Name: control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy
Uploaded: 2022-01-29T14:00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy at JoVE.com

我们感谢丽贝卡·阿尔瓦拉多夫人对协议视频制作的支持，并感谢斯蒂芬·卡萨莱先生对手稿的建设性批评。我们感谢马克斯普朗克医学研究所细胞生物物理系的同事所做的有益讨论。从Max-Planck-Gesellschaft到E.A.C.-A.的财政支持。和Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG SFB1129，Projektnummer 240245660，P15至E.A.C.-A.和P4至U.S.S.;DFG EXC 2082/1-390761711 至 美国）也得到了极大的认可。J.B. 感谢卡尔蔡司基金会的财政支持。E.A.C-A.，C.S.和USS.承认通过德国联邦教育和研究部（BMBF）支持的Max Planck School Matter to Life提供资金。C.S.由欧洲研究理事会（Consolidator Grant PHOTOMECH，编号：101001797）提供支持。

1. 甲基丙烯酸化盖玻片的制备
注意：玻璃盖玻片经过甲基丙烯化，以共价连接PA水凝胶，从而防止它们在与细胞孵育期间分离。显微镜玻璃盖玻片用于实现高图像质量。
<ol><li>要制备300 mL溶液，请取一个干净的400 mL玻璃烧杯，并将其放入通风橱中。</li>
	<li>将 10 mL 双蒸馏水 （ddH2O） 加入烧杯中。使用血清学移液器加入18.75毫升乙酸（≥99.8%pro分析），18.75毫升3-（三甲氧基硅基）甲基丙烯酸丙酯和252.5毫升乙醇（≥99.8%每人）。将溶液倒入结晶皿中。</li>
	<li>用精密擦拭巾清洁 24 mm 圆形玻璃盖玻片。将盖玻片放入定制的聚四氟乙烯架中。</li>
	<li>将机架浸入溶液中，并在室温（RT）下孵育15分钟。</li>
	<li>拿起架子，用乙醇冲洗所有盖玻片（每年99.8%）。在气流下干燥盖玻片。 注意：甲基丙烯酸盖玻片可在室温下储存长达1个月。</li>
</ol>2. 玻璃盖玻片上细胞外基质蛋白的微图案化
注意：玻璃盖玻片首先涂有一层分子，由蛋白质和细胞驱虫剂组成。然后使用光模式技术去除该层，以允许随后在微图案区域中沉积细胞外基质蛋白。
<ol><li>取一个15毫米的圆形玻璃盖玻片，并将其放在培养皿上。使用钻石笔在盖玻片的上侧做标记。然后， 通过 0.4 mbar和200 W的氧气等离子体处理进行清洁2分钟。</li>
	<li>在每个盖玻片的表面上移取100μL0.01%聚-L-赖氨酸溶液。在室温下孵育30分钟，用10mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）pH 8.5洗涤盖玻片。去除任何多余的液体，但保持表面湿润。</li>
	<li>将100μL50mg / mL聚乙二醇甲醚琥珀酰戊酸（mPEG-SVA）移液在每个盖玻片表面的10mM HEPES pH 8.5中。在室温下孵育1小时，用10 mM HEPES pH 8.5冲洗盖玻片，并在气流下干燥。</li>
	<li>将2μL紫外线敏感光引发剂（例如PLPP凝胶）加入40μL乙醇（≥99.8%年率）到表面上。为了获得凝胶和乙醇在表面上的均匀分布，请轻轻地来回倾斜培养皿。等待5分钟，使溶液聚合。</li>
	<li>将单个盖玻片放在底部有20毫米孔的35毫米培养皿内。这使得来自下方的激光束直接到达玻璃表面。</li>
	<li>打开显微镜和光图案化模块（只有在激光安全官员进行安全介绍后才允许使用此设备）。在20倍空气物镜上校准UV-A激光器。将带有光引发剂的样品放在载物台上。调整玻璃表面的焦点并打开对焦控制。加载并锁定预绘制的图案。<ol>
<li>使用像Inkscape这样的图形软件准备图案。确保图案文件不超过 DMD 尺寸 （1824 x 1140 px，对应于 20 x 镜头上的 552 x 325 μm （0.28 μm/px））。 注意：建议使用 DMD 大小（1824 x 1140 像素）作为图案文件大小，因为这将确保在图案化过程中不会出现错误。例如，不要生成尺寸为 1830 x 1130 像素的图案文件。</li>
		<li>为了将图案转移到聚丙烯酰胺，请确保图案化仅达到从玻璃中心到边缘半径的60%-70%。</li>
		<li>对于单个细胞的图案化，使用直径为50-100μm，图案之间的距离为100μm，细胞组的直径为150-300μm。适当的图案大小在很大程度上取决于典型的细胞大小，并且它必须足够大才能使细胞粘附。</li>
	</ol>
</li>
	<li>通过30 mJ / mm 2的紫外线剂量开始图案化。阵列化持续时间取决于模式的数量。制作单个图案大约需要1秒。</li>
