعداد الهيدروجيلات micropatterned للسيطرة على شكل الخلية وتوطين وطريقة لقياس كفاءة قوى الجر في تسلسل باستخدام الأشعة فوق البنفسجية لفصل الخلايا الفردية من الركيزة. لقياسات قوة الجر، نقدم تقنية لإنتاج الهيدروجيلات PA ثنائية الطبقات، حيث يتم تضمين الخرز الفلوري فقط في الطبقة العليا، مما يزيد من كثافتها ويقلل من انتشارها الرأسي. الجمع بين إطلاق الأشعة فوق البنفسجية بوساطة من قوى الجر الخلوية مع micropatterning يجعل من الممكن الحصول على السيطرة المكانية على مفرزة الخلية (على سبيل المثال، من خلايا واحدة دون التأثير على التصاق الخلايا الأخرى في المنطقة ذات الاهتمام)، شريطة أن يكون هناك مسافة كافية بين الخلايا المنقوشة. ثم يتم إعادة بناء الجر الخلوي باستخدام الطريقة الأكثر كفاءة وموثوقية ل2D-TFM، وهي فورييه تحويل الجر قياس الخلايا (FTTC) مع إضفاء الطابع النظامي17،18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>#440159</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>#33209</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %</td>
			<td>#1610140</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>#CP-CONT-BSG-A-G</td>
			<td>NanoAndMore</td>
			<td>5 &#956;m spherical tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system</td>
			<td>#NanoWizard3</td>
			<td>JPK</td>
			<td>Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>#A3678</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2 %</td>
			<td>#1610142</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#C11440-42U30</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#ANDORZYLA4.2</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox</td>
			<td>#C10422</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom incubator chamber</td>
			<td></td>
			<td>EMBLEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>#1300 100</td>
			<td>Picodent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>#41965</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Eclipse Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Axiovert200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>#9065.3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>#S181T</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>#F13191</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Alexa488 conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>#F1141</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8805</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (365/415)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8848</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (505/515)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8810</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (580/605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8807</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (660/680)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 15 mm round</td>
			<td>#41001115</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 24 mm round</td>
			<td>#41001124</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>#MRH08230</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>20x air NA 0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td>#CRL-2991</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>#MPEG-SVA-5000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxyethyl acrylamide</td>
			<td>#697931</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>#100-E</td>
			<td>TePla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>#PLPPgel</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>#P4823</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)</td>
			<td>#PLL(20-g[3.5]-PEG(2)</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium(meta) periodate</td>
			<td>#S1878</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>#17919</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Pattening module</td>
			<td>#PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVO cleaner</td>
			<td>#342-220</td>
			<td>Jelight</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy

قوة الجر المجهرية (TFM) هو الأسلوب الرئيسي المستخدم في علم الأحياء الميكانيكية لقياس قوات الخلية. عادة ما يتم استخدام هذا للخلايا التي تلتزم الركائز الناعمة المسطحة التي تشوه تحت الجر الخلية (2D-TFM). تعتمد TFM على استخدام المواد المرنة الخطية، مثل البوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS) أو البولي أكريلاميد (PA). بالنسبة ل 2D-TFM على السلطة الفلسطينية ، فإن صعوبة تحقيق إنتاجية عالية تنتج بشكل رئيسي عن التباين الكبير في أشكال الخلايا والجر ، مما يدعو إلى التوحيد القياسي. نحن نقدم بروتوكولا لتصنيع بسرعة وكفاءة micropatterned السلطة الفلسطينية الهيدروجيلات لدراسات 2D-TFM. يتم إنشاء المغذيات الدقيقة لأول مرة عن طريق التصوير الضوئي بدون قناع باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية القريبة حيث ترتبط بروتينات المصفوفة خارج الخلية فقط بالمناطق المجهرية ، في حين أن بقية السطح لا يزال غير لاصق للخلايا. يرجع التجزؤ الدقيق لبروتينات المصفوفة خارج الخلية إلى وجود مجموعات ألدهيد نشطة ، مما يؤدي إلى مناطق لاصقة من أشكال مختلفة لاستيعاب الخلايا الفردية أو مجموعات من الخلايا. لقياسات TFM، ونحن نستخدم هيدروجيل السلطة الفلسطينية من مرونة مختلفة عن طريق تغيير كميات من الأكريلاميد وببيس أكريلاميد وتتبع تشريد الخرز الفلورية جزءا لا يتجزأ لإعادة بناء حقول الجر الخلية مع قياس الخلايا تحويل فورييه (FTTC).
لتحقيق مزيد من التسجيل الدقيق لقوات الخلية، ونحن نصف استخدام جرعة تسيطر عليها من الضوء المنقوش لإطلاق الجر الخلية في مناطق محددة لخلايا واحدة أو مجموعات من الخلايا. ونحن ندعو هذه الطريقة المحلية الأشعة فوق البنفسجية قوة الجر المجهر (LUVI-TFM). مع العلاج الأنزيمي ، يتم فصل جميع الخلايا عن العينة في وقت واحد ، في حين أنه مع قوى الجر LUVI-TFM من الخلايا في مناطق مختلفة من العينة يمكن تسجيلها في التسلسل. ونبين قابلية هذا البروتوكول للتطبيق '1' لدراسة قوى الجر الخلوية كدالة للالتصاق الخاضع للرقابة بالركيزة، و'2' تحقيق عدد أكبر من الملاحظات التجريبية من العينة نفسها.

