Name: control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy
Uploaded: 2022-01-29T14:00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy at JoVE.com

Vi takker Fru Rebecca Alvarado for støtten i protokollen video produktion og Mr. Stephen Casale for konstruktiv kritik af manuskriptet. Vi takker kollegerne fra Institut for Cellulær Biofysik, Max Planck Institute for Medical Research for de nyttige diskussioner. Den finansielle støtte fra Max-Planck-Gesellschaft til E.A.C.-A. og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15 til E.A.C.-A. og P4 til USA; DFG EXC 2082/1-390761711 til USA) er også meget anerkendt. J.B. takker Carl Zeiss Foundation for økonomisk støtte. E.A.C.-A., C.S. og USA anerkender finansiering gennem Max Planck School Matter to Life støttet af det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (BMBF). C.S. støttes af Det Europæiske Forskningsråd (Consolidator Grant PHOTOMECH, nr. 101001797).

1. Tilberedning af methacrylerede dæksler
BEMÆRK: Glasdæksler er methacryleret for at forbinde PA hydrogels og forhindrer derfor deres løsrivelse under inkubationen med celler. Mikroskop glas coverslips bruges til at opnå høj billedkvalitet.
<ol><li>Hvis du vil forberede en 300 mL-opløsning, skal du tage et rent 400 mL glasbæger og placere det inde i en røghætte.</li>
	<li>Tilsæt 10 mL dobbelt destilleret vand (ddH2O) i bægerglasset. Der tilsættes 18,75 ml eddikesyre (≥99,8% proanalyse, p.a.), 18,75 ml 3(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat og 252,5 ml ethanol (≥99,8% p.a.) ved hjælp af en serologisk pipette. Hæld opløsningen i en krystalliseringsskål.</li>
	<li>Rengør 24 mm runde glasdæksler med præcisionsservietter. Placer dækslerne i et specialfremstillet polytetrafluorethylenstativ.</li>
	<li>Sænk stativet i opløsningen og inkuber i 15 min ved stuetemperatur (RT).</li>
	<li>Tag stativet og skyl alle coverlips med ethanol (99,8% p.a.). Tør dækslerne under luftstrømmen. BEMÆRK: Methacrylerede coverslips kan opbevares i op til 1 måned på RT.</li>
</ol>2. Mikromaling af ekstracellulære matrixproteiner på glasovertræk
BEMÆRK: Glasdæksler er først belagt med et lag af molekyler, der består af protein og celleafvisende. Dette lag fjernes derefter ved hjælp af en fotopatteringsteknik for at tillade efterfølgende aflejring af ekstracellulære matrixproteiner i mikropatternedområder.
<ol><li>Tag en 15 mm rund glas coverlip og læg den på en Petri skål. Brug en diamantpen til at markere oversiden af dækslet. Fortsæt derefter til rengøring via iltplasmabehandling ved 0,4 mbar og 200 W i 2 min.</li>
	<li>Pipette 100 μL af 0,01% poly-L-lysinopløsning på overfladen af hvert dæksel. Inkuberes i 30 min ved RT. Vask dækslerne med 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES) pH 8.5. Fjern overskydende væske, men hold overfladen våd.</li>
	<li>Pipette 100 μL på 50 mg/mL poly(ethylenglycol) methylether succinimidyl valersyre (mPEG-SVA) i 10 mM HEPES pH 8,5 på overfladen af hvert coverlip. Inkuber i 1 time ved RT. Skyl dækslerne med 10 mM HEPES pH 8.5 og tør under luftstrømmen.</li>
	<li>Der tilsættes 2 μL UV-følsomme fotoinitiator (f.eks. PLPP-gel) efterfulgt af 40 μL ethanol (≥99,8% p.a.) på overfladen. For at opnå en homogen fordeling af gelen og ethanol på overfladen skal du forsigtigt vippe petriskålen frem og tilbage. Vent i 5 minutter på, at opløsningen polymeriseres.</li>
	<li>Placer en enkelt coverlip inde i en 35 mm Petriskål med et 20 mm hul i bunden. Dette gør det muligt for laserstrålen, der kommer nedefra, at nå glasoverfladen direkte.</li>
	<li>Tænd for mikroskopet og et lysmønstremodul (det er kun tilladt at arbejde med denne enhed efter en sikkerhedsintroduktion fra lasersikkerhedsofficererne). Kalibrer UV-A laser på 20x luft mål. Sæt prøven med fotoinitiatoren på scenen. Juster fokus på glassets overflade, og tænd for fokuskontrollen. Læg og lås det fortegnede mønster.<ol>
<li>Forbered mønsteret ved hjælp af en grafiksoftware som Inkscape. Sørg for, at mønsterfilen ikke overstiger DMD-dimensionerne (1824 x 1140 px, hvilket svarer til 552 x 325 μm på 20 x linse (0,28 μm/px)). BEMÆRK: Det anbefales at bruge DMD-størrelsen (1824 x 1140 pixel) som mønsterfilstørrelse, da dette ikke sikrer nogen fejl under mønstret. Du må f.eks. ikke oprette en mønsterfil med en dimension på 1830 x 1130 pixel.</li>
		<li>Med henblik på mønsteroverførsel til polyacrylamid skal det sikres, at mønstret kun udføres op til 60-70 % af radius fra midten af glasset til kanten.</li>
		<li>Til mønstre en enkelt celle skal du bruge en diameter på 50-100 μm med en afstand på 100 μm mellem mønstre og en diameter på 150-300 μm for en cellegruppe. Den passende mønsterstørrelse afhænger i høj grad af den typiske cellestørrelse, og den skal være tilstrækkelig stor til, at cellerne kan klæbe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Start mønsteret med UV-dosis på 30 mJ/mm2. Mønstrevarigheden afhænger af antallet af mønstre. At lave et enkelt mønster tager ca. 1 s.</li>
	<li>Når mønstertrinnet er afsluttet, skylles overfladen med fosfatbufferet saltvand (PBS) tre gange. Inkuberes prøven med 100 μL på 25 μg/mL fibronectin opløst i 1x PBS og 25 μg/mL fibrinogen Alexa488 konjugat i PBS i 1 time ved RT. For andre ECM-proteiner finder du de optimale koncentrationer, der helt dækker de mønstrede regioner.</li>
	<li>Skyl overfladen med 1x PBS tre gange. Sørg for, at det mønstrede glas straks anvendes til glas-PA overførsel. Opbevar det mønstrede glas i PBS på RT under hydrogelpræparatet.</li>
</ol>3. Fremstilling af mønstrede polyacrylamidhydrogeler
BEMÆRK: Polyacrylamid hydrogeler fremstilles, herunder oxideret N-hydroxyethyl acrylamid (HEA) til at præsentere reaktive aldehydgrupper til kovalent binding af matrixproteiner på overfladen. Derudover bruges en dobbeltlagstilgang til at integrere fluorescerende perler kun på det øverste lag af hydrogelen til at forbedre registreringen af perleforskydning under trækkraftmikroskopiforsøg.
<ol><li>Sæt methacrylated glas coverslips i en Petri parabol.</li>
	<li>For at forberede frisk oxideret HEA-opløsning tilsættes 9,55 mL dobbeltdestilleret vand i et 15 mL centrifugerør. Derefter tilsættes 0,5 mL HEA, og 42 mg natrium (meta)periodate for at få 10 mL af opløsningen. Rør kontinuerligt opløsningen i mørke i 4 timer.</li>
	<li>Bland acrylamid, bis-acrylamid og dobbeltdestilleret vand i henhold til tabel 1 for at få 10 ml lageropløsning hydrogel (gør det under røghætten, monomerer er neurotoksiske). Afgas og lukke låget til en lufttæt forsegling. BEMÆRK: Lageropløsningen kan opbevares i aliquots i op til 1 år ved 4 °C. Altid karakterisere Young's modulus af hydrogel før brug.</li>
	<li>Forbered en dobbeltlags PA hydrogel (gør det under røghætten, monomerer er neurotoksiske).<ol>
<li>Start med det nederste lag ved forsigtigt at blande 99,3 μL lageropløsning, 0,5 μL på 1% ammoniumpersulfat (APS) og 0,2 μL tetramethylethylendiamin (TEMED) i et 1,5 mL rør. Tag 10 μL fra opløsningen og pipette det dropwise på midten af methacrylated coverlip.</li>
		<li>Placer forsigtigt en 15 mm rund coverlip på dråben og vent i 45 minutter på polymerisering. Tag forsigtigt den øverste coverslip med en skalpel.</li>
		<li>For det øverste lag blandes forsigtigt 93,3 μLof lageropløsning med 1 μL frisk oxideret HEA-opløsning, 5 μL fluorescerende perler (svarende til tre perler pr. kvadratmikr til perler af perler på 200 nm størrelse perler), 0,5 μL på 1% APS og 0,2 μL TEMED i et 1,5 mL rør. Tag 5 μL fra opløsningen og pipette det dropwise på midten af den allerede polymeriserede nederste lag.</li>
