Name: control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy
Uploaded: 2022-01-29T14:00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy at JoVE.com

Ringraziamo la signora Rebecca Alvarado per il supporto nella produzione video del protocollo e il signor Stephen Casale per le critiche costruttive sul manoscritto. Ringraziamo i colleghi del Dipartimento di Biofisica Cellulare, Max Planck Institute for Medical Research per le utili discussioni. Il sostegno finanziario della Max-Planck-Gesellschaft a E.A.C.-A. e la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15 a E.A.C.-A. e P4 a U.S.S.; DFG EXC 2082/1-390761711 a U.S.S.) è anche molto riconosciuto. J.B. ringrazia la Fondazione Carl Zeiss per il sostegno finanziario. E.A.C.-A., C.S. e U.S.S. riconoscono il finanziamento attraverso il Max Planck School Matter to Life sostenuto dal Ministero Federale Tedesco dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF). C.S. è sostenuto dal Consiglio Europeo della Ricerca (Consolidator Grant PHOTOMECH, no.101001797).

1. Preparazione di coverslips metacrilati
NOTA: Le coperture in vetro sono metacrilate per collegare covalentemente gli idrogel PA e quindi impedire il loro distacco durante l'incubazione con le cellule. I copriscopi per microscopi vengono utilizzati per ottenere un'elevata qualità dell'immagine.
<ol><li>Per preparare una soluzione da 300 ml, prendere un becher di vetro pulito da 400 ml e posizionarlo all'interno di una cappa aspirante.</li>
	<li>Aggiungere 10 ml di acqua doppia distillata (ddH2O) nel becher. Aggiungere 18,75 mL di acido acetico (≥99,8% pro analisi, p.a.), 18,75 mL di 3-(Trimetosiglil)propilmetacrilato e 252,5 ml di etanolo (≥99,8% p.a.) utilizzando una pipetta sierologica. Versare la soluzione in un piatto cristallizzante.</li>
	<li>Pulire i coperchi rotondi in vetro da 24 mm con salviette di precisione. Posizionare i coperchi in un rack in politetrafluoretilene su misura.</li>
	<li>Immergere il rack nella soluzione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Prendere il rack e risciacquare tutti i coverslip con etanolo (99,8% all'anno). Asciugare i coverslips sotto il flusso d'aria. NOTA: le coperture metacrilate possono essere conservate fino a 1 mese su RT.</li>
</ol>2. Micropatterning di proteine della matrice extracellulare su coverslips di vetro
NOTA: Le coperture in vetro vengono prima rivestite con uno strato di molecole, composto da proteine e repellenti per cellule. Questo strato viene poi rimosso utilizzando una tecnica di fotopatterning, per consentire la successiva deposizione di proteine della matrice extracellulare in regioni micropatternate.
<ol><li>Prendi una slitta rotonda in vetro da 15 mm e posizionala su una piastra di Petri. Usa una penna diamantata per segnare il lato superiore della copertina. Quindi, procedere alla pulizia tramite trattamento al plasma di ossigeno a 0,4 mbar e 200 W per 2 minuti.</li>
	<li>Pipetta 100 μL di soluzione di poli-L-lisina allo 0,01% sulla superficie di ciascun coperchio. Incubare per 30 minuti a RT. Lavare i coverslips con 10 mM 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico acido (HEPES) pH 8,5. Rimuovere il liquido in eccesso ma mantenere la superficie bagnata.</li>
	<li>Pipetta 100 μL di 50 mg/mL di poli(glicole etilenico) metil etere acido succinimidil valerico (mPEG-SVA) in 10 mM HEPES pH 8,5 sulla superficie di ogni coverslip. Incubare per 1 ora a RT. Risciacquare i coperchi con 10 mM HEPES pH 8,5 e asciugare sotto flusso d'aria.</li>
	<li>Aggiungere 2 μL di fotoiniziatore sensibile ai raggi UV (ad esempio, PLPP-gel) seguito da 40 μL di etanolo (≥99,8% p.a.) sulla superficie. Per ottenere una distribuzione omogenea del gel e dell'etanolo sulla superficie, inclinare delicatamente la capsula di Petri avanti e indietro. Attendere 5 minuti affinché la soluzione polimerizzi.</li>
	<li>Posizionare un singolo coverslip all'interno di una capsula di Petri da 35 mm con un foro di 20 mm nella parte inferiore. Ciò consente al raggio laser proveniente da sotto di raggiungere direttamente la superficie del vetro.</li>
	<li>Accendere il microscopio e un modulo di modellazione della luce (lavorare con questo dispositivo è consentito solo dopo un'introduzione di sicurezza da parte dei responsabili della sicurezza laser). Calibrare il laser UV-A sull'obiettivo aereo 20x. Metti il campione con il fotoiniziatore sul palco. Regolare la messa a fuoco sulla superficie del vetro e attivare il controllo della messa a fuoco. Caricare e bloccare la serie pre-disegnata.<ol>
<li>Prepara il modello utilizzando un software di grafica come Inkscape. Assicurarsi che il file di pattern non superi le dimensioni DMD (1824 x 1140 px, che corrisponde a 552 x 325 μm su 20 x obiettivo (0,28 μm/px)). NOTA: si consiglia di utilizzare la dimensione DMD (1824 x 1140 pixel) come dimensione del file di pattern, in quanto ciò garantirà l'assenza di errori durante la creazione di serie. Ad esempio, non producete un file di pattern con dimensioni 1830 x 1130 pixel.</li>
		<li>Ai fini del trasferimento del modello alla poliacrilammide, assicurarsi che il modello venga eseguito solo fino al 60% -70% del raggio dal centro del vetro al bordo.</li>
		<li>Per modellare una singola cella, utilizzare un diametro di 50-100 μm con la distanza di 100 μm tra i modelli e un diametro di 150-300 μm per un gruppo di cellule. La dimensione del modello appropriata dipende molto dalla dimensione tipica della cella e deve essere sufficientemente grande da consentire alle cellule di aderire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniziare il patterning con dose UV di 30 mJ/mm2. La durata della creazione di modelli dipende dal numero di modelli. La creazione di un singolo modello richiede circa 1 s.</li>
	<li>Dopo aver completato la fase di modellazione, risciacquare la superficie con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) tre volte. Incubare il campione con 100 μL di 25 μg/mL di fibronectina disciolta in 1x PBS e 25 μg/mL di fibrinogeno Alexa488 coniugato in PBS per 1 ora a RT. Per altre proteine ECM, trovare le concentrazioni ottimali che coprono completamente le regioni modellate.</li>
	<li>Risciacquare la superficie con 1x PBS tre volte. Assicurarsi che il vetro modellato venga immediatamente utilizzato per il trasferimento vetro-PA. Conservare il vetro modellato in PBS a RT durante la preparazione dell'idrogel.</li>
</ol>3. Fabbricazione di idrogel di poliacrilammide modellati
NOTA: Vengono preparati idrogel di poliacrilammide, tra cui N-idrossietil acrilammide ossidata (HEA) per presentare gruppi aldeidici reattivi per il legame covalente delle proteine della matrice sulla superficie. Inoltre, un approccio a doppio strato per incorporare perline fluorescenti solo sullo strato superiore dell'idrogel viene utilizzato per migliorare la registrazione dello spostamento del tallone durante gli esperimenti di microscopia della forza di trazione.