	<li>完成图案化步骤后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗表面三次。用100μL溶解在1x PBS中的25μg/ mL纤连蛋白和25μg/ mL纤维蛋白原Alexa488偶联物在PBS中孵育样品1小时。对于其他ECM蛋白，找到完全覆盖图案化区域的最佳浓度。</li>
	<li>用 1 倍 PBS 冲洗表面三次。确保图案玻璃立即用于玻璃-PA转印。在水凝胶制备过程中，将图案玻璃储存在室温下的PBS中。</li>
</ol>3. 图案化聚丙烯酰胺水凝胶的制备
注意：制备聚丙烯酰胺水凝胶，包括氧化的N-羟乙基丙烯酰胺（HEA），以呈现用于基质蛋白在表面上共价结合的反应性醛基团。此外，仅将荧光珠嵌入在水凝胶顶层的双层方法用于改善牵引力显微镜实验期间微球位移的记录。
<ol><li>将甲基丙烯酸化玻璃盖玻片放入培养皿中。</li>
	<li>为了制备新鲜的氧化HEA溶液，将9.55mL双蒸馏水加入15mL离心管中。然后，加入0.5毫升HEA和42mg钙（元）周长酸钠，得到10毫升溶液。在黑暗中连续搅拌溶液4小时。</li>
	<li>根据 表1将丙烯酰胺，双丙烯酰胺和双蒸馏水混合，以获得10mL储备溶液水凝胶（在通风橱下进行，单体具有神经毒性）。脱气并关闭盖子以密封。 注意：储备溶液可以在4°C下等分试样中保存长达1年。 在使用前始终表征水凝胶的杨氏模量。</li>
	<li>准备双层PA水凝胶（在通风橱下进行，单体具有神经毒性）。<ol>
<li>从底层开始，在1.5 mL管中轻轻混合99.3μL储备溶液，0.5μL1%过硫酸铵（APS）和0.2μL四甲基乙二胺（TEMED）。从溶液中取出10μL，并将其滴取到甲基丙烯酸盖玻片的中心。</li>
		<li>小心地将15毫米圆形盖玻片放在液滴上，等待45分钟聚合。用手术刀轻轻拆下顶部盖玻片。</li>
		<li>对于顶层，将93.3μLof储备溶液与1μL新鲜氧化HEA溶液，5μL荧光珠（对于200nm尺寸的微珠，相当于每平方微米3个珠子），0.5μL1%APS和0.2μLTEMED在1.5 mL管中混合。从溶液中取出5μL，并将其滴取到已经聚合的底层的中心。</li>
		<li>轻轻地将微图案盖玻片放在液滴上。在室温下等待45分钟，使液滴聚合。确保图案的一面接触到液滴。用手术刀轻轻拆下盖玻片。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用双组分硅胶将 24 mm 盖玻片粘在定制钻孔 6 孔板的底部。5分钟后，将PBS添加到孔中。</li>
	<li>通过原子力显微镜（AFM）表征聚丙烯酰胺水凝胶样品的杨氏模量。<ol>
<li>在AFM支架上安装球形尖端悬臂。</li>
		<li>通过获取硬基板（例如玻璃或云母）上的力-距离曲线（3-4 V设定值）来校准每个悬臂，推断悬臂灵敏度，从表面缩回，并执行热调谐以获得其弹簧恒定。</li>
		<li>将校准的悬臂放在水凝胶样品上，并使用以下参数在PBS缓冲液中获取力曲线：20-30 nN力设定点，5或10μm / s接近和缩回速度，5μm斜坡尺寸。 注：使用配备空气40倍物镜和绿色荧光蛋白（GFP）滤光片的倒置光学显微镜来可视化和靶向PA水凝胶样品中的ECM微图案区域。</li>
		<li>使用AFM分析软件绘制采集的力与距离曲线。</li>
		<li>找到接触点并将力与距离曲线转换为力与压痕曲线。</li>
		<li>使用介于 0.2 和 0.5 之间的泊松比，使用赫兹模型（或与尖端几何形状函数的合适力学模型）拟合曲线的压痕部分。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 通过UV-A激光照明（LUVI-TFM）局部释放细胞牵引力
注意：UV-A激光用于释放位于水凝胶定义区域的细胞中的牵引力。UV-A激光器（即λ = 375 nm固态激光器，<15 mW）是3B级激光器。非屏蔽激光束对眼睛很危险，而且通常对皮肤也很危险。反射和散射的光和辐射可能是危险的。此外，紫外线辐射可能导致皮肤癌。只有在激光安全官员进行安全介绍后，才允许使用设备。
<ol><li>从井中吸出PBS。</li>
	<li>在生长培养基中每6孔板接种3×10 6 个细胞。对于成纤维细胞，使用含有L-谷氨酰胺的高葡萄糖Dulbecco改性鹰培养基（DMEM），并补充10%胎儿牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。将细胞在37°C / 5%CO 2下孵育过夜。在开始显微镜检查之前，清洗样品以除去漂浮的细胞。</li>
	<li>打开显微镜孵育室和供气，以获得37°C的温度和5%的CO2 气氛。</li>
	<li>打开显微镜和激光图案化模块。如有必要，请使用莱昂纳多软件在20倍空气物镜上重新校准UV-A激光器。将带有样品的定制6孔板放在载物台上。调整 PA 表面的焦点。</li>
	<li>设置照明模式并标记感兴趣的单元格。重新聚焦在水凝胶的表面。获取明场通道中细胞的图像。切换到Cy5通道（远红滤光片，650 nm激发，670 nm发射）并拍摄变形状态下的珠子图像。</li>