		<li>Placer forsigtigt den mikropatternede coverlip på dråben. Vent i 45 min på RT for dråben at polymerisere. Sørg for, at den mønstrede side rører dråben. Tag forsigtigt dækslerne af med en skalpel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lim de 24 mm coverslips til bunden af specialboede 6-brøndsplader ved hjælp af tokomponent silikonelim. Efter 5 min tilsættes PBS til brøndene.</li>
	<li>Karakterisere Young's modulus af polyacrylamid hydrogel prøver af atomprøvesprængningen mikroskopi (AFM).<ol>
<li>Monter en sfærisk spids cantilever på AFM holderen.</li>
		<li>Kalibrer hver cantilever ved at erhverve en kraft-afstand kurve (3-4 V setpoint) på et hårdt substrat (f.eks glas eller glimmer), ekstrapolere cantilever følsomhed, trække sig tilbage fra overfladen, og udføre en termisk melodi for at få deres fjeder konstant.</li>
		<li>Placer de kalibrerede cantilevers over hydrogelprøven, og indhent kraftkurver i PBS-bufferen ved hjælp af følgende parametre: 20-30 nN kraftsæt, 5 eller 10 μm/s indflyvning og tilbagetrækningshastighed, 5 μm rampestørrelse. BEMÆRK: Et omvendt optisk mikroskop, der er udstyret med et luft 40x-mål og et grønt fluorescerende proteinfilter (GFP), blev brugt til at visualisere og målrette ECM-mikropatterned områder inden for PA hydrogelprøverne.</li>
		<li>Plot den erhvervede kraft versus afstand kurver med AFM analyse software.</li>
		<li>Find kontaktpunktet, og konverter kraft versus afstandskurver i kraft i forhold til indrykningskurver.</li>
		<li>Sæt indrykningsdelen af kurven med Hertz-modellen (eller en passende mekanikmodel i spidsens funktion) ved hjælp af et Poisson-forhold mellem 0,2 og 0,5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Lokal frigivelse af celle trækkraft kræfter ved UV-A laser belysning (LUVI-TFM)
BEMÆRK: UV-A laser påføres til at frigive trækkraftkræfter i celler lokaliseret i definerede områder af hydrogels. UV-A laser (dvs. λ = 375 nm solid-state laser, <15 mW) er en klasse 3B laser. Den uskærmede laserstråle er farlig for øjnene og ofte for huden. Reflekteret og spredt lys og stråling kan være farligt. Desuden kan UV-stråling forårsage hudkræft. Det er kun tilladt at arbejde med enheder efter sikkerhedsintroduktion fra lasersikkerhedsofficererne.
<ol><li>Aspirere PBS fra brøndene.</li>
	<li>Seed 3 x 106 celler pr. 6-brønds plade i vækstmedium. For fibroblaster skal du bruge høj glukose Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), der indeholder L-glutamin og suppleret med 10% Fosterkvægserum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin. Inkuber cellerne natten over ved 37 °C/5% CO2. Vask prøver for at fjerne flydende celler, før du starter mikroskopi.</li>
	<li>Tænd for mikroskopinkubationskammeret og gasforsyningen for at opnå en temperatur på 37 °C og 5% CO2-atmosfære .</li>
	<li>Tænd mikroskopet og lasermønstremodulet. Hvis det er nødvendigt, skal UV-A-laseren kalibreres igen på 20x-luftmålet ved hjælp af Leonardo-softwaren. Placer den skræddersyede 6-brønds plade med prøverne på scenen. Juster fokus på overfladen af PA.</li>
	<li>Opsætning af belysningsmønsteret, og markér de celler, der er af interesse. Fokuser igen på overfladen af hydrogelen. Hent billedet af cellerne i brightfieldkanalen. Skift til Cy5-kanalen (langt rødt filter, 650 nm excitation, 670 nm emission) og tag et billede af perler i deform tilstand.</li>
	<li>Skift til laserkanalen. Tænd for laseren i 3 min. I vores særlige opsætning svarede dette til en let dosis på 6.000 mJ/mm2.</li>
	<li>Skift til Cy5-kanalen og få et billede af perlerne i udeformeret tilstand. BEMÆRK: For forsøg med museemememinnale fibroblaster skal du vente i 15 min efter eksponering for at registrere referencen/det udeformerede billede (se afsnittet Repræsentative resultater ). Det kan være anderledes for andre typer celler. Gentag trin 4.5-4.7 igen for en eller flere andre celler af interesse.</li>
	<li>For at måle den forhøjede oxidative belastning efter UV-A belysning skal du bruge det kommercielt tilgængelige reagens (CellRox). CellRox er ikke-fluorescerende i reduceret tilstand, og når oxideret af reaktive iltarter, fluorescer med en emission maksimum på ~ 665 nm.</li>
	<li>Ifølge den angivne protokol tilsættes 5 μM reagens i billedmediet og inkuberes i 30 min ved 37 °C/5% CO2. Vask derefter cellerne 3x med varm 1x PBS og udskift billedmediet. Optag Cy5-signalet ved fluorescensbilleddannelse før og efter UV-A-belysning ved hjælp af en lignende lyseksponering.</li>
</ol>5. Billedbehandling, partikelbilled velocimetri og beregning af trækkraftkræfter
BEMÆRK: Celle trækkraftkræfter registreres ved at analysere forskydning af fluorescerende perler og beregnes ved hjælp af billedanalyseværktøjer baseret på partikelbilled velocimetri.
<ol><li>Åbn fluorescerende perler billeder, før (dvs. deforme) og efter laser (dvs. udeformerede) ved hjælp af Fiji. Flette to billeder som én stak (| Stakke | Billeder, der skal stables).</li>
	<li>Korrekt lateral drift mellem de to billeder ved hjælp af StackReg plugin (P. Thévenaz, Schweiziske Federal Institute of Technology Lausanne). Ændre billeder til 8 bit (| Skriv | 8 bit) og skaleres igen til 1024 x 1024 pix (billede | skala). Gem som en billedsekvens (TIFF-format) med referencebilledet altid i begyndelsen.</li>
	<li>Hent forskydningsvektorfeltet ved hjælp af en krydskorrelationsteknik19 fra feltet PIV-feltet som implementeret i OpenPIV-projektet.<ol>
<li>Sørg for, at det afslappede (uformerede) billede og det deforme billede er dækket af søgevinduer af størrelse wR og wD i pixel. For hvert søgevindue skal du definere en krydskorrelationsfunktion ved hjælp af følgende formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq01.jpg"> Her beskriver R(i,j) og D(i,j) intensitetsfelterne for de to billeder, der er afkortet til det valgte søgevindue og efterfølgende spejlspolstret. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq02.jpg"> og <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq03.jpg"> beskrive deres middelværdi. Vinduesstørrelserne vælges til at være wR = 32 og wD = 32, og der bruges et overlap på 70% mellem de nærliggende søgevinduer.</li>
		<li>For hvert søgevindue bestemmes en forskydningsvektor <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq04.jpg"> , der optimerer funktionen til krydskorrelation og tildeles søgevinduets midterposition. Subpixel nøjagtighed opnås ved hjælp af en gaussisk pasform omkring maxima-regionen som beskrevet20.</li>
		<li>Find og fjern tvetydige forskydningsvektorer. Forskydningsvektorer svarende til søgevinduer, hvor forholdet mellem to højeste lokale maksimer for krydskorrelationsfunktionen under en tærskel på 1,5 betragtes som tvetydigt21.</li>
		<li>Kassér forskydningsvektorer, der ikke består den normaliserede mediantest, for en resttærskel på 1.522.</li>
		<li>(Valgfrit) Ret den resterende laterale drift ved at trække en fast vektor <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq05.jpg"> fra alle forskydninger. Dette gøres, fordi forskydningen i et markeret område langt væk fra cellen forsvinder.</li>
		<li>Interpoler det resulterende forskydningsvektorfelt til et almindeligt gitter med afstand på 4 px af inputbillederne ved hjælp af en kubisk polynomisk interpolation. Manglende datapunkter udfyldes ved hjælp af en jævn bivariat spline ekstrapolation. En forskydningsvektor i pixel er relateret til en lokal deformation ved billedets pixelforhold (0,33 μm/px for 20x luftlinse).</li>