وقد تم بلمرة هيدروجيل السلطة الفلسطينية على الأغطية الزجاجية الميثاكريلاتية، التي تقدم مجموعات تفاعلية للربط التساهمي للسلطة الفلسطينية. وبهذه الطريقة، عند وضع الهيدروجيلات في محلول مائي، تم منع انفصالها عن الركيزة (الشكل 1A-D). للحصول على كثافة عالية من علامات fiducial بالقرب من سطح الهيدروجيل، وضعنا إعداد هيدروجيل السلطة الفلسطينية ذات الطبقات المزدوجة. تم بلمرة الطبقة السفلية ، دون أي حبات فلورية ، على غطاء الميثاكريلاتي. وفي وقت لاحق، تم بلمرة طبقة أخرى تحتوي على الخرز فوق الطبقة السفلية (الشكل 1E-H)، لتحل محل الحاجة إلى الترسيب، والذي يستخدم في كثير من الأحيان لتحقيق توزيع الخرز في مستوى بؤري واحد وزيادة كثافة الخرز. لتحقيق السيطرة على شكل الخلية خلال قياسات TFM، أنتجنا هيدروجيلس السلطة الفلسطينية micropatterned عن طريق النقل المباشر للهياكل المجهرية المنقوشة فيبروكتين من غطاء زجاجي إلى السلطة الفلسطينية قبل البوليمر (الشكل 1F-F'). إضافة 1٪ crosslinker غير التقليدية (HEA المؤأكسدة) في الحل طبقة هيدروجيل الأعلى يوفر مجموعات ألدهيد التي تربط بشكل متناقض لمجموعات أمين فيبروكتين.
أعددنا هيدروجيل السلطة الفلسطينية، والتي هي ما يقرب من 60 ميكرومتر في سمك والخرز الفلورية المحصورة في الطبقة العليا بالقرب من سطح الهيدروجيل. هذا النوع من الهيدروجيل هو ركيزة مناسبة لتصوير الجر الخلوي مع المجاهر المقلوبة وسميكة بما فيه الكفاية (تم الإبلاغ عن الحد الأدنى من سمك لأداء TFM أن يكون 20-30 ميكرومتر)18 لمنع أي تأثير للركيزة الزجاج. تم تصوير توطين الخرز الفلوري بواسطة المجهر الكونفوجال (الشكل 1I). لتصور نقل البروتين على الهيدروجيل، استخدمنا بروتينات ECM المسماة بالفلورسنت وصورناها عن طريق المجهر الفلوري (الشكل 1J). أعددنا دوائر ميكروباترنيد من فيبروكتين يبلغ قطرها 100 ميكرومتر (الجانب الأيسر) و 50 ميكرومتر (الجانب الأيمن) للسماح بالالتصاق بمجموعات من الخلايا أو الخلايا المفردة ، كما هو موضح في تراكب صور الحقل الساطعة للخلايا الملتصقة ، والخرز الوثني المسمى بالفلورسنت والخلايا الدقيقة الفيبرونيكتين. على عينة مختلفة، تم التحقق من صحة استجابة التصاق الخلايا المفردة إلى فيبروكتين micropatterned عن طريق المجهر immunofluorescence غير المباشرة لتصوير توطين بروتينات الالتصاق البؤري مثل باكسيلين (الشكل 1K).
كل من طلاء البروتين ECM وتصلب الهيدروجيل هي المعلمات الحاسمة لالتصاق الخلية26. لتوصيف الخصائص الميكانيكية لدينا هيدروجيلس السلطة الفلسطينية، قمنا بإجراء تجارب المسافات النانوية من قبل AFM27، إلى جانب المجهر epifluorescence. تم إعداد واختبار ركائز هيدروجيل من ثلاث صلابات مختلفة مع الإعداد لدينا (الشكل 2 والجدول 1). تم الاقتراب دوريا من كبسولات AFM على شكل كرة وتم سحبها من الهيدروجيلات غير المصححة للسلطة الفلسطينية والفيبرينوجين المترافقة مع المناطق التي تم تجميعها في Alexa488 - micropatterned ، أثناء تسجيل منحنيات مسافة القوة. في وقت لاحق، سمح لنا تقييم نقطة الاتصال وتطبيق نموذج هيرتز بتقدير معامل يونغ (E) لكل عينة. لم يغير الترند المجهري ECM معامل الشباب ، والذي ظل مشابها لكل من الهيدروجيلات السلطة الفلسطينية غير المصححة.