	<li>切换到激光通道。打开激光3分钟。在我们的特定设置中，这相当于6，000 mJ / mm2的轻剂量。</li>
	<li>切换到Cy5通道并获取处于未变形状态的珠子的图像。 注意：对于使用小鼠胚胎成纤维细胞的实验，等待暴露后15分钟以记录参考/未变形的图像（参见 代表性结果 部分）。对于其他类型的细胞，它可能有所不同。对另一个感兴趣的单元格再次重复步骤 4.5-4.7。</li>
	<li>要测量UV-A照明后升高的氧化应激，请使用市售试剂（CellRox）。CellRox在还原状态下是非荧光的，当被活性氧物质氧化时，发出荧光的最大发射波长约为665nm。</li>
	<li>根据提供的实验方案，将5μM试剂加入成像培养基中，并在37°C / 5%CO2下孵育30分钟。然后，用温热的1x PBS洗涤细胞3x并更换成像培养基。使用类似的光照在UV-A照明之前和之后通过荧光成像记录Cy5信号。</li>
</ol>5. 图像处理、粒子图像测速和牵引力计算
注：通过分析荧光珠的位移来记录细胞牵引力，并使用基于粒子图像测速的图像分析工具进行计算。
<ol><li>使用斐济打开荧光珠图像，在激光之前（即变形）和激光之后（即未变形）。将两个图像合并为一个堆栈（图像|堆栈|要堆叠的图像）。</li>
	<li>使用StackReg插件（P. Thévenaz，瑞士洛桑联邦理工学院）纠正两个图像之间的横向漂移。将图像更改为 8 位（图像|类型|8 位）并重新缩放到 1024 x 1024 像素（图像|规模）。另存为图像序列（TIFF 格式），参考图像始终位于开头。</li>
	<li>使用互相关技术19 从 OpenPIV 项目中实现的 PIV 场获取位移矢量场。<ol>
<li>确保松散（未变形）图像和变形图像被大小为 wR 和 wD（以像素为单位）的搜索窗口覆盖。对于每个搜索窗口，使用以下公式定义一个互相关函数： <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq01.jpg"> 在这里，R（i，j）和D（i，j）描述了截断到所选搜索窗口并随后进行镜像填充的两个图像的强度场。<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq02.jpg">并<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq03.jpg">描述其平均值。窗口大小选择为 wR = 32 和 wD = 32，相邻搜索窗口之间使用 70% 的重叠。</li>
		<li>对于每个搜索窗口，确定一个位移向量，该位移向量 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq04.jpg"> 优化了互相关函数并分配给搜索窗口的中心位置。子像素精度是使用围绕最大值区域的高斯拟合获得的，如所述20。</li>
		<li>查找并删除不明确的位移矢量。对应于搜索窗口的位移向量，其中互相关函数的两个最高局部最大值之间的比率低于阈值 1.5 被视为模棱两可21。</li>
		<li>丢弃未通过残差阈值 1.522 的归一化中位数检验的位移向量。</li>
		<li>（可选）通过从所有位移中减去固定矢量 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq05.jpg"> 来校正剩余的横向漂移。这样做是因为远离像元的选定区域中的位移消失了。</li>
		<li>使用三次多项式插值将生成的位移矢量场插入到输入图像间距为 4 px 的常规网格。使用平滑二元样条外推法填充缺少的数据点。以像素为单位的位移矢量与图像像素比的局部变形有关（20x空气镜头为0.33μm/ px）。</li>
		<li>（可选）镜像填充图像以减少后续分析中的振铃伪影。</li>
		<li>将变形场乘以 Tukey 窗口函数，以消除由于漂移校正而导致的边缘效应，参数为 0.2-0.3。在这个实验中，位于FOV中心的微图案区域是有趣的。</li>
	</ol></li>
	<li>使用正则化傅里叶变换牵引细胞术 （FTTC）重建牵引 18.作为正则化，我们使用最简单的合理选择，即0阶 吉洪诺夫（L2）正则化23，24，25。选择最佳正则化参数 λ，使其最小化由 26 定义的广义交叉验证 （GCV） 函数： <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq06.jpg"> 此处 τλ 是一个堆叠向量，其中包含所有傅里叶采样模式的给定值 λ 的重建牵引场的 x 和 y 分量，G 是线性算子，将牵引场映射到其相应的位移场，如 FTTC 所定义的那样。总和在矢量分量上运行。ui 是所有傅里叶采样模式的位移场的 x 和 y 分量。GCV广泛用于不良反问题领域，是TFM中经常使用的L曲线准则的良好替代方案。Lanzcos滤波器用于减少由于频率空间有限和位移场升采样而引入的伪影。牵引力计算取决于PA的杨氏模量（例如，11.3 kPa）和泊松比（例如，对于PA，在0.2和0.5之间，取决于交联剂浓度）。</li>
</ol>