		<li>(Valgfrit) Spejl pad billedet for at reducere ringende artefakter i den efterfølgende analyse.</li>
		<li>Multiplicer deformationsfeltet med en Tukey-vinduesfunktion for at eliminere kanteffekten på grund af afdriftskorrektionen med en parameter på 0,2-0,3. I dette eksperiment er det mikropatterned område, der er i centrum af FOV, af interesse.</li>
	</ol></li>
	<li>Rekonstruer trækkraften ved hjælp af legaliseret Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC)18. Som legalisering bruger vi det enkleste rimelige valg, nemlig 0. ordre Tikhonov (L2) legalisering23,24,25. Der vælges en optimal legaliseringsparameter λ, så den minimerer den generelle GCV-funktion (Generalized Cross Validation), der er defineret af26: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq06.jpg"> Her er τλ en stablet vektor, der indeholder x og y komponenterne i det rekonstruerede trækkraftfelt til den givne værdi af λ for alle Fourier-prøvetagningstilstande, og G er den lineære operatør, der kortlægger trækkraftfelter til deres tilsvarende forskydningsfelt som defineret for FTTC. Summen kører over vektorkomponenter. ui er x og y komponenter i forskydningsfeltet for alle Fourier prøvetagningstilstande. GCV er meget udbredt inden for dårligt stillede inverse problemer og er et godt alternativ til L-kurvekriteriet, der ofte anvendes i TFM. Et Lanzcos-filter bruges til at reducere artefakter, der indføres på grund af den begrænsede frekvens og forskydningsfeltets opsampling. Trækkraftberegningen afhænger af Youngs modulus af PA (f.eks. 11,3 kPa) og Poissons forhold (f.eks. for PA i området mellem 0,2 og 0,5 afhængigt af krydslinkerkoncentration).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+neighborhood:+adhesion-coupled+cell+mechanosensors.">Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors.</a> Cell. 110 (2), 139-142 (2002).</li><li>Beningo, K. A., Hamao, K., Dembo, M., Wang, Y. -. l., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+of+fibroblasts+are+regulated+by+the+Rho-dependent+kinase+but+not+by+the+myosin+light+chain+kinase.">Traction forces of fibroblasts are regulated by the Rho-dependent kinase but not by the myosin light chain kinase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 456 (2), 7 (2006).</li><li>Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+traction+force+in+relation+to+cell+shape+and+focal+adhesions.">The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions.</a> Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).</li><li>Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+spread+area+and+traction+forces+determine+myosin-II-based+cortex+thickness+regulation.">Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation.</a> Biochimica Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123, 4201-4213 (2010).</li><li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+printing+by+light-induced+molecular+adsorption.">Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption.</a> Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).</li><li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microtubules: in vivo Methods in Cell Biology. , 133-146 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogel+micropatterning.">Polyacrylamide hydrogel micropatterning.</a> Methods Cell Biology. 120, 93-116 (2014).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Polacheck, W. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell-generated+forces:+a+guide+to+the+available+tools.">Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools.</a> Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1853, 3095-3104 (2015).</li><li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+forces+in+cell+biology.">Quantifying forces in cell biology.</a> Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).</li><li>Hanke, J., Probst, D., Zemel, A., Schwarz, U. S., Koster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+force+generation+by+spreading+platelets.">Dynamics of force generation by spreading platelets.</a> Soft Matter. 14 (31), 6571-6581 (2018).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+particle+image+velocimetry.">Digital particle image velocimetry.</a> Experiments in Fluids. 10, 181-193 (1991).</li><li>Lourenco, L., Krothapalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+accuracy+of+velocity+and+corticity+measurements+with+PIV.">On the accuracy of velocity and corticity measurements with PIV.</a> Experiments in Fluids. 18, 421-428 (1995).</li><li>Adrian, R. J., Westerweel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Particle Image Velocimetry. , (2011).</li><li>Westerweel, J., Scarano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+outlier+detection+for+PIV+data.">Universal outlier detection for PIV data.</a> Experiments in Fluids. 39 (6), 1096-1100 (2005).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+forces+at+focal+adhesions+from+elastic+substrate+data:+the+effect+of+localized+force+and+the+need+for+regularization.">Calculation of forces at focal adhesions from elastic substrate data: the effect of localized force and the need for regularization.</a> Biophysical Journal. 83 (3), 1380-1394 (2002).</li><li>Huang, Y., Gompper, G., Sabass, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bayesian+traction+force+microscopy+method+with+automated+denoising+in+a+user-friendly+software+package.">A Bayesian traction force microscopy method with automated denoising in a user-friendly software package.</a> Computer Physics Communications. 256, 107313 (2020).</li><li>Vedadghavami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+hydrogel+biomaterials+with+controlled+mechanical+properties+for+tissue+engineering+applications.">Manufacturing of hydrogel biomaterials with controlled mechanical properties for tissue engineering applications.</a> Acta Biomaterialia. 62, 42-63 (2017).</li><li>Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+soft+hydrogel+microindentation:+Impact+of+various+indentation+parameters+on+the+measurement+of+Young's+modulus.">Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus.</a> PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).</li><li>Oria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+loading+explains+spatial+sensing+of+ligands+by+cells.">Force loading explains spatial sensing of ligands by cells.</a> Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).</li><li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+cells+feel:+methods+for+thin+gels.">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).</li><li>Sen, S., Engler, A. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+strains+induced+by+cells:+Computing+how+far+cells+can+feel.">Matrix strains induced by cells: Computing how far cells can feel.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 2 (1), 39-48 (2009).</li><li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing.">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Letters. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li><li>Galluzzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+methodology+and+AFMech+Suite+software+for+nanomechanics+on+heterogeneous+soft+materials.">Atomic force microscopy methodology and AFMech Suite software for nanomechanics on heterogeneous soft materials.</a> Nat Communications. 9 (1), 3584 (2018).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