<ol><li>Metti le coperture di vetro metacrilato in una capsula di Petri.</li>
	<li>Per preparare una soluzione heA fresca ossidata, aggiungere 9,55 ml di acqua a doppia distillazione in un tubo centrifugo da 15 ml. Quindi, aggiungere 0,5 mL di HEA e 42 mg di sodio (meta)periodato per ottenere 10 mL della soluzione. Mescolare continuamente la soluzione al buio per 4 ore.</li>
	<li>Mescolare acrilammide, bis-acrilammide e acqua a doppia distillazione secondo la Tabella 1, per ottenere 10 ml di idrogel di soluzione madre (fallo sotto la cappa aspirante, i monomeri sono neurotossici). Degas e chiudere il coperchio con una guarnizione ermetica. NOTA: La soluzione madre può essere conservata in aliquote fino a 1 anno a 4 °C. Caratterizzare sempre il modulo di Young dell'idrogel prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare un idrogel PA a doppio strato (fallo sotto la cappa aspirante, i monomeri sono neurotossici).<ol>
<li>Iniziare con lo strato inferiore mescolando delicatamente 99,3 μL di soluzione madre, 0,5 μL di persolfato di ammonio all'1% (APS) e 0,2 μL di tetrametiletilendiammina (TEMED) in un tubo da 1,5 ml. Prendere 10 μL dalla soluzione e pipettarla a goccia sul centro del coverslip metacrilato.</li>
		<li>Posizionare con attenzione una slitta rotonda di 15 mm sulla goccia e attendere 45 minuti per la polimerizzazione. Staccare delicatamente il coverslip superiore con un bisturi.</li>
		<li>Per lo strato superiore, mescolare delicatamente 93,3 μLaf soluzione madre con 1 μL di soluzione HEA fresca ossidata, 5 μL di perline fluorescenti (corrispondenti a tre perline per micron quadrato per perline di 200 nm), 0,5 μL di 1% APS e 0,2 μL di TEMED in un tubo da 1,5 mL. Prelevare 5 μL dalla soluzione e pipettarla a goccia al centro dello strato inferiore già polimerizzato.</li>
		<li>Posizionare delicatamente il coverslip micropatternato sulla goccia. Attendere 45 minuti a RT affinché la goccia polimerizzi. Assicurati che il lato modellato tocchi la goccia. Staccare delicatamente il coverslip con un bisturi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incollare i coperchi da 24 mm sul fondo di piastre a 6 pozzetti forate su misura utilizzando colla siliconica bicomponente. Dopo 5 minuti, aggiungere PBS ai pozzetti.</li>
	<li>Caratterizzare il modulo di Young dei campioni di idrogel di poliacrilammide mediante microscopia a forza atomica (AFM).<ol>
<li>Montare una punta sferica a sbalzo sul supporto AFM.</li>
		<li>Calibrare ogni cantilever acquisendo una curva forza-distanza (setpoint 3-4 V) su un substrato duro (ad esempio, vetro o mica), estrapolare la sensibilità a sbalzo, ritrarsi dalla superficie ed eseguire una sintonizzazione termica per ottenere la costante della molla.</li>
		<li>Posizionare i cantilever calibrati sul campione di idrogel e acquisire curve di forza nel buffer PBS, utilizzando i seguenti parametri: setpoint di forza 20-30 nN, velocità di avvicinamento e retrazione di 5 o 10 μm/s, dimensione della rampa di 5 μm. NOTA: Un microscopio ottico invertito, dotato di un obiettivo aria 40x e di un filtro a proteina fluorescente verde (GFP) è stato utilizzato per visualizzare e indirizzare le aree micropatterate ECM all'interno dei campioni di idrogel PA.</li>
		<li>Traccia la forza acquisita rispetto alle curve di distanza con il software di analisi AFM.</li>
		<li>Individuate il punto di contatto e convertite le curve di forza rispetto a quelle di distanza in curve di forza rispetto a quelle di rientro.</li>
		<li>Adatta la parte di rientro della curva con il modello di Hertz (o un modello meccanico adatto in funzione della geometria della punta), utilizzando un rapporto di Poisson compreso tra 0,2 e 0,5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Rilascio locale delle forze di trazione cellulare mediante illuminazione laser UV-A (LUVI-TFM)
NOTA: il laser UV-A viene applicato per rilasciare forze di trazione in cellule localizzate in regioni definite degli idrogel. Il laser UV-A (cioè λ = laser a stato solido a 375 nm, <15 mW) è un laser di classe 3B. Il raggio laser non schermato è pericoloso per gli occhi e spesso per la pelle. La luce riflessa e diffusa e le radiazioni possono essere pericolose. Inoltre, le radiazioni UV possono causare il cancro della pelle. Lavorare con i dispositivi è consentito solo dopo l'introduzione della sicurezza da parte dei responsabili della sicurezza laser.