لقياس قوى الجر التي تمارسها الخلايا الملتصقة على الركيزة ، قمنا بتطوير إعداد تجريبي ل TFM المرجعي القائم على المجهر واسع النطاق مجهز بوحدة ليزر الأشعة فوق البنفسجية القريبة (UV-A 6000 mJ /mm2) لإطلاق الجر الخلوي (الشكل 3A). كما يمكن التحكم في الإضاءة شعاع الليزر spatio زمنيا، ليس فقط هو أنه من الممكن لفضح انتقائي خلية واحدة أو كتلة الخلية مع جرعة ليزر عالية، ولكن أيضا والأهم من ذلك، الخطوة المتوسطة التخريبية لإزالة الخلايا من العينة بأكملها باستخدام إنزيم الجهاز الهضمي مثل تريبسين لم يعد ضروريا. الخلايا المضيئة مع مثل هذه الجرعة الليزر عالية تسبب الإجهاد التأكسدي مرتفعة مما يؤدي إلى موت الخلية (الشكل 3B). وأسفر موت الخلية عن إطلاق الجر من الركيزة، كما هو مبين في إزاحة الخرز (الموضحة في الشكل 3 ألف). جمعنا بين إضاءة الأشعة فوق البنفسجية A ووحدة النقش الخفيفة لإلقاء الضوء بشكل انتقائي على المناطق بحجم ميكرون من الهيدروجيلات السلطة الفلسطينية (الشكل 3B-C). وبهذه الطريقة يمكن إطلاق قوة الجر لمجموعات الخلايا المصغرة (الشكل 3C، F) أو الخلايا المفردة (الشكل 3B). الأهم من ذلك، في موازين عصرنا لم تتأثر الخصائص الميكانيكية للهيدروجيلات المنقوشة ECM بشكل كبير بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية (الشكل 2C). تظهر زيادة في الإجهاد التأكسدي في الشكل 3D,E. وأعيد بناء قوى الجر باستخدام نظامية FTTC مع معلمة تنظيم اختارها التحقق من صحة الصليب المعمم (الشكل 3B، واو). وقد حدث إطلاق القوات لخلايا واحدة على مدى فترة 15 دقيقة، ونتيجة لLUVI-TFM مماثلة ل TFM القائم على التريبسين (الشكل 3G-H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig01.jpg"> الشكل 1: مخطط إعداد فيبروكتين الركيزة المنقوشة لTFM. (A) يتم أنابيب الحل للطبقة السفلية على سطح ميثاكريلاتي. (ب) يتم وضع غطاء نظيف أصغر بعناية على القطيرات. (ج) وقت الهلام هو 45 دقيقة (D) يتم فصل غطاء العلوي. الطبقة السفلية جاهزة. (ه) الحل للطبقة العليا هو pipetted على هيدروجيل. (F) يتم وضع غطاء منقوش بعناية على القطيرات. (واو)' يتم إنتاج micropatterning من البروتينات اللاصقة على الزجاج عن طريق قناع بالقرب من الأشعة فوق البنفسجية الطباعة الحجرية، ومن ثم نقلها من الزجاج إلى هيدروجيل السلطة الفلسطينية. مجموعات أمين الحرة من البروتينات اللاصقة، على سبيل المثال، فيبروكتين، ربط بشكل مشترك لمجموعات ألدهيد على سطح السلطة الفلسطينية. (G) وقت الهلام هو 45 دقيقة.( H) يتم فصل الغطاء العلوي. هيدروجيل السلطة الفلسطينية منقوشة جاهزة. (I) تمثيل ثلاثي الأبعاد لميكروجراف xyz confocal يظهر كثافة عالية من الخرز ال fiducial بالقرب من السطح. (J) ميكروجراف من فيبروكتين المسمى فلوريا (أرجواني) على سطح السلطة الفلسطينية مع حبات الفلورسنت جزءا لا يتجزأ (الأخضر)، تراكب مع صورة حقل مشرق من الخلايا. (ك) التصوير المجهري المناعي غير المباشر لخلية واحدة ملتصقة بورم فيبروكتين ميكروباترن على شكل دائرة (100 ميكرومتر). النواة (الأزرق)، باكسيلين (أحمر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig02.jpg"> الشكل 2: توصيف عينة الخصائص الميكانيكية من قبل AFM. (أ) الإعداد التجريبي للمسافات النانوية AFM. يتم استخدام كانتيليفر على شكل كرة للتحقيق في النترات الدقيقة ECM قبل أو بعد العلاج بالأشعة فوق البنفسجية ، والمناطق غير المنقوشة من المناطق ذات الطبقات المزدوجة PA (5٪ أكريلاميد ، 0.3٪ بيس أكريلاميد). (ب) القوة التمثيلية مقابل منحنى المسافة البادئة للماء ECM (أسود). يستخدم هيرتز صالح (الأحمر) لحساب معامل يونغ (E) من العينة. (ج) القياسات الميكانيكية للمناطق السلطة الفلسطينية مزدوجة الطبقات غير منقوشة (لا ECM)، ECM micropattern وECM micropattern بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية-A. الحانات تظهر يعني ± S.E.M. (براون فورسيث وويلش ANOVA اختبار). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig03.jpg"> الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن تتيح الإضاءة المحلية للأشعة فوق البنفسجية -A TFM (LUVI-TFM) قياسات قوة الجر المحلية داخل مجال رؤية كبير. (أ) مخطط الإضاءة المحلية للأشعة فوق البنفسجية-A TFM. يتم التعامل مع الخلايا بجرعة عالية من الأشعة فوق البنفسجية ليزر للحصول على صورة غير مشوهة (المرجع). (ب) صورة برايتفيلد لخلية واحدة قبل إضاءة الليزر للأشعة فوق البنفسجية A. الوسط: الصورة المشرقة لخلية واحدة بعد إضاءة الليزر بالأشعة فوق البنفسجية A. اليمين: قوة الجر من MEF واحد التمسك فيبروكتين المغلفة PA هيدروجيل (E = 5.74 كيلو باسكال) مضيئة مع شعاع الأشعة فوق البنفسجية قطرها 50 ميكرومتر (خط أحمر متقطع). (ج) إلى اليسار: تسجيل قوى الجر لمجموعة من الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF) التمسك الفيبروكتين micropatterned (دائرة، قطر 100 ميكرومتر). وقد أضاءت الكتلة مع 200 ميكرومتر قطر الأشعة فوق البنفسجية ضوء شعاع (خط أحمر متقطع). اليمين: تسجيل قوى الجر لمجموعة من الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF) التمسك فيبروكتين micropatterned (دائرة، قطرها 300 ميكرومتر). وقد أضاءت الكتلة مع 300 ميكرومتر قطر الأشعة فوق البنفسجية ضوء شعاع (خط أحمر متقطع). شريط المقياس = 200 ميكرومتر (D,E) زيادة في الإجهاد التأكسدي في الخلايا التي تشير إليها زيادة كثافة إشارة Cy5 بعد اكتشاف جرعة ليزر عالية من الأشعة فوق البنفسجية-A عن طريق المجهر الفلوري. الإجهاد التأكسدي يؤدي إلى موت الخلية. شريط المقياس = 200 ميكرومتر (F) إلى اليسار: خريطة حرارة الإجهاد من مجموعة من الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF) التي تلتزم بالفيبروكتين المفرغ (دائرة قطرها 100 ميكرومتر). اليمين: خريطة حرارة الإجهاد من مجموعة من الخلايا الليفية الجنينية للفأرة (MEF) التي تلتزم بالفيبروكتين المفرغ (دائرة، قطرها 300 ميكرومتر). (G) خلايا MEF التمسك 100 ميكروباترن فيبروكتين فيبروكتين الإفراج ببطء الجر بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ألف. يتم تحقيق الإصدار الكامل بعد 15 دقيقة (تم التقاط الصورة المرجعية بعد ذلك 15 دقيقة بعد التعرض). (ح) مقارنة مع التربسين التقليدية القائمة على TFM لخلايا MEF التمسك قطرها 300 ميكرومتر منقوشة فيبروكتين. نتيجة إضاءة الأشعة فوق البنفسجية A (6000 مجم / مم2) تليها 15 دقيقة في الانتظار غير مختلفة بشكل كبير عن علاج التريبسين التقليدي (أي 0.05٪ لمدة 20 دقيقة). أشرطة تظهر يعني S.E.M. (اثنين الذيل الطالب تي اختبار، **** P < 0.0001، * P < 0.05، ns P ≤0.5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>أكريلاميد (٪)</td>
			<td>بيس أكريلاميد (٪)</td>
			<td>أكريلاميد من محلول الأسهم 40 ٪ (مل)</td>
			<td>بيس أكريلاميد من محلول الأسهم 2 ٪ (مل)</td>
			<td>الماء (مل)</td>
			<td>معامل يونغ (kPa)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>8.5</td>
			<td>5,74 ± 0,53</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.15</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.75</td>
			<td>8</td>
			<td>9,69 ± 0,68</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.3</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>7.25</td>
			<td>11,33 ± 1,06</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: مخاليط محلول مخزون هيدروجيل والمرونة الناتجة
يتم إيداع جميع البيانات في مستودع بيانات الوصول المفتوح لجمعية ماكس بلانك (إدموند) ويمكن الوصول إليها من خلال العنوان التالي: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy at JoVE.com