I denne protokol beskriver vi forberedelsen af mikropatterned PA hydrogeler, der indeholder fluorescerende perler, der bruges som fiducial markører til TFM-undersøgelser. Vores tilgang er baseret på tre trin: 1) forberedelse af dual-layered PA hydrogels; 2) mikropattering af ECM-proteiner og deres overførsel til hydrogeloverfladen 3) brug af mønstret nær-UV-lys til TFM. Den eksperimentelle opsætning til at analysere cellegreb til substratet kræver brug af lineære elastiske materialer med kendte stivhedsværdier til at beregne de kræfter, der er relateret til forskydning af de fluorescerende perler26. PA hydrogels er nemme at forberede, stivheden kan let indstilles, og de er almindeligt anvendt til stivhed sensing og TFM18,28. For at opnå reproducerbare polymeriseringstider og homogen polymerisering af hele hydrogelen bør der dog lægges vægt på opbevaring af betingelser og tid for reagenserne, f.eks. TEMED skal beskyttes mod direkte lys. Brugen af oxideret HEA muliggør kovalent binding af matrixproteiner på hydrogeloverfladen, hvilket kan være fordelagtigt at opnå dannelsen af et fuldt og stabilt proteinlag. Den oxiderede HEA-opløsning skal fremstilles frisk, hver gang PA hydrogels fremstilles. Den tolags PA hydrogel tilbyder tre hovedfordele: 1) det giver en alternativ måde at reproducerucibly få en homogen fordeling af fiducial perler nær hydrogel overflade, uden behov for at gøre gelen ekstremt tynd (dvs. <20 μm). Kontrol over hydrogel tykkelse er afgørende for at opnå nøjagtige målinger med TFM. Når det elastiske substrat er for tyndt, kan stærke klæbende celler som fibroblaster fornemme og mekanisk reagere på det underliggende stive glassubstrat29,30. Tykke hydrogels gør billedopsamlingen til kraftrekonstruktionen mere udfordrende. Desuden vil mange mikroskoper ikke have tilstrækkelig plads til at rumme dem, i betragtning af den ekstra tykkelse af glassubstratet, der anvendes til at fastgøre hydrogel, medmindre ultratynde mikroskopi dias anvendes. 2) I den dobbelte LAG PA hydrogel opnås den homogene fordeling af fiducial perler nær overfladen af PA hydrogel uden at bruge en centrifuge, men snarere med en simpel inkubation af præcise mængder hydrogelopløsninger og fluorescerende perler. Høj perletæthed er af væsentlig fordel ved udførelse af PIV-analysen, fordi den øger trækkraftkræfternes opløsning og signal-til-støj-forholdet uden behov for konfokal mikroskopi. 3) Confining perler i et tyndt lag tæt på celle-materiale interface muliggør billeddannelse af trækkraft kræfter med epifluorescence mikroskoper samt confocal mikroskoper. Ved tilberedning af hydrogelen skal brugeren sørge for, at den klæber fast til det nederste glas, før den fortsætter med de efterfølgende trin i protokollen. Vi anbefaler at følge inkubationstiden angivet for polymerisering af hydrogellagene, da det kan være svært at fjerne glasset oven på overfladen uden at beskadige hydrogeloverfladen.
De mest kendte teknikker til at måle elastiske egenskaber er AFM, nanoindentation, trækprøver og rheometri. Nanoindentation fremkalder imidlertid meget høje belastninger på de materialer, der kan påvirke bestemmelse af elastiske egenskaber. Trækprøver og rheometri er derimod makroskopiske måleteknikker, mens celler interagerer på en mikroskopisk skala31,32. AFM tillader målinger på mikroskala med reducerede stammer under fysiologiske forhold. Pålideligheden af AFM-målinger kan påvirkes negativt, hvis der mangler eksperimentelle detaljer (f.eks. indrykningskraft og hastighed), eller hvis der registreres utilstrækkelige data27. Huth et al. beskriver en algoritme til at udtrække Youngs moduli fra AFM-data, som lægger vægt på at holde måledetaljer konstant27. Denne algoritme tilbyder en præcis og pålidelig bestemmelse af Youngs moduli og blev brugt til vores eksperimenter. Derudover målte vi mange kurver på prøver fremstillet på forskellige dage og opnåede meget lignende resultater (variation af gennemsnitsværdier på ca. 1-2 kPa). Dette viser, at stivheden af vores geler pålideligt kan forudsiges.
I denne protokol bruger vi et fotopatterningsmodul til at skabe mikropatterned regioner på glas, som derefter overføres til hydrogeloverfladerne. Den mikropatterning, der er vist i denne protokol, er baseret på DMD (digital mikrospejlsenhed)-baseret maskeløs nær-UV-litografi (λ = 375 nm)7. En DMD består af et stort antal mikromirrorer på en chip. En enkelt pixel svarer til et enkelt mikrospejl. Den pixelerede mønsterbilledfil fra en computer projiceres gennem DMD og fokuseres på overfladen ved hjælp af en objektiv linse. Til mikromaling af proteiner bruges det fokuserede laserlys til at kløve afstødende polymerbørster ved hjælp af en fotoinitiator. Derefter fyldes de udsatte regioner med ECM-proteiner. Denne maskeløse ablationsmetode giver stor fleksibilitet i udformningen af nye mønstre, da den ikke er afhængig af brugen af en fotomaske. Design og anvendelse af et mønster er meget nemt, da det kun tager flere minutter ved hjælp af en freeware som Inkscape. Antallet af mønstre og prøver, der produceres på kort tid, er imidlertid en stor ulempe, da denne metode kun kan bruges til at mønstre et enkelt substrat hver gang. Fotopatterning modulet bruger en nær UV solid-state laser kilde, der udsender flere milliwatt. Den uskærmede laserstråle er farlig for øjne og hud. Reflekteret og spredt lys og stråling kan også være farligt. Håndteringen skal ledsages af en sikkerhedsinstruks fra laserofficerer. Det mest kritiske trin i protokollen, når du bruger et fotobemalingsmodul, er at sikre, at laseren under mikropatterning og ablation er korrekt fokuseret på overfladen. En ensartet belysningsdosis (intensitet ganget med tiden) af UV-lys under mønstre er afhængig af, hvordan laseren er fokuseret på overfladen. En svag intensitet på overfladen på grund af dårligt fokus kan resultere i svigt af ECM overførsel til hydrogel overflade resulterer i ingen celler bliver knyttet til hydrogel.
I TFM eksperimenter, efter den første billeddannelse af klæbende celler og fiducial markører, celler frigives fra PA hydrogel ved trypsin behandling for at registrere deres afslappede tilstand. En ulempe ved at udføre dette trin er håndtering af prøven på mikroskopistadiet. Uden et perfusionskammer udgør åbning af skålens låg, aspirerer medium, skylning og pipetter trypsinopløsning en udfordring for begyndere og erfarne brugere. Faktisk er disse procedurer en vigtig kilde til afdrift i xyz akser, hvilket resulterer i tab af position og fokus. Vores lokale UV-belysningsprotokol gør TFM til en mere tilgængelig teknik for begyndere. Det skal bemærkes, at vi brugte et kommercielt tilgængeligt mikroskopibaseret fotomalingsmodul, men i princippet kunne ethvert UV-A-belysningssystem anvendes, i sidste ende i kombination med en maske for at beskytte områder af substraterne, hvor celletrækkræfter ikke bør registreres. At udsætte celler med en betydelig dosis af lavt bølgelængde synligt lys (f.eks. det violette lys, der ophidser DAPI-emissionen), vil føre til stigende oxidativ stress, hvilket kan resultere i fototoksicitet og celledød. Derfor kan denne teknik anvendes selv i et epifluorescencemikroskop uden et UV-lasermodul. Men da intensiteten er meget svagere, vil det være meget lettere at opnå TFM med den enzymatiske behandling i dette tilfælde.
Med LUVI-TFM er det muligt at anvende den samme prøve til flere målinger på grund af den lokale løsrivelse af enkelte celler eller små grupper af celler. Der bør dog lægges vægt på udvælgelsen af celler til at løsne, for at undgå at registrere kræfter fra tilstødende celler. For enkeltcellemålinger i mangel af mikropatterner bør overfyldte regioner således undgås; til målinger på enkelte mikropatterned celler skal mønstrene udformes således, at afstanden mellem enkelte strukturer er mindst dobbelt så stor som diameteren af det mønstrede område. Vi anbefaler også ikke at bruge celler fra tilstødende mønstre i rækkefølge, men snarere prøveudtagning dem fra fjerne områder på substratet. Vores måling er godt udført på et epifluorescencemikroskop udstyret med en fokuskontrolfunktion og en 40 x luft NA = 0,9 linse, hvor linsens arbejdsafstand er tilstrækkelig lang, og den hurtige bevægelse fra den ene brønd til den anden er meget tunabel. Den målrettede løsrivelse af celler til TFM-applikationer er effektiv til måling af cellulær kraft af en enkelt celle eller af en hel lille celleklynge (f.eks. op til 300 μm i diameter). Ved hjælp af vores opsætning observerede vi celleafrunding og løsrivelse til UV-behandling af enkeltceller (Figur 3A), mens løsrivelse sjældent forekom for små celleklynger. Dette kan føre til en undervurdering af celle trækkraft kræfter. For større celleklynger anbefales enzymatisk løsrivelse, da brugerne skal bruge et 20x luftmål til at afbilde hele klyngen, og der er behov for en fokusstyringsfunktion. Da dybden af fokus for 20x luftlinsen er meget længere, vil håndteringen ikke være så kritisk som den højere forstørrelse mål. Brugeren bør sikre, at fokus er korrekt indstillet til ablation af celler, da belysningsdosis er afhængig af laserfokus på overfladen. Mens vi er opmærksomme på de mulige begrænsninger i brugen af LUVI-TFM i cellekollektiver på grund af mulige mekaniske interaktioner med tilstødende ubehandlede celler, kan dette aspekt faktisk vise sig at være nyttigt til undersøgelser af mekanikken i målrettet celleekstrudering, f.eks. fra epitelmonomer.
Afslutningsvis, med vores TFM-tilgang kombineret med let induceret frigivelse af mikropatterned celler, giver vi en robust og højgennemsigtsprotokol til måling af celle vedhæftningskræfter. Alsidigheden af denne metode kunne udnyttes yderligere ved hjælp af mikroskopi og billeddannelse setup med henblik på at forbedre opløsning og følsomhed.