<ol>
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作者没有什么可透露的。

在该协议中，我们描述了含有荧光珠的微图案PA水凝胶的制备，其用作TFM研究的基准标记。我们的方法基于三个步骤：1）制备双层PA水凝胶;2）ECM蛋白的微图案化及其转移到水凝胶表面;3）使用图案化的近紫外光进行TFM。分析细胞对基板的牵引力的实验设置需要使用具有已知刚度值的线性弹性材料来计算与荧光珠位移相关的力26。PA水凝胶易于制备，刚度易于调整，通常用于刚度传感和TFM18，28。然而，为了获得整个水凝胶的可重复聚合时间和均匀聚合，应注意试剂的储存条件和时间，例如，应将APS保存在干燥器中以避免失去其活性;应保护TEMED免受直射光的影响。使用氧化HEA允许基质蛋白在水凝胶表面上共价结合，这可能有利于实现完整和稳定的蛋白质层的形成。每次制造PA水凝胶时，氧化的HEA溶液都应新鲜制备。双层PA水凝胶具有三个主要优点：1）它提供了一种替代方法，可以在水凝胶表面附近可重复地获得丝状珠的均匀分布，而无需使凝胶变得非常薄（即<20μm）。控制水凝胶厚度对于使用TFM获得准确的测量结果至关重要。当弹性基板太薄时，强贴壁细胞（如成纤维细胞）可能会感知并机械地响应下面的刚性玻璃基板29，30。厚水凝胶使力重建的图像采集更具挑战性。此外，考虑到用于附着水凝胶的玻璃基板的额外厚度，许多显微镜将没有足够的空间容纳它们，除非使用超薄显微镜载玻片。2）在双层PA水凝胶中，PA水凝胶表面附近丝状微球的均匀分布是在不使用离心机的情况下实现的，而是通过简单孵育精确量的水凝胶溶液和荧光珠来实现的。在执行PIV分析时，高磁珠密度具有显着的优势，因为它增加了牵引力的分辨率和信噪比，而无需共聚焦显微镜。3） 将磁珠限制在靠近细胞-材料界面的薄层中，可以使用落射荧光显微镜和共聚焦显微镜对牵引力进行成像。在制备水凝胶时，用户应确保其牢固地粘附在底部玻璃上，然后再继续执行协议的后续步骤。我们建议遵循水凝胶层聚合指示的孵育时间，因为可能很难在不损坏水凝胶表面的情况下去除表面顶部的玻璃。
测量弹性性能的最知名技术是AFM，纳米压痕，拉伸试验和流变测量。然而，纳米压痕会在材料上引起非常高的应变，从而影响弹性性能的测定。另一方面，拉伸试验和流变测量是宏观测量技术，而细胞在微观尺度上相互作用31，32。AFM允许在生理条件下以减少菌株的微尺度测量。如果缺少实验细节（例如，压痕力和速度）或记录的数据不足，AFM测量的可靠性可能会受到不利影响27。Huth等人描述了一种从AFM数据中提取杨氏模量的算法，该算法强调保持测量细节恒定27。该算法提供了对杨氏模量的精确和可靠的测定，并用于我们的实验。此外，我们在不同日期制造的样品上测量了许多曲线，并获得了非常相似的结果（约1-2 kPa的平均值的变化）。这表明可以可靠地预测我们凝胶的刚度。
在该协议中，我们使用光图案模块在玻璃上创建微图案区域，然后将其转移到水凝胶表面。该协议中所示的微图案基于基于DMD（数字微镜器件）的无掩模近UV光刻（λ = 375 nm）7。DMD由芯片上的大量微镜组成。单个像素对应于单个微镜。来自计算机的像素化图案图像文件通过DMD投影，并使用物镜聚焦在表面上。对于蛋白质的微图案化，聚焦激光用于在光引发剂的帮助下切割驱虫性聚合物刷。之后，暴露的区域充满ECM蛋白。这种无掩模烧蚀方法在设计新图案时提供了极大的灵活性，因为它不依赖于光掩模的使用。设计和应用模式非常简单，因为使用像Inkscape这样的免费软件只需要几分钟。然而，在短时间内产生的图案和样品的数量是一个主要缺点，因为这种方法每次只能用于图案化单个基板。光模式模块使用发射几毫瓦的近紫外固态激光源。非屏蔽激光束对眼睛和皮肤是危险的。反射和散射的光和辐射也可能是危险的。处理必须附有激光官员的安全说明。使用光图案模块时，协议中最关键的步骤是确保在微图案化和烧蚀过程中，激光正确聚焦在表面上。在图案化过程中，紫外线的一致照射剂量（强度乘以时间）取决于激光在表面上聚焦的方式。由于聚焦不良而导致表面强度较弱可能导致ECM转移到水凝胶表面的失败，从而导致没有细胞附着在水凝胶上。
在TFM实验中，在贴壁细胞和基准标记物的初始成像之后，通过胰蛋白酶处理将细胞从PA水凝胶中释放出来以记录其放松状态。执行此步骤的缺点是在显微镜载物台上处理样品。如果没有灌注室，打开培养皿的盖子，吸出培养基，冲洗和移液胰蛋白酶溶液对初学者和有经验的用户来说都是一个挑战。事实上，这些程序是 xyz 轴漂移的主要来源，导致位置和焦点的损失。我们的局部紫外线照明协议使TFM成为初学者更容易获得的技术。应该注意的是，我们使用的是市售的基于显微镜的无掩模光图案模块，但原则上可以使用任何UV-A照明系统，最终与掩模结合使用以保护基板的区域，其中不应记录细胞牵引力。用大量低波长可见光（例如，激发DAPI发射的紫光）暴露细胞将导致氧化应激增加，这可能导致光毒性和细胞死亡。因此，该技术甚至可以应用于没有紫外激光模块的落射荧光显微镜。然而，由于强度要弱得多，在这种情况下，用酶处理完成TFM会容易得多。
使用LUVI-TFM，由于单个细胞或小组细胞的局部分离，可以使用相同的样品进行多次测量。但是，应注意选择要分离的单元，以避免来自相邻单元的记录力。因此，对于没有微图案的单细胞测量，应避免拥挤的区域;对于单个微图案细胞的测量，图案设计应使单个结构之间的距离至少是图案区域直径的两倍。我们还建议不要按顺序使用来自相邻模式的细胞，而是从底物上的远处区域采样它们。我们的测量在配备聚焦控制功能和40 x air NA = 0.9透镜的落射荧光显微镜上进行，其中透镜的工作距离足够长，并且从一个孔到另一个孔的快速移动是高度可调的。用于TFM应用的细胞靶向分离对于测量单个细胞或整个小细胞簇（例如，直径达300μm）的细胞力是有效的。使用我们的设置，我们观察到单个细胞UV处理的细胞舍入和脱离（图3A），而小细胞簇很少发生脱离。这可能导致对细胞牵引力的低估。对于较大的细胞簇，建议进行酶分离，因为用户应使用20倍空气物镜对整个细胞簇进行成像，并且需要聚焦控制功能。由于20倍空气镜头的焦深要长得多，因此处理将不如高倍率物镜那么重要。用户应确保正确设置了用于细胞消融的焦点，因为照明剂量取决于表面上的激光聚焦。虽然我们意识到由于与相邻未处理的细胞可能存在机械相互作用，因此在细胞集合体中使用LUVI-TFM可能存在局限性，但这一方面实际上对于靶向细胞挤出机制的研究很有用，例如，来自上皮单层。
总之，通过我们的TFM方法与微图案细胞的光诱导释放相结合，我们提供了一种强大且高通量的方案来测量细胞粘附力。这种方法的多功能性可以通过显微镜和成像设置进一步利用，旨在提高分辨率和灵敏度。