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

يتم الجمع بين الطباعة الحجرية القريبة من الأشعة فوق البنفسجية والمجهر قوة الجر لقياس القوى الخلوية على الهيدروجيلات micropatterned. يتيح الإطلاق الموجه للخلايا المفردة الناجم عن الضوء عددا كبيرا من القياسات على نفس العينة.

التحكم في الالتصاق الخلية باستخدام تقنيات النقش هيدروجيل للتطبيقات في المجهر قوة الجر

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

الهدف العام لهذا الإجراء هو تصنيع الهيدروجيلات الدقيقة النقش لدراسات المجهر قوة الجر 2D. ويتم ذلك أولا عن طريق جعل زلة غطاء زجاجي ميثاكريلاتيد وتشكيل الطبقة الأولى من هيدروجيل البولي أكريلاميد على ذلك. الخطوة الثانية هي إنشاء طبقة هيدروجيل أخرى تحتوي على حبات فلورية للفحص المجهري لقوة الجر.يقع الهيدروجيل مع زلة غطاء نمط صغير فوقه ، مما يؤدي إلى نقل بروتينات مصفوفة النمط الدقيق على سطح الهيدروجيل. بعد ذلك ، يتم ترك هيدروجيل البولي أكريلاميد للبوليمرات في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. ثم تتم إزالة زلة الغطاء العلوي بعناية.يستخدم التصوير المجهري الفلوري لإظهار وجود الخرز والنقل الناجح لبروتينات المصفوفة خارج الخلية المنقوشة الدقيقة. تساعد هذه الطريقة على قياس العديد من قوى الجر بكفاءة ودقة باستخدام الضوء واستخدام إطلاق الخلايا. مما يجعل من الممكن الحصول على عدد أكبر من المراقبة التجريبية من نفس العينة.لذا إثبات الإجراء سيكون جويل كريستيان، طالب دراسات عليا من مختبري. أضف 10 ملليلترات من الماء المقطر المزدوج إلى كوب. بعد, إضافة 18.75 ملليلتر من حمض الخليك, 18.75 ملليلتر من 3-بروبيل ميثاكريلات و 252.5 ملليلتر من الإيثانول إلى الحل.عندما يكتمل الحل، قم بنقله إلى طبق بلوري. خذ 24 ملليمترا من قسائم الغطاء المستدير، وانظفها بمسح دقيق، ووضعها في رف تفلون مخصص. ثم تزج في الحل واحتضان لمدة 15 دقيقة.خذ الحامل وشطفه بالإيثانول. جفف الغطاء ينزلق تحت تدفق الهواء. يمكن تخزين قسائم الغطاء الميثاكريلاتية لمدة تصل إلى شهر واحد في درجة حرارة الغرفة.خذ زلة غطاء دائرية عيار 15 ملليمتر ووضعها على طبق بيتري. استخدم قلم ألماس لوضع علامة على الجانب العلوي من قسيمة الغطاء. ثم انتقل إلى التنظيف عن طريق علاج بلازما الأكسجين.زلة الغطاء نظيفة في 0.4 ملليبار و 200 واط لمدة دقيقتين. ماصة 100 ميكرولتر من 0.01٪ من محلول بولي-إل-ليسين على سطح الغطاء زلة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الغطاء ب 10 ملليمولار عند رقم PH 8.5.إخراج السائل الزائد، ولكن الحفاظ على السطح الرطب. ماصة 100 ميكرولتر من 50 ملليغرام لكل ملليلتر من mPEG-SVA في 10 ملليمولار درجة الحموضة 8.5 الحل على سطح زلة الغطاء واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، شطف الغطاء زلات مع 10 ملليمولار الحموضة 8.5.