<ol><li>Aspirare il PBS dai pozzi.</li>
	<li>Seme 3 x 106 cellule per piastra a 6 pozzetti nel mezzo di crescita. Per i fibroblasti, utilizzare Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio contenente L-glutammina e integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina / streptomicina. Incubare le cellule durante la notte a 37 °C/5% di CO2. Lavare i campioni per rimuovere le cellule galleggianti prima di iniziare la microscopia.</li>
	<li>Accendere la camera di incubazione del microscopio e l'alimentazione del gas per ottenere una temperatura di 37 °C e il 5% di CO2 atmosfera.</li>
	<li>Accendere il microscopio e il modulo di modellazione laser. Se necessario, ricalibrare il laser UV-A sull'obiettivo aereo 20x utilizzando il software Leonardo. Posiziona la piastra a 6 pozzetti su misura con i campioni sul palco. Regolate la messa a fuoco sulla superficie del PA.</li>
	<li>Impostare il modello di illuminazione e contrassegnare le celle di interesse. Rimettere a fuoco sulla superficie dell'idrogel. Acquisire l'immagine delle celle nel canale brightfield. Passare al canale Cy5 (filtro rosso lontano, eccitazione a 650 nm, emissione a 670 nm) e scattare un'immagine delle perline allo stato deformato.</li>
	<li>Passare al canale laser. Accendere il laser per 3 minuti. Nella nostra particolare configurazione, questo corrispondeva a una dose leggera di 6.000 mJ / mm2.</li>
	<li>Passare al canale Cy5 e acquisire un'immagine delle perline nello stato non deformato. NOTA: per l'esperimento con fibroblasti embrionali di topo, attendere 15 minuti dopo l'esposizione per registrare l'immagine di riferimento/non deformata (vedere la sezione Risultati rappresentativi ). Potrebbe essere diverso per altri tipi di cellule. Ripetere nuovamente i passaggi da 4,5 a 4,7 per un'altra cella di interesse.</li>
	<li>Per misurare l'elevato stress ossidativo dopo l'illuminazione UV-A, utilizzare il reagente disponibile in commercio (CellRox). CellRox è non fluorescente allo stato ridotto e, quando ossidato da specie reattive dell'ossigeno, fluoresce con un'emissione massima di ~665 nm.</li>
	<li>Secondo il protocollo fornito, aggiungere 5 μM di reagente nel mezzo di imaging e incubare per 30 minuti a 37 °C/5% di CO2. Quindi, lavare le celle 3x con PBS caldo 1x e sostituire il supporto di imaging. Registrare il segnale Cy5 mediante imaging a fluorescenza prima e dopo l'illuminazione UV-A utilizzando un'esposizione alla luce simile.</li>
</ol>5. Elaborazione delle immagini, velocimetria delle immagini delle particelle e calcolo delle forze di trazione
NOTA: le forze di trazione delle celle vengono registrate analizzando lo spostamento delle perle fluorescenti e calcolate utilizzando strumenti di analisi delle immagini basati sulla velocimetria delle immagini delle particelle.
<ol><li>Aprire immagini di perline fluorescenti, prima (cioè deformate) e dopo il laser (cioè non deformate) usando Fiji. Unisci due immagini in un'unica pila (Image | Stack | Immagini da impilare).</li>
	<li>Correggere la deriva laterale tra le due immagini utilizzando il plugin StackReg (P. Thévenaz, Istituto Federale Svizzero di Tecnologia di Losanna). Modificare le immagini a 8 bit (image | Tipo | 8 bit) e ridimensionamento a 1024 x 1024 pix (Immagine | Scala). Salva come sequenza di immagini (formato TIFF) con l'immagine di riferimento sempre all'inizio.</li>
	<li>Acquisire il campo vettoriale di spostamento utilizzando una tecnica di correlazione incrociata19 dal campo PIV come implementato nel progetto OpenPIV.<ol>
<li>Assicurarsi che l'immagine rilassata (non deformata) e l'immagine deformata siano coperte da finestre di ricerca di dimensioni wR e wD in pixel. Per ogni finestra di ricerca, definire una funzione di correlazione incrociata utilizzando la formula seguente: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq01.jpg"> Qui, R(i,j) e D(i,j) descrivono i campi di intensità delle due immagini troncate alla finestra di ricerca selezionata e successivamente imbottite a specchio. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq02.jpg"> e <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq03.jpg"> descrivi il loro valore medio. Le dimensioni delle finestre sono scelte per essere wR = 32 e wD = 32 e viene utilizzata una sovrapposizione del 70% tra le finestre di ricerca vicine.</li>
		<li>Per ogni finestra di ricerca determinare un vettore <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq04.jpg"> di spostamento che ottimizza la funzione di correlazione incrociata e assegnare alla posizione centrale della finestra di ricerca. La precisione del subpixel è ottenuta utilizzando un adattamento gaussiano attorno alla regione massima come descritto20.</li>
		<li>Trovare e rimuovere vettori di spostamento ambigui. I vettori di spostamento corrispondenti alle finestre di ricerca in cui il rapporto tra due massimi locali più alti della funzione di correlazione incrociata al di sotto di una soglia di 1,5 è considerato ambiguo21.</li>
		<li>Scartare i vettori di spostamento che non superano il test mediano normalizzato per una soglia residua di 1,522.</li>
		<li>(Facoltativo) Correggete la deriva laterale rimanente sottraendo un vettore <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq05.jpg"> fisso da tutti gli spostamenti. Questo viene fatto perché lo spostamento in un'area selezionata lontana dalla cella svanisce.</li>
		<li>Interpolare il campo vettoriale di spostamento risultante in una griglia regolare con spaziatura di 4 px delle immagini di input utilizzando un'interpolazione polinomiale cubica. I punti dati mancanti vengono riempiti utilizzando un'estrapolazione di spline bivariata liscia. Un vettore di spostamento in pixel è correlato a una deformazione locale dal rapporto pixel dell'immagine (0,33 μm/px per obiettivo pneumatico 20x).</li>
		<li>(Facoltativo) Mirrorizza l'immagine per ridurre gli artefatti di squillo nell'analisi successiva.</li>
		<li>Moltiplicare il campo di deformazione per una funzione finestra Tukey per eliminare l'effetto bordo dovuto alla correzione della deriva, con un parametro di 0,2-0,3. In questo esperimento, l'area micropatterned che si trova al centro di FOV è di interesse.</li>
	</ol></li>