Når de interagerer med deres ekstracellulære miljø, udøver klæbende celler kræfter, der hovedsageligt medieres af integrinbaserede fokale vedhæftninger, der forbinder den ekstracellulære matrix (ECM) med actin cytoskeleton. Focal vedhæftninger er multiprotein samlinger, der er centreret omkring bindingen af integriner til ECM-proteiner som fibronectin og kollagen. Integrin clustering og vækst af fokale vedhæftninger er afgørende ikke kun for etableringen af en mekanisk stabil forbindelse, men også for rekruttering af andre fokale vedhæftning proteiner, herunder dem, der aktiverer RhoA vej til regulering af cellulære sammentrækning1. Den RhoA-afhængige kontraktilitet af actin cytoskeleton gør det muligt for celler at sprede sig og migrere på den underliggende ECM, og også at fornemme dens stivhed2. Fordelingen af trækkraften afhænger i høj grad af cellernes spredningsområde og form, som begge er afhængige af matrixegenskaber og derfor påvirker cytoskeletal organisation og til sidst danner en lukket feedback loop mellem matrixmekanik og cytoskeletal organisation3,4.
Overflademikrotteringsteknikker giver mulighed for en defineret kontrol af celleformen ved at skabe mikronstore områder, der præsenterer ECM-klæbeproteiner; i henhold til størrelsen af disse områder, enkelte celler eller grupper af celler, der klæber til mikropattern5. ECM proteiner kan mønstres på glas substrater ved forskellige tilgange såsom mikrokontakt udskrivning, foto-mønstre eller laser-mønstre6. Brugen af UV-lys (λ = 185 eller 375 nm) kombineret med overflade antifouling strategier giver fleksibilitet til at designe forskellige former og størrelser og immobilisering af flere proteintyper med en høj præcision nær overfladekanter7,8. De regioner, der er belagt med proteinafvisende kemikalier såsom polyethylenglycol (PEG), er beskyttet med enten en kromfotomaske eller en digital spejlenhed (DMD)-baseret maskefrit litografisystem. Mønstrene i maskerne gør det muligt at blive udsat for UV-lys i regioner, der derefter vil blive mønstret med ECM-proteiner. Mønstret af hydrogeloverflader med ECM-proteiner kræver et overførselstrin for at fjerne proteiner fra glasoverfladen og krydse dem til mønstrene. Alternativt kan mønstre på bløde materialer opnås ved først at overfladebehandling af fotomasken med et afstødende protein, efterfulgt af at brænde de umaskerede områder ved hjælp af dyb UV-belysning. Da dyb UV genererer ozon og gør overfladen reaktiv for proteinbinding, er de umaskerede områder belagt med ECM-proteiner, og endelig polymeriseres gelen direkte oven på de umaskerede regioner9,10.
De mønstrede hydrogeler kan bruges til at udføre TFM, en teknik, der måler cellekræfter ved cellematerialegrænsefladen11. I 2D-TFM bruger man den flade overflade af en tyk polymerfilm, hvor markørperler er blevet indlejret til at spore deformationer12,13,14,15. For at udtrække forskydningsvektorer er det vigtigt at kombinere to billeder, et af deforme tilstand og et referencebillede uden deformationer. De to billeder er derefter knyttet til hinanden med billedbehandling. Ved høj markørtæthed sker dette normalt med Particle Image Velocimetry (PIV), som er en veletableret metode til at rekonstruere hydrodynamisk flow. Ved lav markørtæthed og i 3D-TFM sker dette normalt med Partikelsporing Velocimetri (PTV), som indeholder specifikke funktioner i det eksperimentelle datasæt. Et eksempel på et beregningsmæssigt billigere alternativ er optisk flow, såsom Kanade-Lucas-Tomasi (KLT) algoritme16. I tilfælde af hydrogel substrater er fluorescerende perler normalt indlejret ved høj densitet under materialet polymerisering, og billeder registreres før og efter celle frigivelse ved enzymatisk løsrivelse. Enzymatisk løsrivelse af klæbende celler, f.eks. ved trypsinisering, fører til samtidig frigivelse af cellulære trækkraft fra alle celler på hydrogelerne, hvilket gør det vanskeligt at opnå en detaljeret analyse fra et stort antal celler.
Her præsenterer vi en protokol til at forberede mikropatterned hydrogels til at styre celleform og lokalisering og en metode til effektivt at måle trækkraftkræfter i rækkefølge ved hjælp af UV til at frigøre individuelle celler fra substratet. Til trækkraftmålinger præsenterer vi en teknik til at producere tolags PA hydrogels, hvor fluorescerende perler kun er indlejret i det øverste lag, hvilket øger deres tæthed og reducerer deres lodrette spredning. Ved at kombinere UV-medieret frigivelse af cellulære trækkraftkræfter med mikromaling gør det muligt at opnå rumlig kontrol over celleløsning (f.eks. af enkelte celler uden at påvirke vedhæftningen af andre celler i interesseområdet), forudsat at der er tilstrækkelig afstand mellem mønstrede celler. Cellulær trækkraft rekonstrueres derefter ved hjælp af den mest effektive og pålidelige metode til 2D-TFM, nemlig Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC) med legalisering17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>#440159</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>#33209</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %</td>
			<td>#1610140</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>#CP-CONT-BSG-A-G</td>
			<td>NanoAndMore</td>
			<td>5 &#956;m spherical tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system</td>
			<td>#NanoWizard3</td>
			<td>JPK</td>
			<td>Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>#A3678</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2 %</td>
			<td>#1610142</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#C11440-42U30</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#ANDORZYLA4.2</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox</td>
			<td>#C10422</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom incubator chamber</td>
			<td></td>
			<td>EMBLEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>#1300 100</td>
			<td>Picodent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>#41965</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Eclipse Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Axiovert200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>#9065.3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>#S181T</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>#F13191</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Alexa488 conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>#F1141</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8805</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (365/415)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8848</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (505/515)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8810</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (580/605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8807</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (660/680)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 15 mm round</td>
			<td>#41001115</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 24 mm round</td>
			<td>#41001124</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>#MRH08230</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>20x air NA 0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td>#CRL-2991</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>#MPEG-SVA-5000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxyethyl acrylamide</td>
			<td>#697931</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>#100-E</td>
			<td>TePla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>#PLPPgel</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>#P4823</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)</td>
			<td>#PLL(20-g[3.5]-PEG(2)</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium(meta) periodate</td>
			<td>#S1878</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>#17919</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Pattening module</td>
			<td>#PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVO cleaner</td>
			<td>#342-220</td>
			<td>Jelight</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy

Traction force mikroskopi (TFM) er den vigtigste metode, der anvendes i mekanobiologi til at måle cellekræfter. Almindeligvis bruges dette til celler, der klæber til flade bløde substrater, der deformerer under cellegreb (2D-TFM). TFM er afhængig af brugen af lineære elastiske materialer, såsom polydimethylsiloxan (PDMS) eller polyacrylamid (PA). For 2D-TFM på PA skyldes vanskeligheden ved at opnå høj gennemløb hovedsagelig den store variation af celleformer og trækkraft, der kræver standardisering. Vi præsenterer en protokol til hurtigt og effektivt at fremstille mikropatterned PA hydrogels til 2D-TFM-undersøgelser. Mikropatternerne er først skabt af maskeløs fotolitografi ved hjælp af nær-UV-lys, hvor ekstracellulære matrixproteiner kun binder sig til de mikropatterned regioner, mens resten af overfladen forbliver ikke-klæbende til celler. Mikropattering af ekstracellulære matrixproteiner skyldes tilstedeværelsen af aktive aldehydgrupper, hvilket resulterer i klæbende regioner af forskellige former for at imødekomme enten enkelte celler eller grupper af celler. Til TFM-målinger bruger vi PA hydrogels af forskellig elasticitet ved at variere mængden af acrylamid og bis-acrylamid og spore forskydningen af indlejrede fluorescerende perler til at rekonstruere celle trækkraftfelter med legaliseret Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
For yderligere at opnå præcis registrering af cellekræfter beskriver vi brugen af en kontrolleret dosis mønstret lys for at frigive cellegreb i definerede områder for enkelte celler eller grupper af celler. Vi kalder denne metode lokal UV-belysning trækkraft mikroskopi (LUVI-TFM). Ved enzymatisk behandling afmonteres alle celler fra prøven samtidigt, mens der med LUVI-TFM trækkraft af celler i forskellige områder af prøven kan registreres i rækkefølge. Vi demonstrerer anvendeligheden af denne protokol (i) at studere celle trækkraft kræfter som en funktion af kontrolleret vedhæftning til substratet, og (ii) for at opnå et større antal eksperimentelle observationer fra samme prøve.