当与细胞外环境相互作用时，贴壁细胞施加的力主要由基于整合素的局灶性粘连介导，将细胞外基质（ECM）连接到肌动蛋白细胞骨架。局灶性粘连是多蛋白组件，其中心是整合素与ECM蛋白（如纤连蛋白和胶原蛋白）的结合。整合素聚集和局灶性粘连的生长不仅对于建立机械稳定的连接至关重要，而且对于招募其他局灶性粘附蛋白也至关重要，包括那些激活RhoA途径以调节细胞收缩力的蛋白1。肌动蛋白细胞骨架的RhoA依赖性收缩性允许细胞在底层ECM上扩散和迁移，并感知其刚度2。牵引力的分布很大程度上取决于细胞的扩散面积和形状，两者都依赖于基质特性，因此会影响细胞骨架组织，最终在基质力学和细胞骨架组织之间形成一个闭合的反馈回路3，4。
表面微图案技术允许通过创建呈现ECM粘合蛋白的微米级区域来定义对细胞形状的控制;根据这些区域的大小，单个细胞或粘附在微模式上的细胞组5。ECM蛋白可以通过不同的方法在玻璃基板上进行图案化，例如微接触打印，照片图案化或激光图案化6。紫外光（λ = 185 或 375 nm）与表面防污策略相结合，为设计不同形状和尺寸以及固定多种蛋白质类型提供了灵活性，并具有高精度的近表面边缘7，8。涂有驱蛋白化学品（如聚乙二醇（PEG））的区域使用铬光掩模或基于数字镜面设备（DMD）的无掩模光刻系统进行保护。面罩中的图案允许暴露在紫外线下的区域，然后用ECM蛋白质进行图案化。使用ECM蛋白对水凝胶表面进行图案化需要一个转移步骤，以从玻璃表面去除蛋白质并将其交联到图案上。或者，可以通过首先用驱虫蛋白涂覆光掩模，然后使用深紫外光照射燃烧未掩模的区域来实现软材料的图案化。由于深紫外光产生臭氧并使表面对蛋白质结合具有反应性，因此未屏蔽的区域涂有ECM蛋白，最后凝胶直接聚合在未屏蔽区域的顶部9，10。
图案化水凝胶可用于执行TFM，这是一种测量细胞 - 材料界面处细胞力的技术11。在2D-TFM中，人们使用厚聚合物薄膜的平坦表面，其中嵌入标记珠以跟踪变形12，13，14，15。为了提取位移矢量，必须将两个图像（一个变形状态和一个无变形的参考图像）组合在一起。然后，通过图像处理将两个图像映射到彼此上。在高标记密度下，这通常使用粒子图像测速（PIV）来完成，这是一种重建流体动力流动的成熟方法。在低标记密度和3D-TFM中，这通常使用粒子跟踪测速（PTV）来完成，其中包括实验数据集的特定特征。计算成本更低的替代方案的一个例子是光流，例如Kanade-Lucas-Tomasi（KLT）算法16。在水凝胶底物的情况下，荧光珠通常在材料聚合过程中以高密度嵌入，并且在酶分离时记录细胞释放之前和之后的图像。贴壁细胞的酶促脱离，例如，通过胰蛋白酶消化，导致同时从水凝胶上的所有细胞释放细胞牵引，使得难以从大量细胞中获得详细的分析。
在这里，我们提出了一种制备微图案水凝胶以控制细胞形状和定位的方案，以及一种使用UV将单个细胞从底物中分离的连续有效测量牵引力的方法。对于牵引力测量，我们提出了一种生产双层PA水凝胶的技术，其中荧光珠仅嵌入顶层，这增加了它们的密度并减少了它们的垂直扩散。将紫外线介导的细胞牵引力释放与微模式相结合，使得可以获得对细胞脱离的空间控制（例如，单个细胞而不影响感兴趣区域中其他细胞的粘附），前提是图案化细胞之间有足够的距离。然后使用最有效和最可靠的2D-TFM方法重建细胞牵引，即具有正则化的傅里叶变换牵引细胞术（FTTC）17，18。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>#440159</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>#33209</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %</td>
			<td>#1610140</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>#CP-CONT-BSG-A-G</td>
			<td>NanoAndMore</td>
			<td>5 &#956;m spherical tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system</td>
			<td>#NanoWizard3</td>
			<td>JPK</td>
			<td>Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>#A3678</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2 %</td>
			<td>#1610142</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#C11440-42U30</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#ANDORZYLA4.2</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox</td>
			<td>#C10422</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom incubator chamber</td>
			<td></td>
			<td>EMBLEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>#1300 100</td>
			<td>Picodent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>#41965</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Eclipse Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Axiovert200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>#9065.3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>#S181T</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>#F13191</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Alexa488 conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>#F1141</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8805</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (365/415)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8848</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (505/515)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8810</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (580/605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8807</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (660/680)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 15 mm round</td>
			<td>#41001115</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 24 mm round</td>
			<td>#41001124</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>#MRH08230</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>20x air NA 0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td>#CRL-2991</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>#MPEG-SVA-5000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxyethyl acrylamide</td>
			<td>#697931</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>#100-E</td>
			<td>TePla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>#PLPPgel</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>#P4823</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)</td>
			<td>#PLL(20-g[3.5]-PEG(2)</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium(meta) periodate</td>
			<td>#S1878</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>#17919</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Pattening module</td>
			<td>#PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVO cleaner</td>
			<td>#342-220</td>
			<td>Jelight</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy

牵引力显微镜（TFM）是机械生物学中用于测量细胞力的主要方法。这通常用于粘附在平坦软基板上的细胞，这些基质在细胞牵引（2D-TFM）下变形。TFM依赖于线性弹性材料的使用，例如聚二甲基硅氧烷（PDMS）或聚丙烯酰胺（PA）。对于PA上的2D-TFM，实现高通量的困难主要是由于电池形状和牵引力的较大可变性，需要标准化。我们提出了一种方案，用于快速有效地制造用于2D-TFM研究的微图案PA水凝胶。微图案首先通过使用近紫外光的无掩模光刻法创建，其中细胞外基质蛋白仅与微图案区域结合，而表面的其余部分对于细胞保持非粘附性。细胞外基质蛋白的微模式化是由于活性醛基团的存在，导致不同形状的粘附区域以适应单个细胞或细胞组。对于TFM测量，我们使用不同弹性的PA水凝胶，通过改变丙烯酰胺和双丙烯酰胺的量并跟踪嵌入荧光珠的位移，以使用正则化的傅里叶变换牵引细胞术（FTTC）重建细胞牵引场。
为了进一步精确记录细胞力，我们描述了使用受控剂量的图案化光在单个细胞或细胞组的定义区域中释放细胞牵引力。我们称这种方法为局部紫外照明牵引力显微镜（LUVI-TFM）。通过酶处理，所有细胞同时从样品中分离出来，而使用LUVI-TFM可以按顺序记录样品不同区域的细胞的牵引力。我们证明了该协议的适用性（i）研究细胞牵引力作为对底物的受控粘附的函数，以及（ii）从同一样品中获得更多的实验观察结果。