	<li>Ricostruire la trazione utilizzando la citometria di trazione a trasformata di Fourier regolarizzata (FTTC)18. Come regolarizzazione usiamo la scelta ragionevole più semplice, vale a dire, 0 ° ordine Tikhonov (L2) regolarizzazione23,24,25. Viene scelto un parametro di regolarizzazione ottimale λ in modo tale da ridurre al minimo la funzione GCV (Generalized Cross Validation) definita da26: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq06.jpg"> Qui τλ è un vettore impilato contenente le componenti x e y del campo di trazione ricostruito per il valore dato di λ per tutti i modi di campionamento di Fourier e G è l'operatore lineare che mappa i campi di trazione al loro campo di spostamento corrispondente, come definito per FTTC. La somma è in esecuzione su componenti vettoriali. ui sono i componenti x e y del campo di spostamento per tutte le modalità di campionamento di Fourier. GCV è ampiamente usato nel campo dei problemi inversi mal posti ed è una buona alternativa al criterio della curva L spesso usato in TFM. Un filtro Lanzcos viene utilizzato per ridurre gli artefatti introdotti a causa dello spazio di frequenza limitato e dell'upsampling del campo di spostamento. Il calcolo della trazione dipende dal modulo di Young del PA (ad esempio, 11,3 kPa) e dal rapporto di Poisson (ad esempio, per PA nell'intervallo compreso tra 0,2 e 0,5 a seconda della concentrazione del reticolante).</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo protocollo, descriviamo la preparazione di idrogel PA micropatterned contenenti perline fluorescenti, che vengono utilizzati come marcatori fiduciali per gli studi TFM. Il nostro approccio si basa su tre fasi: 1) preparazione di idrogel PA a doppio strato; 2) micropatterning delle proteine ECM e loro trasferimento sulla superficie dell'idrogel; 3) uso di luce quasi UV modellata per TFM. La configurazione sperimentale per analizzare le trazioni cellulari al substrato richiede l'uso di materiali elastici lineari con valori di rigidità noti per calcolare le forze relative allo spostamento delle perle fluorescenti26. Gli idrogel PA sono facili da preparare, la rigidità può essere facilmente regolata e sono comunemente usati per il rilevamento della rigidità e TFM18,28. Tuttavia, per ottenere tempi di polimerizzazione riproducibili e polimerizzazione omogenea dell'intero idrogel, si dovrebbe prestare attenzione alle condizioni di conservazione e al tempo per i reagenti, ad esempio, l'APS deve essere tenuto in un essiccatore per evitare di perdere la sua attività; TEMED deve essere protetto dalla luce diretta. L'uso di HEA ossidato consente il legame covalente delle proteine della matrice sulla superficie dell'idrogel, che potrebbe essere vantaggioso per ottenere la formazione di uno strato proteico completo e stabile. La soluzione HEA ossidata deve essere preparata fresca ogni volta che vengono fabbricati idrogel di PA. L'idrogel PA a doppio strato offre tre vantaggi principali: 1) fornisce un modo alternativo per ottenere in modo riproducibile una distribuzione omogenea di perline fiduciali vicino alla superficie dell'idrogel, senza la necessità di rendere il gel estremamente sottile (cioè <20 μm). Il controllo dello spessore dell'idrogel è fondamentale per ottenere misurazioni accurate con TFM. Quando il substrato elastico è troppo sottile, le cellule aderenti forti come i fibroblasti possono percepire e rispondere meccanicamente al substrato di vetro rigido sottostante29,30. Idrogel spessi rendono più impegnativa l'acquisizione dell'immagine per la ricostruzione della forza. Inoltre, molti microscopi non avranno spazio sufficiente per ospitarli, considerando lo spessore aggiuntivo del substrato di vetro utilizzato per attaccare l'idrogel, a meno che non vengano utilizzati vetrini di microscopia ultrasottile. 2) Nell'idrogel PA a doppio strato, la distribuzione omogenea delle perle fiduciali vicino alla superficie dell'idrogel PA si ottiene senza utilizzare una centrifuga, ma piuttosto con una semplice incubazione di quantità precise di soluzioni idrogel e perline fluorescenti. L'elevata densità del tallone è di notevole vantaggio quando si esegue l'analisi PIV perché aumenta la risoluzione delle forze di trazione e il rapporto segnale-rumore senza la necessità di microscopia confocale. 3) Confinare le perline in uno strato sottile vicino all'interfaccia cellula-materiale consente l'imaging delle forze di trazione con microscopi a epifluorescenza e microscopi confocali. Quando si prepara l'idrogel, l'utente deve assicurarsi che aderisca saldamente al vetro inferiore prima di procedere con i passaggi successivi del protocollo. Si consiglia di seguire il tempo di incubazione indicato per la polimerizzazione degli strati di idrogel, in quanto potrebbe essere difficile rimuovere il vetro sulla parte superiore della superficie senza danneggiare la superficie dell'idrogel.
Le tecniche più conosciute per misurare le proprietà elastiche sono AFM, nanoindentazione, prove di trazione e reometria. Tuttavia, la nanoindentazione induce tensioni molto elevate sui materiali che possono influenzare la determinazione delle proprietà elastiche. Le prove di trazione e la reometria invece sono tecniche di misura macroscopica, mentre le cellule interagiscono su scala microscopica31,32. AFM consente misurazioni su microscala con ceppi ridotti in condizioni fisiologiche. L'affidabilità delle misurazioni AFM può essere compromessa se mancano dettagli sperimentali (ad esempio, forza di indentazione e velocità) o se vengono registrati dati insufficienti27. Huth et al. descrive un algoritmo per estrarre i moduli di Young dai dati AFM, che enfatizza il mantenimento costante dei dettagli di misurazione27. Questo algoritmo offre una determinazione precisa e affidabile dei moduli di Young ed è stato utilizzato per i nostri esperimenti. Inoltre, abbiamo misurato molte curve su campioni fabbricati in giorni diversi e ottenuto risultati molto simili (variazione dei valori medi di circa 1-2 kPa). Ciò dimostra che la rigidità dei nostri gel può essere prevista in modo affidabile.
In questo protocollo, utilizziamo un modulo di fotopatterning per creare regioni micropatterned su vetro, che vengono poi trasferite sulle superfici dell'idrogel. Il micropatterning mostrato in questo protocollo si basa sulla litografia near-UV maskless basata su DMD (dispositivo micro-specchio digitale) (λ = 375 nm)7. Una DMD è costituita da un gran numero di microspecchi su un chip. Un singolo pixel corrisponde a un singolo micro-specchio. Il file di immagine del modello pixelato da un computer viene proiettato attraverso DMD e focalizzato sulla superficie utilizzando un obiettivo. Per la micropatterning delle proteine, la luce laser focalizzata viene utilizzata per scindere spazzole polimeriche repellenti con l'aiuto di un fotoiniziatore. Successivamente, le regioni esposte sono riempite con proteine ECM. Questo metodo di ablazione senza maschera offre una grande flessibilità nella progettazione di nuovi modelli, in quanto non si basa sull'uso di una fotomaschera. Progettare e applicare un modello è molto semplice in quanto richiede solo diversi minuti utilizzando un freeware come Inkscape. Tuttavia, il numero di modelli e campioni prodotti in un breve lasso di tempo è un grosso inconveniente, in quanto questo metodo può essere utilizzato solo per modellare un singolo substrato ogni volta. Il modulo di fotopatterning utilizza una sorgente laser a stato solido vicino ai raggi UV che emette diversi milliwatt. Il raggio laser non schermato è pericoloso per gli occhi e la pelle. Anche la luce riflessa e diffusa e le radiazioni possono essere pericolose. La manipolazione deve essere accompagnata da un'istruzione di sicurezza da parte degli ufficiali laser. Il passaggio più critico del protocollo quando si utilizza un modulo di fotopatterning è quello di garantire che durante la micropatterning e l'ablazione il laser sia correttamente focalizzato sulla superficie. Una dose di illuminazione costante (intensità moltiplicata per il tempo) di luce UV durante la modellazione dipende da come il laser è focalizzato sulla superficie. Una debole intensità sulla superficie a causa della scarsa messa a fuoco può causare il fallimento del trasferimento di ECM sulla superficie dell'idrogel con conseguente assenza di cellule che si attaccano all'idrogel.