PA hydrogels blev polymeriseret på methacrylerede glas coverslips, som præsenterer reaktive grupper for den kovalente sammenkædning af PA. På denne måde blev deres løsrivelse fra substratet forhindret ved placering af hydrogelerne i en vandig opløsning (figur 1A-D). For at opnå en høj densitet af fiducial markører nær hydrogel overflade, vi udviklede udarbejdelsen af en dobbelt-lags PA hydrogel. Det nederste lag, uden fluorescerende perler, blev polymeriseret på methacrylated coverslip. Efterfølgende blev et andet lag indeholdende perler polymeriseret oven på det nederste lag (figur 1E-H), hvilket erstattede behovet for sedimentering, som ofte bruges til at opnå perlefordeling i et enkelt fokalplan og øge perletætheden. For at opnå kontrol over celleform under TFM-målinger producerede vi mikropatterned PA hydrogels via direkte overførsel af fibronectinmønstrede mikrostrukturer fra en glasovertræk til den forpolymererede PA (Figur 1F-F'). Tilsætning af 1% ikke-konventionel crosslinker (oxideret HEA) i den øverste hydrogellagsopløsning giver aldehydgrupper, der kovalent binder sig til amingrupper af fibronectin.
Vi forberedte PA hydrogels, som er ca. 60 μm i tykkelse og begrænsede fluorescerende perler i det øverste lag tæt på hydrogeloverfladen. Denne type hydrogel er et egnet substrat til billeddannelse cellulær trækkraft med omvendte mikroskoper og tyk nok (minimum tykkelse til at udføre TFM er blevet rapporteret til at være 20-30 μm)18 for at forhindre enhver indvirkning af glasset substrat. Lokalisering af de fluorescerende perler blev afbildet ved konfokal mikroskopi (figur 1I). For at visualisere proteinoverførsel på hydrogelen brugte vi fluorescerende mærket ECM-proteiner og afbildede dem ved epifluorescencemikroskopi (Figur 1J). Vi forberedte mikropatterned cirkler af fibronectin med en diameter på 100 μm (venstre side) og 50 μm (højre side) for at tillade vedhæftning af grupper af celler eller enkelte celler, som vist i overlejringen af lyse feltbilleder af klæbende celler, og fluorescerende mærket fiducial perler og fibronectin mikropatterns. På en anden prøve blev vedhæftningsvaret fra enkelte celler til mikropatterned fibronectin valideret ved indirekte immunofluorescencemikroskopi for at afbilde lokaliseringen af fokale vedhæftningproteiner som paxillin (Figur 1K).
Både ECM protein belægning og hydrogel stivhed er afgørende parametre for celle vedhæftning26. For at karakterisere de mekaniske egenskaber af vores PA hydrogels udførte vi nanoindentationsforsøg af AFM27, kombineret med et epifluorescencemikroskop. Hydrogel substrater af tre forskellige stivheder blev forberedt og testet med vores opsætning (figur 2 og tabel 1). Kugleformede AFM cantilevers blev cyklisk nærmet og trukket tilbage fra ikke-asfalterede PA hydrogels og fibrinogen konjugeret til Alexa488-micropatterned områder, mens registrering kraft-afstand kurver. Efterfølgende gav kontaktpunktsevaluering og anvendelse af Hertz-modellen os mulighed for at estimere Youngs modulus (E) af hver prøve. ECM micropatterning ændrede ikke Youngs modulus, som forblev sammenlignelig med hver af de ikke-asfalterede PA hydrogeler.
For at måle trækkraftkræfter udøvet af klæbende celler på substratet udviklede vi en eksperimentel opsætning til referencebaseret TFM udført på et bredfelt epifluorescence mikroskop udstyret med nær UV-lasermodul (UV-A 6000 mJ /mm2) for at frigive cellegreb (Figur 3A). Da laserstråle belysning kan spatio-tidsmæssigt kontrolleret, ikke alene er det muligt at selektivt udsætte en enkelt celle eller en celle klynge med en høj laser dosis, men også og endnu vigtigere, forstyrrende mellemliggende trin celle fjernelse fra hele prøven ved hjælp af et fordøjelsesenzym som trypsin er ikke længere nødvendigt. Oplysende celler med en så høj laserdosis fremkaldte en forhøjet oxidativ stress, der førte til celledød (figur 3B). Celledøden gav frigivelse af trækkraft fra substratet, som angivet ved perleforskydningen (illustreret i figur 3A). Vi kombinerede UV-A belysning med et lys mønster modul til selektivt belyse mikron mellemstore regioner af PA hydrogels (Figur 3B-C). På denne måde er det muligt at frigøre trækkraften i mikropatterned celleklynger (Figur 3C, F) eller enkelte celler (figur 3B). Det er vigtigt, at de mekaniske egenskaber ved ECM-mønstrede hydrogeler på vores tid ikke blev væsentligt påvirket af UV-eksponering (Figur 2C). Stigning i oxidativ stress er vist i figur 3D, E. Trækkraftkræfterne blev rekonstrueret ved hjælp af legaliseret FTTC med en legaliseringsparameter valgt af Generalized Cross Validation (Figur 3B, F). Frigivelsen af kræfter til enkelte celler fandt sted over en periode på 15 min, og resultatet af LUVI-TFM kan sammenlignes med den trypsinbaserede TFM (figur 3G-H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig01.jpg"> Figur 1: Ordning af mønstret fibronectin-substratforberedelse til TFM. (A) Opløsningen til bundlaget ledes på en methacryleret overflade. (B) En mindre ren dæksel er omhyggeligt placeret på dråben. (C) Geleringstiden er 45 min. (D) Den øverste dæksler er løsrevet. Det nederste lag er klar. (E) Opløsningen til det øverste lag ledes på hydrogelen. (F) Den mønstrede coverlip er omhyggeligt placeret på dråben. (F)) Mikropattering af klæbende proteiner på glas produceres af maskeløs nær UV-litografi og overføres derefter fra glas til PA hydrogel. De frie amingrupper af klæbende proteiner, f.eks. fibronectin, binder kovalent til aldehydgrupper på PA-overfladen. (G) Geleringstiden er 45 min. (H) Den øverste dæksel er løsrevet. Den mønstrede PA hydrogel er klar. (I) En 3D-repræsentation af en konfokal xyz mikrograf, der viser en høj densitet af fiducial perler nær overfladen. (J) En mikrograf af fluorescerende mærket fibronectin (magenta) på overfladen af PA med indlejrede fluorescerende perler (grøn), overlejret med et lyst feltbillede af celler. (K) Indirekte immunofluorescencemikroskopibilleddannelse af en enkelt celle, der klæber til en cirkelformet fibronectinmikropattern (100 μm). Kerne (blå), paxillin (rød). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig02.jpg"> Figur 2: Karakterisering af prøvemekaniske egenskaber ved afm. (A) AFM nanoindentation eksperimentel opsætning. En kugleformet cantilever bruges til at sondere ECM-mikropatterner før eller efter UV-behandling og de ikke-mønstrede områder med dobbeltlags PA (5% acrylamid, 0,3% Bis-acrylamid) områder. B) Repræsentativ kraft versus indrykningskurve for ECM-mikropattern (sort). Hertz fit (rød) bruges til at beregne Young's modulus (E) af prøven. C) Mekaniske målinger for ikke-mønstrede pa-områder med to lag (ingen ECM), ECM-mikropattern og ECM-mikropattern efter UV-A-eksponering. Søjlerne viser betyder ± S.E.M. (Brown-Forsythe og Welch ANOVA test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig03.jpg"> Figur 3. Lokal UV-A belysning TFM (LUVI-TFM) muliggør lokale trækkraftmålinger inde i et stort synsfelt. (A) Ordning af lokale UV-A belysning TFM. Celler behandles med en høj dosis UV-A laser for at få det udeformerede (reference) billede. (B) Brightfield-billedet af en enkelt celle før UV-A laserbelysning. Midt: Brightfield-billedet af en enkelt celle efter UV-A laserbelysning. Til højre: Trækkraft af en enkelt MEF klæber til en fibronectin belagt PA hydrogel (E = 5,74 kPa) belyst med en 50 μm diameter UV-lysstråle (rød stiplet linje). (C) Til venstre: Registrering af trækkraftkræfter i en klynge af museememnefobrøster (MEF), der klæber til mikropatterned fibronectin (cirkel, 100 μm diameter). Klyngen blev oplyst med en 200 μm diameter UV-lysstråle (rød stiplet linje). Til højre: Registrering af trækkraftkræfter i en klynge af museememnefobrøster (MEF), der klæber til mikropatterned fibronectin (cirkel, 300 μm diameter). Klyngen blev oplyst med en 300 μm diameter UV-lysstråle (rød stiplet linje). Skalastang = 200 μm. (D,E) En stigning i oxidativ stress i celler, der er angivet ved den øgede Cy5-signalintensitet, efter at en høj UV-A-laserdosis er påvist ved fluorescensmikroskopi. Den oxidative stress fører til celledød. Skalastang = 200 μm. (F) Venstre: Stressvarmekortet fra en klynge af museememnefoblast (MEF), der klæber til mikropatterned fibronectin (cirkel, 100 μm diameter). Til højre: Stressvarmekortet fra en klynge af museememinnale fibroblaster (MEF), der klæber til mikropatterned fibronectin (cirkel, 300 μm diameter). (G) MEF-celler, der klæber til 100 μm fibronectin mikropatterns, frigiver langsomt deres trækkraft efter UV-A-eksponering. Fuld frigivelse opnås efter 15 min (referencebilledet blev derefter taget 15 min post eksponering). (H) En sammenligning med den konventionelle trypsinbaseret TFM for MEF-celler, der klæber til 300 μm diameter mønstret fibronectin. Resultatet af UV-A-belysning (6.000 mJ/mm2) efterfulgt af 15 minutters ventetid er ikke signifikant forskelligt fra den konventionelle trypsinbehandling (dvs. 0,05% i 20 min). Søjlerne viser betyde S.E.M. (to-tailed Student's t-test, **** P < 0,0001, * P < 0,05, ns P ≤0,5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Acrylamid (%)</td>
			<td>Bis-acrylamid (%)</td>
			<td>Acrylamid fra 40 % lageropløsning (ml)</td>
			<td>Bis-acrylamid fra 2 % lageropløsning (ml)</td>
			<td>Vand (ml)</td>
			<td>Young's modulus (kPa)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>8.5</td>
			<td>5,74 ± 0,53</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.15</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.75</td>
			<td>8</td>
			<td>9,69 ± 0,68</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.3</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>7.25</td>
			<td>11,33 ± 1,06</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Hydrogel lageropløsningsblandinger og deraf følgende elasticitet
Alle data er deponeret i Open Access Data Repository of The Max Planck Society (Edmond) og kan tilgås via følgende adresse: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy at JoVE.com