ثم أضف اثنين من ميكرولتر من هلام PLPP تليها 40 ميكرولتر من الإيثانول على السطح. إمالة بلطف طبق بيتري لتجانس الحل. انتظر لمدة خمس دقائق للحل للاستقطاب.ضع الغطاء ينزلق داخل حفرة أسفل 35 ملليمتر طبق بيتري. وضع طبق بيتري التي تحتوي على زلة الغطاء على خشبة المسرح المجهر. ضبط التركيز على سطح الزجاج.تحميل وقفل نمط مرسومة مسبقا. بدء النقش بجرعة الأشعة فوق البنفسجية من 30 ملليجول لكل ملليمتر مربع. بعد الانتهاء من خطوة النقش، أخرج زلة غطاء النمط وشطف السطح مع برنامج تلفزيوني.احتضان العينة مع خليط 100 ميكرولتر من 25 ميكروغرام لكل فيبروكتين ملليلتر و 25 ميكروغرام لكل ملليلتر الفيبرينوجين المترافق مع اليكسا 488 حل في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. لإعداد ركيزة الهيدروجيل، ابدأ بوضع الغطاء الميثاكريلاتي في طبق بيتري. للبدء، قم بإعداد محلول AgA المؤأكسد الطازج بإضافة 9.55 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج إلى أنبوب فالكون 15 ملليلتر.ثم أضف 0.5 ملليلتر من AgA. ثم أضف 42 ملليغرام من الصوديوم ميتا بيروفاتي إلى الحل. وضع الحل على شاكر لمدة أربع ساعات.ثم إعداد محلول المخزون عن طريق خلط الأكريلاميد، بيس أكريلاميد، والمياه المقطرة مزدوجة وفقا للجدول 1. يمكن الاحتفاظ بحل المخزون لمدة تصل إلى عام عند أربع درجات مئوية. إعداد حل العمل للطبقة السفلية عن طريق خلط 99.3 ميكرولتر من محلول المخزون مع 0.5 ميكرولتر من كبريتات الأمونيوم 1٪ و 0.2 ميكرولتر من TEMED.خذ 10 ميكرولتر من الحل وماصة قطرة الحكمة على زلة غطاء الميثاكريلاتي. ضع بعناية زلة غطاء دائري من عيار 15 ملليمترا على القطرة وانتظر 45 دقيقة حتى يبوليمر. بعد ذلك، افصل زلة الغطاء العلوي بالمشرط.ثم إعداد حل العمل للطبقة العليا عن طريق خلط 93.3 ميكرولتر من محلول المخزون مع واحد MICROLITER مؤأكسدة HEA، خمسة حبات الفلورسنت ميكرولتر، 0.5 ميكرولتر من كبريتات الأمونيوم 1٪ و 0.2 ميكرولتر من TEMED. اتخاذ خمسة ميكرولتر من الحل وماصة انها قطرة الحكمة على هيدروجيل الطبقة السفلى. ضع بعناية زلة غطاء نمط صغير على القطيرات.انتظر 45 دقيقة حتى يبوليمر. فصل بلطف زلة الغطاء مع مشرط. والغراء الغطاء زلة على الجزء السفلي من لوحة مخصصة حفر ستة آبار.إضافة برنامج تلفزيوني إلى الآبار. لرؤية الخلايا، يستنشق برنامج تلفزيوني من لوحة من ستة آبار. بالنسبة للخلايا الليفية، أضف نسبة عالية من الجلوكوز DMEM تحتوي على L-glutamine وتكملها ب 10٪ FPS و1٪ بنسلين وستريبتومايسين.احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تشغيل ثاني أكسيد الكربون والتدفئة لمرحلة المجهر. ثم قم بتشغيل المجهر ووضع لوحة البئر على المسرح.إعداد نمط الإضاءة ووضع علامة على الخلايا ذات الاهتمام. إعادة التركيز على سطح الهيدروجيل. الحصول على صورة الخلايا في قناة برايتفيلد.