Negli esperimenti TFM, dopo l'imaging iniziale delle cellule aderenti e dei marcatori fiduciali, le cellule vengono rilasciate dall'idrogel PA mediante trattamento con tripsina per registrare il loro stato rilassato. Uno svantaggio nell'esecuzione di questo passaggio è la gestione del campione nella fase di microscopia. Senza una camera di perfusione, l'apertura del coperchio del piatto, l'aspirazione del mezzo, il risciacquo e il pipettaggio della soluzione di tripsina rappresentano una sfida per i principianti e gli utenti esperti. In effetti, queste procedure sono una delle principali fonti della deriva negli assi xyz , con conseguente perdita di posizione e messa a fuoco. Il nostro protocollo di illuminazione UV locale rende TFM una tecnica più accessibile per i principianti. Va notato che abbiamo utilizzato un modulo di fotopattering senza maschera basato su microscopia disponibile in commercio, ma in linea di principio potrebbe essere utilizzato qualsiasi sistema di illuminazione UV-A, eventualmente in combinazione con una maschera per proteggere le regioni dei substrati, dove le forze di trazione cellulare non dovrebbero essere registrate. Esporre le cellule con una dose significativa di luce visibile a bassa lunghezza d'onda (ad esempio, la luce viola che eccita l'emissione daPI) porterà ad un aumento dello stress ossidativo, che può causare fototossicità e morte cellulare. Pertanto, questa tecnica può essere applicata anche in un microscopio a epifluorescenza senza un modulo laser UV. Tuttavia, poiché l'intensità è molto più debole, sarà molto più facile realizzare TFM con il trattamento enzimatico in questo caso.
Con LUVI-TFM è possibile utilizzare lo stesso campione per diverse misurazioni a causa del distacco locale di singole cellule o piccoli gruppi di cellule. Tuttavia, si dovrebbe prestare attenzione alla selezione delle cellule da staccare, per evitare di registrare le forze dalle cellule vicine. Pertanto, per le misurazioni a cella singola in assenza di micropattern, le regioni affollate dovrebbero essere evitate; per le misurazioni su singole celle micropatternate, i modelli devono essere progettati in modo tale che la distanza tra le singole strutture sia almeno il doppio del diametro dell'area modellata. Raccomandiamo inoltre di non utilizzare cellule da modelli adiacenti in sequenza, ma piuttosto di campionarle da regioni distanti sul substrato. La nostra misurazione è ben condotta su un microscopio a epifluorescenza dotato di una funzione di controllo della messa a fuoco e di una lente 40 x aria NA = 0,9, dove la distanza di lavoro della lente è sufficientemente lunga e il rapido movimento da un pozzo all'altro è altamente sintonizzabile. Il distacco mirato di cellule per applicazioni TFM è efficace per misurare la forza cellulare di una singola cellula o di un intero cluster di piccole cellule (ad esempio, fino a 300 μm di diametro). Usando la nostra configurazione, abbiamo osservato l'arrotondamento e il distacco delle cellule per il trattamento UV di singole cellule (Figura 3A), mentre il distacco si è verificato raramente per i piccoli cluster cellulari. Ciò potrebbe portare a una sottostima delle forze di trazione cellulare. Per i cluster cellulari più grandi, si raccomanda il distacco enzimatico, poiché gli utenti dovrebbero utilizzare un obiettivo aereo 20x per visualizzare l'intero cluster ed è necessaria una funzione di controllo della messa a fuoco. Poiché la profondità di messa a fuoco dell'obiettivo pneumatico 20x è molto più lunga, la gestione non sarà critica come l'obiettivo di ingrandimento più elevato. L'utente deve assicurarsi che la messa a fuoco sia impostata correttamente per l'ablazione delle cellule, poiché la dose di illuminazione dipende dalla messa a fuoco laser sulla superficie. Mentre siamo consapevoli delle possibili limitazioni nell'uso di LUVI-TFM nei collettivi cellulari a causa di possibili interazioni meccaniche con cellule vicine non trattate, questo aspetto potrebbe effettivamente rivelarsi utile per studi sulla meccanica dell'estrusione cellulare mirata, ad esempio da monostrati epiteliali.
In conclusione, con il nostro approccio TFM combinato con il rilascio indotto dalla luce di cellule micropatternate, forniamo un protocollo robusto e ad alto rendimento per misurare le forze di adesione cellulare. La versatilità di questo metodo potrebbe essere ulteriormente sfruttata utilizzando la microscopia e la configurazione dell'imaging volte a migliorare la risoluzione e la sensibilità.

Quando interagiscono con il loro ambiente extracellulare, le cellule aderenti esercitano forze che sono principalmente mediate da aderenze focali a base di integrina che collegano la matrice extracellulare (ECM) al citoscheletro dell'actina. Le aderenze focali sono assemblaggi multiproteici incentrati sul legame delle integrine alle proteine ECM come la fibronectina e il collagene. Il clustering delle integrine e la crescita delle aderenze focali è cruciale non solo per la creazione di una connessione meccanicamente stabile, ma anche per il reclutamento di altre proteine di adesione focale, comprese quelle che attivano la via RhoA per la regolazione della contrattilità cellulare1. La contrattilità RhoA-dipendente del citoscheletro dell'actina consente alle cellule di diffondersi e migrare sull'ECM sottostante e anche di rilevarne la rigidità2. La distribuzione delle forze di trazione dipende fortemente dall'area di diffusione e dalla forma delle cellule, entrambe le quali si basano sulle proprietà della matrice e quindi influenzano l'organizzazione citoscheletrica, formando infine un circuito di feedback chiuso tra la meccanica della matrice e l'organizzazione citoscheletrica3,4.
Le tecniche di micropatterning superficiale consentono un controllo definito della forma cellulare creando regioni di dimensioni micron che presentano proteine adesive ECM; in base alle dimensioni di queste regioni, singole cellule o gruppi di cellule che aderiscono al micropattern5. Le proteine ECM possono essere modellate su substrati di vetro con approcci diversi come la stampa a microcontatto, il foto-patterning o il laser-patterning6. L'uso della luce UV (λ = 185 o 375 nm) combinato con strategie antivegetative superficiali offre la flessibilità per la progettazione di diverse forme e dimensioni e l'immobilizzazione di più tipi di proteine con un'elevata precisione vicino ai bordi superficiali7,8. Le regioni rivestite con sostanze chimiche repellenti alle proteine come il polietilenglicole (PEG) sono protette con una fotomaschera al cromo o un sistema di litografia senza maschera basato su dispositivo a specchio digitale (DMD). I modelli nelle maschere consentono l'esposizione alla luce UV di regioni che saranno poi modellate con proteine ECM. Il pattern delle superfici dell'idrogel con proteine ECM richiede una fase di trasferimento per rimuovere le proteine dalla superficie del vetro e collegarle ai modelli. In alternativa, è possibile ottenere motivi su materiali morbidi rivestendo prima la fotomaschera con una proteina repellente, quindi bruciando le regioni smascherate utilizzando un'illuminazione UV profonda. Poiché i raggi UV profondi generano ozono e rendono la superficie reattiva per il legame proteico, le regioni non mascherate sono rivestite con proteine ECM e infine il gel viene polimerizzato direttamente sopra le regioni non mascherate9,10.