PA水凝胶在甲基丙烯酸化玻璃盖玻片上聚合，其存在用于PA共价键的反应基团。通过这种方式，当将水凝胶置于水溶液中时，可以防止它们从底物上分离（图1A-D）。为了在水凝胶表面附近获得高密度的基准标记物，我们开发了双层PA水凝胶的制备方法。在没有任何荧光珠的情况下，在甲基丙烯酸盖玻片上聚合的底层。随后，在底层顶部聚合另一层含有珠子的层（图1E-H），取代了沉淀的需要，沉淀通常用于在单个焦平面上实现珠子分布并增加微珠密度。为了在TFM测量期间实现对细胞形状的控制，我们通过直接将纤连蛋白图案化的微观结构从玻璃盖玻片转移到预聚合的PA来生产微图案化的PA水凝胶（图1F-F'）。在顶部水凝胶层溶液中添加1%的非常规交联剂（氧化HEA）可提供与纤连蛋白的胺基共价结合的醛基。
我们制备了PA水凝胶，其厚度约为60μm，并且在靠近水凝胶表面的上层中具有密闭的荧光珠。这种类型的水凝胶是使用倒置显微镜对细胞牵引物进行成像的合适基板，并且足够厚（据报道，进行TFM的最小厚度为20-30μm）18 以防止玻璃基板的任何冲击。通过共聚焦显微镜对荧光珠的定位进行成像（图1I）。为了可视化水凝胶上的蛋白质转移，我们使用荧光标记的ECM蛋白并通过落射荧光显微镜对其进行成像（图1J）。我们制备了直径为100μm（左侧）和50μm（右侧）的纤连蛋白微图案圆，以允许细胞群或单细胞的粘附，如贴壁细胞的明亮场图像覆盖所示，以及荧光标记的丝状珠和纤连蛋白微图案。在不同的样品上，通过间接免疫荧光显微镜验证了单细胞对微图案纤连蛋白的粘附反应，以成像paxillin等局灶性粘附蛋白的定位（图1K）。
ECM蛋白包衣和水凝胶刚度都是细胞粘附的关键参数26。为了表征我们的PA水凝胶的机械性能，我们通过AFM27结合落射荧光显微镜进行了纳米压痕实验。使用我们的设置制备并测试了三种不同刚度的水凝胶底物（图2 和 表1）。球形AFM悬臂被周期性地接近并从未图案的PA水凝胶和纤维蛋白原中缩回到Alexa488微图案区域，同时记录力 - 距离曲线。随后，赫兹模型的接触点评估和应用使我们能够估计每个样品的杨氏模量（E）。ECM微图案化没有改变杨氏模量，其与每个未模式化的PA水凝胶相当。
为了测量贴壁细胞在底物上施加的牵引力，我们开发了一种基于参考的TFM的实验设置，该实验设置在配备近紫外激光模块（UV-A 6000 mJ / mm2）的宽视场荧光显微镜上进行，以释放细胞牵引力（图3A）。由于激光束照明可以时空控制，因此不仅可以选择性地以高激光剂量暴露单个细胞或细胞簇，而且更重要的是，不再需要使用胰蛋白酶等消化酶从整个样品中去除细胞的破坏性中间步骤。具有如此高激光剂量的发光细胞诱导升高的氧化应激导致细胞死亡（图3B）。细胞死亡产生从底物释放牵引力，如磁珠位移所示（如图3A所示）。我们将UV-A照明与光图案化模块相结合，以选择性地照亮PA水凝胶的微米级区域（图3B-C）。通过这种方式，可以释放微图案细胞簇（图3C，F）或单个细胞（图3B）的牵引力。重要的是，在我们的时间尺度上，ECM图案化水凝胶的机械性能没有受到紫外线照射的显着影响（图2C）。氧化应激的增加如图3D，E所示。通过使用正则化FTTC重建牵引力，并通过广义交叉验证选择正则化参数（图3B，F）。单个细胞的力释放发生在15分钟的时间内，LUVI-TFM的结果与基于胰蛋白酶的TFM相当（图3G-H）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig01.jpg"> 图1：用于TFM的图案化纤连蛋白底物制备方案 （A）将底层的溶液移液在甲基丙烯酸化表面上。（B）将较小的清洁盖玻片小心地放置在液滴上。（C）凝胶化时间为45分钟（D）顶部盖玻片分离。底层已准备就绪。（E）将顶层的溶液移液在水凝胶上。（F）将图案盖玻片小心地放置在液滴上。（F'）玻璃上粘附蛋白的微图案化是通过无掩模的近UV光刻法产生的，然后从玻璃转移到PA水凝胶中。粘合蛋白的游离胺基团，例如纤连蛋白，与PA表面上的醛基共价结合。（G）凝胶化时间为45分钟（H）顶部盖玻片分离。图案化的PA水凝胶已经准备好了。（I） 共聚焦 xyz 显微图的 3D 表示，显示表面附近高密度的基准微球。（J）PA表面上荧光标记的纤连蛋白（洋红色）的显微照片，嵌入荧光珠（绿色），覆盖有细胞的明亮场图像。（K）附着在圆形纤连蛋白微模式（100μm）上的单个细胞的间接免疫荧光显微镜成像。细胞核（蓝色），帕西林（红色）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig02.jpg"> 图2：通过AFM表征样品机械性能。 （A）原子力显微镜纳米压痕实验装置。球形悬臂用于在紫外线处理之前或之后探测ECM微图案，以及双层PA（5%丙烯酰胺，0.3%双丙烯酰胺）区域的非图案区域。（B）ECM微图案的代表力与压痕曲线（黑色）。赫兹拟合（红色）用于计算样本的杨氏模量（E）。（C） 紫外线-A暴露后对非图案化双层PA区域（无ECM）、ECM微图案和ECM微图案进行机械测量。条形图显示均值± S.E.M（Brown-Forsythe 和 Welch 方差分析检验）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig03.jpg"> 图 3.局部紫外A照明TFM（LUVI-TFM）可在大视场内进行局部牵引力测量。 （A）局部紫外-A照明全聚焦测量法的方案。用高剂量的UV-A激光处理细胞以获得未变形的（参考）图像。（B）紫外-A激光照射前单个电池的明场图像。中：UV-A激光照射后单个电池的明场图像。右图：单个MEF的牵引力附着在用直径为50μm的紫外光束（红色虚线）照射的纤连蛋白包被PA水凝胶（E = 5.74 kPa）上。（C）左：记录附着在微图案纤连蛋白（圆形，直径100μm）上的一簇小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的牵引力。用直径为200μm的紫外光束（红色虚线）照亮簇。右图：记录附着在微图案纤连蛋白（圆形，直径300μm）上的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）簇的牵引力。用直径为300μm的紫外光束（红色虚线）照亮簇。比例尺= 200μm.（D，E）在荧光显微镜检测到高UV-A激光剂量后，细胞中氧化应激的增加由Cy5信号强度增加所指示。氧化应激导致细胞死亡。比例尺= 200μm.（F）左：来自一簇小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的应力热图，附着在微图案化纤连蛋白（圆形，直径100μm）上。右图：来自一簇小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的应激热图，附着在微图案化纤连蛋白（圆形，直径300μm）上。（G）粘附在100μm纤连蛋白微模式上的MEF细胞在UV-A暴露后缓慢释放其牵引力。15分钟后实现完全释放（然后在曝光后15分钟拍摄参考图像）。（H）与传统的胰蛋白酶基TFM的MEF细胞的比较，粘附在300μm直径的图案化纤连蛋白上。UV-A照明（6，000 mJ / mm2）然后等待15分钟的结果与传统胰蛋白酶处理（即20分钟0.05%）没有显着差异。条形显示 S.E.M. 的均值（双尾学生 t 检验，****P < 0.0001，* P < 0.05，ns P ≤0.5）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>丙烯酰胺（%）</td>
			<td>双丙烯酰胺（%）</td>
			<td>来自40%储备溶液的丙烯酰胺（毫升）</td>
			<td>来自2%储备溶液的双丙烯酰胺（毫升）</td>
			<td>水（毫升）</td>
			<td>杨氏模量（千帕）</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>8.5</td>
			<td>5，74 ± 0，53</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.15</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.75</td>
			<td>8</td>
			<td>9，69 ± 0，68</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.3</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>7.25</td>
			<td>11.33 ± 1.06</td>
		</tr>
</tbody></table>表1：水凝胶储备溶液混合物和由此产生的弹性
所有数据都存放在马克斯普朗克学会（Edmond）的开放获取数据存储库中，可以通过以下地址访问：https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

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Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