لالتقاط صورة الخرز في الحالة المشوهة، انتقل إلى القناة. ثم التبديل إلى قناة الليزر وإلقاء الضوء على الخلية وفقا لنمط لمدة ثلاث دقائق. وهذا يتوافق مع جرعة من 6000 ملليجول لكل ملليمتر مربع.بعد ذلك، قم بتبديل القناة والحصول على صورة الخرز في الحالة غير المتشكلة. لحساب قوى الجر، افتح صور حبة الفلورسنت التي تم تصحيحها بالفعل للانجراف الجانبي. يتم تفصيل التحليل الكامل لقوى الجر في النص المرفق.وللتحقق من التصاق الخلايا الانتقائي بالمناطق المنقوشة على سطح الهيدروجيلات، صورت العينات بالمنظار المجهري الفلوري باستخدام بروتينات مصفوفة تحمل علامات مسبقة وبمنظار دقيق من برايتفيلد لتصور الخلايا. وتباينت الخصائص الميكانيكية للهيدروجيلات البولي أكريلاميد عن طريق خلط كميات مختلفة من الأكريلاميد والبيس أكريلاميد. تم تقييم صلابة الهيدروجيل مع تجارب المسافات البادئة النانوية عن طريق المجهر القوة الذرية.وأجريت قياسات قوة الجر بعد تطبيق المكانية، التي تسيطر عليها زمنيا، والإضاءة شعاع الليزر فوق البنفسجي لإلقاء الضوء بشكل انتقائي مناطق بحجم ميكرون من هيدروجيل البولي أكريلاميد. وأعيد بناء قوى الجر باستخدام نظامية FTTC مع معلمة تنظيم اختارها التحقق من صحة الصليب المعمم. نهجنا وحدات نموذج على أساس المجهر قوة الجذب جنبا إلى جنب مع الضوء واستخدام الإفراج عن الخلايا الصغيرة نمط متعدد الاستخدامات ويمكن أن تستخدم أكثر مع المجهر الأخرى وإعداد التصوير لتحسين دقتها وحساسيتها.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

مع تدبير هيدروجيل Bilayered التحكم ASC التمايز

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

تصور منظمة اللحاء وحيوية في الكائنات الدقيقة، وذلك باستخدام المجموع الإسفار التأمل الداخلي المجهر

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

القبض في وقت واحد في الوقت الحقيقي الصور في قناتين الانبعاثات باستخدام نظام تقسيم كاميرا مزدوجة الانبعاثات: تطبيقات لخلية التصاق

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

طريقة مبتكرة لإضفاء الطابع المحلي على مراسل نيون الخرز بالقرب من سطح الثقافة الخليوي لقوة الجر المجهري

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

باستخدام الممانعة الخلوي الركيزة ويعيش التصوير خلية قياس التغييرات في الوقت الحقيقي في التصاق الخلوية ودي التصاق المستحث بواسطة مصفوفة تعديل

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

الزخرفة البروتينات النشطة بيولوجيا أو الببتيدات على استخدام الكيمياء الضوئية للتطبيقات البيولوجية المائية

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

زخرفه هندسه مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية علي ركائز متوافقة للتحكم في ميكانيكا مستوي الانسجه

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

تصنيع وتنفيذ منصة المجهر قوه السحب المرجعية الحرة

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...