Gli idrogel modellati possono essere utilizzati per eseguire TFM, una tecnica che misura le forze cellulari all'interfaccia cellula-materiale11. In 2D-TFM, si utilizza la superficie piana di un film polimerico spesso, in cui sono state incorporate perle marcatori per tracciare le deformazioni12,13,14,15. Per estrarre i vettori di spostamento, è essenziale combinare due immagini, una dello stato deformato e un'immagine di riferimento senza deformazioni. Le due immagini vengono quindi mappate l'una sull'altra con l'elaborazione delle immagini. Ad alta densità di marcatori, questo viene solitamente fatto con particle image velocimetry (PIV), che è un metodo ben consolidato per ricostruire il flusso idrodinamico. A bassa densità di marcatori e in 3D-TFM, questo viene solitamente fatto con Particle Tracking Velocimetry (PTV), che include caratteristiche specifiche del set di dati sperimentali. Un esempio di alternativa computazionalmente più economica è il flusso ottico, come l'algoritmo Kanade-Lucas-Tomasi (KLT)16. Nel caso dei substrati di idrogel, le perle fluorescenti sono solitamente incorporate ad alta densità durante la polimerizzazione del materiale e le immagini vengono registrate prima e dopo il rilascio cellulare dopo il distacco enzimatico. Il distacco enzimatico delle cellule aderenti, ad esempio per tripsinizzazione, porta al rilascio simultaneo di trazioni cellulari da tutte le cellule sugli idrogel, rendendo difficile ottenere un'analisi dettagliata da un numero elevato di cellule.
Qui presentiamo un protocollo per preparare idrogel micropatterned per controllare la forma e la localizzazione delle cellule e un metodo per misurare in modo efficiente le forze di trazione in sequenza utilizzando UV per staccare le singole cellule dal substrato. Per le misurazioni della forza di trazione, presentiamo una tecnica per produrre idrogel PA a doppio strato, in cui le perle fluorescenti sono incorporate solo nello strato superiore, il che aumenta la loro densità e riduce la loro diffusione verticale. La combinazione del rilascio mediato dai raggi UV delle forze di trazione cellulare con il micropatterning consente di ottenere un controllo spaziale sul distacco cellulare (ad esempio, di singole cellule senza influenzare l'adesione di altre cellule nella regione di interesse), a condizione che vi sia una distanza sufficiente tra le cellule modellate. La trazione cellulare viene quindi ricostruita utilizzando il metodo più efficiente e affidabile per il 2D-TFM, vale a dire, la citometria di trazione a trasformata di Fourier (FTTC) con regolarizzazione17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>#440159</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>#33209</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %</td>
			<td>#1610140</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>#CP-CONT-BSG-A-G</td>
			<td>NanoAndMore</td>
			<td>5 &#956;m spherical tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system</td>
			<td>#NanoWizard3</td>
			<td>JPK</td>
			<td>Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>#A3678</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2 %</td>
			<td>#1610142</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#C11440-42U30</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#ANDORZYLA4.2</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox</td>
			<td>#C10422</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom incubator chamber</td>
			<td></td>
			<td>EMBLEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>#1300 100</td>
			<td>Picodent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>#41965</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Eclipse Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Axiovert200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>#9065.3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>#S181T</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>#F13191</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Alexa488 conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>#F1141</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8805</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (365/415)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8848</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (505/515)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8810</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (580/605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8807</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (660/680)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 15 mm round</td>
			<td>#41001115</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 24 mm round</td>
			<td>#41001124</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>#MRH08230</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>20x air NA 0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td>#CRL-2991</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>#MPEG-SVA-5000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxyethyl acrylamide</td>
			<td>#697931</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>#100-E</td>
			<td>TePla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>#PLPPgel</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>#P4823</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)</td>
			<td>#PLL(20-g[3.5]-PEG(2)</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium(meta) periodate</td>
			<td>#S1878</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>#17919</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Pattening module</td>
			<td>#PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVO cleaner</td>
			<td>#342-220</td>
			<td>Jelight</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy

La microscopia a forza di trazione (TFM) è il metodo principale utilizzato in meccanobiologia per misurare le forze cellulari. Comunemente questo viene utilizzato per le cellule che aderiscono a substrati morbidi piatti che si deformano sotto trazione cellulare (2D-TFM). TFM si basa sull'uso di materiali elastici lineari, come il polidimetilsilossano (PDMS) o la poliacrilammide (PA). Per 2D-TFM su PA, la difficoltà nel raggiungere un'elevata produttività deriva principalmente dalla grande variabilità delle forme e delle trazioni delle celle, che richiedono la standardizzazione. Presentiamo un protocollo per fabbricare in modo rapido ed efficiente idrogel PA micropatterned per studi 2D-TFM. I micropattern vengono prima creati dalla fotolitografia senza maschera utilizzando la luce quasi UV in cui le proteine della matrice extracellulare si legano solo alle regioni micropatternate, mentre il resto della superficie rimane non adesivo per le cellule. La micropatterazione delle proteine della matrice extracellulare è dovuta alla presenza di gruppi aldeidici attivi, con conseguente regioni adesive di diverse forme per ospitare singole cellule o gruppi di cellule. Per le misurazioni TFM, utilizziamo idrogel PA di diversa elasticità variando le quantità di acrilammide e bis-acrilammide e monitorando lo spostamento delle perle fluorescenti incorporate per ricostruire i campi di trazione cellulare con la citometria di trazione a trasformata di Fourier regolarizzata (FTTC).
Per ottenere ulteriormente una registrazione precisa delle forze cellulari, descriviamo l'uso di una dose controllata di luce modellata per rilasciare trazioni cellulari in regioni definite per singole cellule o gruppi di cellule. Chiamiamo questo metodo microscopia a forza di trazione con illuminazione UV locale (LUVI-TFM). Con il trattamento enzimatico, tutte le cellule vengono staccate dal campione contemporaneamente, mentre con LUVI-TFM le forze di trazione delle cellule in diverse regioni del campione possono essere registrate in sequenza. Dimostriamo l'applicabilità di questo protocollo (i) per studiare le forze di trazione cellulare in funzione dell'adesione controllata al substrato e (ii) per ottenere un numero maggiore di osservazioni sperimentali dallo stesso campione.