结合近紫外光刻和牵引力显微镜来测量微图案水凝胶上的细胞力。单细胞的靶向光诱导释放可以对同一样品进行大量测量。

使用水凝胶图案化技术控制细胞粘附，用于牵引力显微镜的应用

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

该程序的总体目标是制造用于2D牵引力显微镜研究的微图案水凝胶。这是通过首先制作甲基丙烯酸玻璃盖玻片并在其上形成聚丙烯酰胺水凝胶的第一层来实现的。第二步是创建另一个含有荧光珠的水凝胶层，用于牵引力显微镜检查。水凝胶夹在上面，上面有一个微图案盖滑，导致微图案基质蛋白在水凝胶表面上的转移。接下来，将聚丙烯酰胺水凝胶留在室温下聚合45分钟。然后小心地取下顶盖衬。荧光显微镜成像用于显示微珠的存在和微模式细胞外基质蛋白的成功转移。这种方法有助于通过使用光和利用细胞的释放来有效和精确地测量几种牵引力。使得从同一样品中获得更多数量的实验观察结果成为可能。因此，演示该程序的将是Joel Christian，我实验室的研究生。将10毫升双蒸馏水加入烧杯中。之后，向溶液中加入18.75毫升乙酸，18.75毫升3-丙基甲基丙烯酸酯和252.5毫升乙醇。溶液完成后，将其转移到结晶皿中。取24毫米圆形盖玻片，用精密擦拭干净，然后放入定制的特氟龙架中。然后将其浸入溶液中并孵育15分钟。拿起架子，用乙醇冲洗。干燥盖子在气流下滑动。甲基丙烯酸化盖玻片可在室温下储存长达一个月。拿一个15毫米的圆形盖玻片，把它放在培养皿上。使用钻石笔在盖玻片的上侧做标记。然后通过氧气等离子体处理进行清洁。盖玻片在 0.4 毫巴和 200 瓦时保持清洁状态，持续两分钟。将100微升0.01%的聚-L-赖氨酸溶液移取到盖子滑移的表面上，并在室温下孵育30分钟。之后，用10毫摩尔的pH值以8.5的pH值清洗盖玻片。取出多余的液体，但保持表面湿润。将100微升每毫升mPEG-SVA的50微升移液在10毫摩尔pH 8.5溶液中移取到盖子的表面上，并在室温下孵育一小时。之后，用10毫摩尔pH 8.5冲洗盖子。然后将两微升PLPP凝胶，然后加入40微升乙醇到表面上。轻轻倾斜培养皿以均质溶液。等待五分钟，让溶液两极分化。将盖玻片放入 35 毫米底孔培养皿内。将装有盖玻片的培养皿放在显微镜载物台上。调整玻璃表面的焦点。加载并锁定预绘制的图案。通过紫外线剂量开始图案化，每平方毫米30毫焦耳。完成图案化步骤后，取出图案盖滑移并用PBS冲洗表面。用每毫升25微克纤连蛋白和每毫升25微克纤维蛋白原的100微升混合物孵育样品，并与Alexa 488偶联，在室温下溶解在PBS中一小时。要制备水凝胶底物，首先将甲基丙烯酸盖玻片放入培养皿中。首先，通过将9.55毫升双蒸馏水加入15毫升Falcon管中来制备新鲜的氧化AgA溶液。然后加入0.5毫升AgA。然后将42毫克偏丙酮酸钠加入溶液中。将溶液放在摇床上四小时。然后根据表1通过混合丙烯酰胺，双丙烯酰胺和双蒸馏水来制备储备溶液。储备溶液可以在四摄氏度下保存长达一年。通过将99.3微升的储备溶液与0.5微升的1%过硫酸铵和0.2微升的TEMED混合来制备底层的工作溶液。从溶液中取出10微升，然后滴落移液到甲基丙烯酸盖玻片上。小心地将15毫米圆形盖玻片放在液滴上，等待45分钟使其聚合。接下来，用手术刀拆下顶盖滑。然后通过将93.3微升的储备溶液与一微升氧化HEA，五微升荧光珠，0.5微升1%的过硫酸铵和0.2微升的TEMED混合来制备顶层的工作溶液。从溶液中取出五微升，并将其滴落到底层水凝胶上。小心地将微图案盖玻片放在液滴上。等待45分钟，让它聚合。用手术刀轻轻拆下盖玻片。并将盖子滑钉粘在定制的钻孔六孔板的底部。将 PBS 添加到孔中。要看到细胞，请从六孔板中吸出PBS。对于成纤维细胞，加入含有L-谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM，并补充10%FPS和1%青霉素和链霉素。将细胞在37摄氏度和5%CO2下孵育过夜。打开CO2和显微镜载物台的加热装置。然后打开显微镜并将孔板放在载物台上。设置照明模式并标记感兴趣的单元格。重新聚焦在水凝胶的表面。获取明场通道中细胞的图像。要拍摄处于变形状态的珠子的图像，请切换到通道。然后切换到激光通道，并根据图案照亮细胞三分钟。这相当于每平方毫米6， 000毫焦耳的剂量。之后，切换通道并获取处于未变形状态的珠子的图像。要计算牵引力，请打开已针对横向漂移进行校正的荧光珠图像。引力的完整分析详见随附的脚本。为了验证细胞对水凝胶表面上微图案区域的选择性粘附，使用预标记的基质蛋白用荧光显微镜对样品进行成像，并用明场显微镜观察细胞。聚丙烯酰胺水凝胶的力学性能通过混合不同量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺而改变。通过原子力显微镜的纳米压痕实验评估了水凝胶的刚度。在应用空间，时间控制的紫外线激光束照明以选择性地照亮聚丙烯酰胺水凝胶的微米级区域后，进行牵引力测量。通过使用正则化FTTC和广义交叉验证选择的正则化参数来重建牵引力。我们基于吸引力显微镜结合光和使用微图案细胞释放的模型模块化方法是多功能的，可以与其他显微镜和成像设置进一步利用，以提高其分辨率和灵敏度。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

工程双层凝胶控制升序分化

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

科研

生物工程

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

皮层组织和动态可视化的微生物，利用全内反射荧光显微镜

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

同时捕获实时图像在两个发射通道采用了双摄像头发射分光系统：应用到细胞粘附

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

新方法本地化记者荧光珠近细胞培养表面的牵引力显微镜

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

使用Cell-基板阻抗和活细胞成像，以衡量矩阵修改诱导实时变化的细胞粘附和去粘附

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

原子力显微镜成像和支持的脂质双层力谱

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

用于细胞培养应用光介导的形成和构图的水凝胶

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

生物活性蛋白或多肽在水凝胶上的应用

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

在符合标准的基质上对人类胚胎干细胞菌落的几何结构进行模式化，以控制组织级力学

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

无参考牵引力显微镜平台的制造和实施

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...