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Nær-UV litografi og trækkraft mikroskopi kombineres for at måle cellulære kræfter på mikropatterned hydrogels. Den målrettede lysinducerede frigivelse af enkelte celler muliggør et stort antal målinger på den samme prøve.

Kontrol af celle vedhæftning ved hjælp af Hydrogel mønstre teknikker til applikationer i Traction Force Mikroskopi

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Det overordnede mål med denne procedure er at fremstille mikro-mønster hydrogels for 2D trækkraft mikroskopi undersøgelser. Dette opnås ved først at gøre en methacrylated glas dække slip og danner det første lag af en polyacrylamid hydrogel på det. Det andet skridt er at skabe en anden hydrogel lag, der indeholder fluorescerende perler til trækkraft mikroskopi.Hydrogelen er klemt med et mikromønsterdæksel på toppen af det, hvilket resulterer i overførsel af mikromønstermatrixproteinerne på hydrogeloverfladen. Dernæst er polyacrylamidhydronagel tilbage til polymerisering ved stuetemperatur i 45 minutter. Den øverste dæksel slip er derefter omhyggeligt fjernet.Fluorescens mikroskopi billeddannelse bruges til at vise tilstedeværelsen af perlerne og den vellykkede overførsel af mikro-mønstrede ekstracellulære matrix proteiner. Denne metode hjælper med effektivt og præcist at måle flere trækkraftkræfter ved hjælp af lys og brug frigivelse af celler. Gør det muligt at opnå et højere antal eksperimentelle observationer fra den samme prøve.Så demonstrere proceduren vil være Joel Christian, en kandidatstuderende fra mit laboratorium. Tilsæt 10 milliliter dobbelt destilleret vand i et bægerglas. Derefter tilsættes 18,75 milliliter eddikesyre, 18,75 milliliter 3-propyl methacrylat og 252,5 milliliter ethanol til opløsningen.Når opløsningen er færdig, overfør den til en krystalliseringsskål. Tag 24 millimeter runde dæksel glider, rense dem med en præcision tørre, og læg dem i en skræddersyet teflon rack. Derefter nedsænkes det i opløsningen og inkuberes i 15 minutter.Tag stativet og skyl det med ethanol. Tør dækslet glider under luftstrømmen. Methacrylerede dæksler kan opbevares op til en måned ved stuetemperatur.Tag en 15-millimeter rund dæksel slip og sæt den på en Petri parabol. Brug en diamantpen til at markere oversiden af dækselslaget. Fortsæt derefter til rengøring via iltplasmabehandling.Dækslet slip er ren ved 0,4 millibar og 200 Watt i to minutter. Pipette 100 mikroliter på 0,01% poly-L-Lysin opløsning på overfladen af dækslet slip og inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter vaskes dækslet slip med 10-millimolar ved en pH på 8,5.Tag den overskydende væske ud, men hold overfladen våd. Pipette 100 mikroliter på 50 milligram pr. milliliter mPEG-SVA i 10 millimolar pH 8,5 opløsning på overfladen af dækslet glider og inkuberes i en time ved stuetemperatur. Derefter skylles dækslet glider med 10-millimolar pH 8,5.Derefter tilsættes to mikroliter PLPP gel efterfulgt af 40 mikroliter ethanol på overfladen. Vip forsigtigt petriskålen for at homogenisere opløsningen. Vent i fem minutter på, at opløsningen polariseres.Placer dækslet slip inde i en 35-millimeter bund hul Petri parabol. Sæt petriskålen, der indeholder dækslet, på mikroskopstadiet. Juster fokus på glassets overflade.Læg og lås det fortegnede mønster. Start mønstret med UV-dosis på 30 millijoule pr. millimeter i anden. Når mønstertrinnet er fuldført, skal mønsterdækslet glide ud og skylle overfladen med PBS.Inkuber prøven med en 100-mikroliter blanding af 25 mikrogram per milliliter fibronectin og 25 mikrogram per milliliter fibrinogen konjugeret med Alexa 488 opløst i PBS i en time ved stuetemperatur. For at forberede hydrogels substratet skal du starte med at sætte methacrylated coveret glide ind i en petriskål. For at starte med skal du forberede frisk oxideret AgA-opløsning ved at tilføje 9,55 milliliter dobbeltdestilleret vand i et 15-milliliter Falcon rør.Derefter tilsættes 0,5 milliliter aga. Tilsæt derefter 42 milligram natriummetacarbonuvat til opløsningen. Sæt opløsningen på shakeren i fire timer.Derefter forberedes lageropløsningen ved at blande acrylamid, bis-acrylamid og dobbeltdestilleret vand i henhold til tabel 1. Lagerløsningen kan opbevares i op til et år ved fire grader Celsius. Arbejdsopløsningen til det nederste lag ved at blande 99,3 mikroliter lageropløsning med 0,5 mikroliter ammoniumpersulfat 1% og 0,2 mikroliter temed.Tag 10 mikroliter fra opløsningen og pipetten drop-wise på methacrylated cover slip. Placer forsigtigt en 15-millimeter rund dæksel slip på dråben og vent 45 minutter for at polymerisere. Derefter løsne den øverste dækning slip med skalpellen.Forbered derefter arbejdsopløsningen til det øverste lag ved at blande 93,3 mikroliter af lageropløsning med en mikroliter oxideret HEA, fem mikroliters fluorescerende perler, 0,5 mikroliter ammoniumpersulfat 1% og 0,2 mikroliters temed. Tag fem mikroliter fra opløsningen og pipette det drop-wise på det nederste lag hydrogel. Placer forsigtigt et mikromønsterdæksel på dråben.Vent 45 minutter, før det polymeriseres. Tag forsigtigt dækslet med en skalpel. Og lim dækslet glide på bunden af en brugerdefineret boret seks-brønd plade.Tilføj PBS til brøndene. For at se cellerne, aspirere PBS fra seks-brønd plade. For fibroblaster, tilføje høj glukose DMEM indeholder L-glutamin og supplere det med 10% FPS og 1% penicillin og streptomycin.Inkuber cellerne natten over ved 37 grader Celsius og 5% CO2. Tænd for CO2 og opvarmning til mikroskopistadiet. Tænd derefter mikroskopet og læg brøndpladen på scenen.Opsætning af belysningsmønsteret og markér celler af interesse. Fokuser igen på overfladen af hydrogelen. Hent billedet af cellerne i brightfieldkanalen.Hvis du vil tage billedet af perlerne i deformeret tilstand, skal du skifte til kanalen. Skift derefter til laserkanalen og belys cellen i henhold til mønsteret i tre minutter. Dette svarer til en dosis på 6.000 millijoule pr. millimeter i anden.Derefter skal du skifte kanalen og erhverve billedet af perlerne i den uformerede tilstand. For at beregne trækkraftkræfterne skal du åbne de fluorescerende perlebilleder, der allerede er korrigeret for den laterale drift. Den komplette analyse af trækkraft er beskrevet i vedlagte script.For at kontrollere den selektive vedhæftning af celler til de mikromønstrede områder på hydrogels overflade, blev prøver afbildet med fluorescerende mikroskopi ved hjælp af præ-mærkede matrixproteiner og med brightfield mikroskopi til at visualisere celler. Polyacrylamidhydrogelernes mekaniske egenskaber blev varieret ved at blande forskellige mængder acrylamid og bis-acrylamid. Hydrogelens stivhed blev evalueret med nanofiltreringsforsøg ved atomprøvesprængningsmikroskopi.Trækkraft målinger blev udført efter anvendelse af en rumlig, tidsmæssigt kontrolleret, ultraviolet laserstråle belysning til selektivt belyse mikron mellemstore regioner af polyacrylamid hydrogel. Trækkraftkræfterne blev rekonstrueret ved hjælp af legaliseret FTTC med en legaliseringsparameter valgt ved generaliseret krydsvalidering. Vores model modulære tilgang baseret på tiltrækning kraft mikroskopi kombineret med lys og brug frigivelse af mikro-mønster celler er alsidig og kunne udnyttes yderligere med andre mikroskopi og billeddannelse setup for at forbedre dens opløsning og følsomhed.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Bearbejdning af et dobbeltlag Hydrogel at styre ASC differentiering

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering af Cortex Organisation og Dynamics i mikroorganismer, ved hjælp af total indre refleksion Fluorescens Mikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Samtidig Optagelse Real-time billeder i Two Emission kanaler ved hjælp af en Dual Camera Emission Opdeling System: Ansøgninger til celleadhæsionsprocesser

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metode til lokalisering Reporter fluorescerende kugler nærheden cellekulturen overflade for trækkraft Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Brug af Cell-substrat Impedans og levende celler Imaging at måle realtid Ændringer i cellulær adhæsion og De-vedhæftning induceret af Matrix Ændring

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force mikroskopi Imaging og Kraft spektroskopi af understøttede lipiddobbeltlag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Light-medieret dannelse og mønsterdannelse af hydrogeler til celledyrkningsapplikationer

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Mønster bioaktive proteiner eller peptider på Hydrogel ved hjælp af fotokemi for biologiske applikationer

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Mønster for geometrien af humane embryonale stamcelle kolonier på kompatible substrater til kontrol af Vævsniveau mekanik

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Fabrikation og implementering af en reference-fri trækkraft mikroskopi platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...