Gli idrogel pa sono stati polimerizzati su coperture in vetro metacrilato, che presentano gruppi reattivi per il legame covalente del PA. In questo modo, quando si posizionano gli idrogel in una soluzione acquosa, è stato impedito il loro distacco dal substrato (Figura 1A-D). Per ottenere un'alta densità di marcatori fiduciali vicino alla superficie dell'idrogel, abbiamo sviluppato la preparazione di un idrogel PA a doppio strato. Lo strato inferiore, senza perline fluorescenti, è stato polimerizzato sul coperchio metacrilato. Successivamente, un altro strato contenente perline è stato polimerizzato sopra lo strato inferiore (Figura 1E-H), sostituendo la necessità di sedimentazione, che viene spesso utilizzata per ottenere la distribuzione delle perline in un singolo piano focale e aumentare la densità delle perline. Per ottenere il controllo sulla forma delle cellule durante le misurazioni TFM, abbiamo prodotto idrogel di PA micropatterati tramite trasferimento diretto di microstrutture modellate con fibronectina da un coperchio di vetro al PA pre-polimerizzato (Figura 1F-F'). L'aggiunta dell'1% di reticolante non convenzionale (HEA ossidato) nella soluzione dello strato superiore di idrogel fornisce gruppi aldeidici che si legano covalentemente ai gruppi amminici della fibronectina.
Abbiamo preparato idrogel PA, che hanno uno spessore di circa 60 μm e perline fluorescenti confinate nello strato superiore vicino alla superficie dell'idrogel. Questo tipo di idrogel è un substrato adatto per l'imaging di trazioni cellulari con microscopi invertiti e abbastanza spessi (lo spessore minimo per eseguire TFM è stato segnalato per essere 20-30 μm)18 per prevenire qualsiasi impatto del substrato di vetro. La localizzazione delle perle fluorescenti è stata ripresa al microscopio confocale (Figura 1I). Per visualizzare il trasferimento di proteine sull'idrogel, abbiamo usato proteine ECM marcate fluorescentemente e le abbiamo fotografate al microscopio a epifluorescenza (Figura 1J). Abbiamo preparato cerchi micropatterned di fibronectina con un diametro di 100 μm (lato sinistro) e 50 μm (lato destro) per consentire l'adesione di gruppi di cellule o singole cellule, come mostrato nella sovrapposizione di immagini di campo luminoso di cellule aderenti e perline fiduciali e micropattern di fibronectina marcati fluorescentemente. Su un campione diverso, la risposta di adesione di singole cellule alla fibronectina micropatterata è stata convalidata mediante microscopia a immunofluorescenza indiretta per visualizzare la localizzazione di proteine di adesione focale come la paxillina (Figura 1K).
Sia il rivestimento proteico ECM che la rigidità dell'idrogel sono parametri cruciali per l'adesione cellulare26. Per caratterizzare le proprietà meccaniche dei nostri idrogel PA, abbiamo eseguito esperimenti di nanoindentazione di AFM27, accoppiati con un microscopio a epifluorescenza. Substrati di idrogel di tre diverse rigidità sono stati preparati e testati con la nostra configurazione (Figura 2 e Tabella 1). I cantilever AFM a forma di sfera sono stati ciclicamente avvicinati e ritratti da idrogel PA non tagliati e fibrinogeno coniugati ad aree micropatterate Alexa488, mentre registravano curve forza-distanza. Successivamente, la valutazione del punto di contatto e l'applicazione del modello Hertz ci hanno permesso di stimare il modulo di Young (E) di ciascun campione. La micropatterning ECM non ha alterato il modulo di Young, che è rimasto paragonabile a ciascuno degli idrogel PA non modellati.
Per misurare le forze di trazione esercitate dalle cellule aderenti sul substrato, abbiamo sviluppato una configurazione sperimentale per TFM basata su riferimento effettuata su un microscopio a epifluorescenza a campo largo dotato di modulo laser UV vicino (UV-A 6000 mJ / mm2) per rilasciare le trazioni cellulari (Figura 3A). Poiché l'illuminazione del raggio laser può essere controllata spazio-temporalmente, non solo è possibile esporre selettivamente una singola cellula o un cluster cellulare con un'alta dose laser, ma anche e soprattutto, la fase intermedia dirompente della rimozione cellulare dall'intero campione utilizzando un enzima digestivo come la tripsina non è più necessaria. Illuminare le cellule con una dose laser così elevata ha indotto un elevato stress ossidativo che ha portato alla morte cellulare (Figura 3B). La morte cellulare ha prodotto il rilascio di trazioni dal substrato, come indicato dallo spostamento del tallone (illustrato nella Figura 3A). Abbiamo combinato l'illuminazione UV-A con un modulo di pattern di luce per illuminare selettivamente regioni di dimensioni micron degli idrogel PA (Figura 3B-C). In questo modo è possibile rilasciare le trazioni di cluster di cellule micropatternate (Figura 3C,F) o di singole celle (Figura 3B). È importante sottolineare che, alle nostre scale temporali, le proprietà meccaniche degli idrogel modellati ECM non sono state significativamente influenzate dall'esposizione ai raggi UV (Figura 2C). L'aumento dello stress ossidativo è mostrato nella Figura 3D,E. Le forze di trazione sono state ricostruite utilizzando FTTC regolarizzato con un parametro di regolarizzazione scelto da Generalized Cross Validation (Figura 3B,F). Il rilascio di forze per singole cellule si è verificato in un periodo di 15 minuti e il risultato del LUVI-TFM è paragonabile al TFM a base di tripsina (Figura 3G-H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig01.jpg"> Figura 1: Schema di preparazione del substrato fibronectina modellato per TFM. (A) La soluzione per lo strato inferiore viene pipettata su una superficie metacrilata. (B) Una copertina pulita più piccola viene accuratamente posizionata sulla goccia. (C) Il tempo di gelificazione è di 45 min. (D) Il coperchio superiore è staccato. Lo strato inferiore è pronto. (E) La soluzione per lo strato superiore viene pipettata sull'idrogel. (F) Il coperchio modellato è accuratamente posizionato sulla goccia. (F') La micropatterning delle proteine adesive sul vetro è prodotta mediante maschera senza maschera vicino alla litografia UV e quindi trasferita dal vetro all'idrogel PA. I gruppi amminici liberi delle proteine adesive, ad esempio la fibronectina, si legano covalentemente ai gruppi aldeidici sulla superficie pa. (G) Il tempo di gelificazione è di 45 min. (H) Il coperchio superiore è staccato. L'idrogel PA modellato è pronto. (I) Una rappresentazione 3D di una micrografia xyz confocale che mostra un'alta densità di perle fiduciali vicino alla superficie. (J) Una micrografia di fibronectina (magenta) marcata fluorescentemente sulla superficie del PA con perline fluorescenti incorporate (verde), sovrapposte con un'immagine di campo luminoso delle cellule. (K) Imaging al microscopio a immunofluorescenza indiretta di una singola cellula aderente a un micropattern di fibronectina a forma di cerchio (100 μm). Nucleo (blu), paxillina (rosso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig02.jpg"> Figura 2: Caratterizzazione delle proprietà meccaniche del campione da parte di AFM. (A) Configurazione sperimentale di nanoindentazione AFM. Un cantilever a forma di sfera viene utilizzato per sondare le micropattern ECM prima o dopo il trattamento UV e le regioni non modellate delle aree PA a doppio strato (5% acrilammide, 0,3% bis-acrilammide). (B) Forza rappresentativa rispetto alla curva di rientro per il micropattern ECM (nero). Hertz fit (rosso) viene utilizzato per calcolare il modulo di Young (E) del campione. (C) Misure meccaniche per aree PA a doppio strato non modellate (senza ECM), micropattern ECM e micropattern ECM dopo esposizione ai raggi UV-A. Le barre mostrano la media ± S.E.M. (test Brown-Forsythe e Welch ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig03.jpg"> Figura 3. L'illuminazione UV-A locale TFM (LUVI-TFM) consente misurazioni della forza di trazione locale all'interno di un ampio campo visivo. (A) Schema di illuminazione UV-A locale TFM. Le cellule vengono trattate con un'alta dose di laser UV-A per ottenere l'immagine non deformata (di riferimento). (B) L'immagine in campo luminoso di una singola cella prima dell'illuminazione laser UV-A. Al centro: l'immagine in campo luminoso di una singola cella dopo l'illuminazione laser UV-A. A destra: Forza di trazione di un singolo MEF aderente a un idrogel PA rivestito di fibronectina (E = 5,74 kPa) illuminato con un fascio di luce UV di 50 μm di diametro (linea tratteggiata rossa). (C) A sinistra: registrazione delle forze di trazione di un gruppo di fibroblasti embrionali di topo (MEF) aderenti alla fibronectina micropatternata (cerchio, diametro 100 μm). Il cluster è stato illuminato con un fascio di luce UV di 200 μm di diametro (linea tratteggiata rossa). A destra: Registrazione delle forze di trazione di un gruppo di fibroblasti embrionali di topo (MEF) aderenti alla fibronectina micropatterata (cerchio, diametro 300 μm). Il cluster è stato illuminato con un fascio di luce UV di 300 μm di diametro (linea tratteggiata rossa). Barra di scala = 200 μm. (D,E) Un aumento dello stress ossidativo nelle cellule indicato dall'aumento dell'intensità del segnale Cy5 dopo che un'elevata dose di laser UV-A viene rilevata dalla microscopia a fluorescenza. Lo stress ossidativo porta alla morte cellulare. Barra della scala = 200 μm. (F) A sinistra: la mappa del calore di stress da un gruppo di fibroblasti embrionali di topo (MEF) aderenti alla fibronectina micropatternata (cerchio, diametro 100 μm). A destra: la mappa del calore di stress da un gruppo di fibroblasti embrionali di topo (MEF) aderenti alla fibronectina micropatterned (cerchio, diametro 300 μm). (G) Le cellule MEF aderenti a micropattern di fibronectina da 100 μm rilasciano lentamente le loro trazioni dopo l'esposizione ai raggi UV-A. Il rilascio completo si ottiene dopo 15 minuti (l'immagine di riferimento è stata quindi scattata 15 minuti dopo l'esposizione). (H) Un confronto con il TFM convenzionale a base di tripsina per cellule MEF aderenti a fibronectina patterned di diametro 300 μm. Il risultato dell'illuminazione UV-A (6.000 mJ/mm2) seguita da un'attesa di 15 minuti non è significativamente diverso dal trattamento convenzionale con tripsina (cioè lo 0,05% per 20 minuti). Le barre mostrano la media S.E.M. ( t-test dello studente a due code, ****P < 0,0001, * P < 0,05, ns P ≤0,5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Acrilammide (%)</td>
			<td>Bis-acrilammide (%)</td>
			<td>Acrilammide da soluzione madre al 40 % (ml)</td>
			<td>Bis-acrilammide da soluzione madre al 2 % (ml)</td>
			<td>Acqua (ml)</td>
			<td>Modulo di Young (kPa)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>8.5</td>
			<td>5,74 ± 0,53</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.15</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.75</td>
			<td>8</td>
			<td>9,69 ± 0,68</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.3</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>7.25</td>
			<td>11,33 ± 1,06</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Miscele di soluzioni madre idrogel e conseguente elasticità
Tutti i dati sono depositati nell'Open Access Data Repository di The Max Planck Society (Edmond) e sono accessibili tramite il seguente indirizzo: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

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Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

La litografia near-UV e la microscopia a forza di trazione sono combinate per misurare le forze cellulari su idrogel micropatterati. Il rilascio mirato indotto dalla luce di singole cellule consente un numero elevato di misurazioni sullo stesso campione.

Controllo dell'adesione cellulare mediante tecniche di modellazione dell'idrogel per applicazioni nella microscopia a forza di trazione

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fabbricare idrogel di micro-pattern per studi di microscopia a forza di trazione 2D. Ciò si ottiene facendo prima scivolare una copertura in vetro metacrilato e formando il primo strato di un idrogel di poliacrilammide su di esso. Il secondo passo è quello di creare un altro strato di idrogel contenente perline fluorescenti per la microscopia della forza di trazione.L'idrogel è inserito con una copertura micro-pattern slip sopra di esso, con conseguente trasferimento delle proteine della matrice micro-pattern sulla superficie dell'idrogel. Successivamente, l'idrogel di poliacrilammide viene lasciato polimerizzare a temperatura ambiente per 45 minuti. Lo slip del coperchio superiore viene quindi rimosso con cura.L'imaging al microscopio a fluorescenza viene utilizzato per mostrare la presenza delle perline e il trasferimento di successo di proteine della matrice extracellulare micro-modellate. Questo metodo aiuta a misurare in modo efficiente e preciso diverse forze di trazione utilizzando la luce e utilizzare il rilascio di cellule. Rendendo possibile ottenere un maggior numero di osservazioni sperimentali dallo stesso campione.Quindi a dimostrare la procedura sarà Joel Christian, uno studente laureato del mio laboratorio. Aggiungere 10 millilitri di acqua doppia distillata in un becher. Successivamente, aggiungere 18,75 millilitri di acido acetico, 18,75 millilitri di metacrilato di 3-propile e 252,5 millilitri di etanolo alla soluzione.Quando la soluzione è completa, trasferirla in un piatto cristallizzante. Prendi i coperchi rotondi da 24 millimetri, puliscili con una salvietta di precisione e mettili in un rack in teflon su misura. Quindi immergerlo nella soluzione e incubare per 15 minuti.Prendi il rack e risciacqualo con etanolo. Asciugare il coperchio scivola sotto il flusso d'aria. Gli slip di copertura metacrilati possono essere conservati fino a un mese a temperatura ambiente.Prendi un coperchio rotondo da 15 millimetri e mettilo su una capsula di Petri. Utilizzare una penna diamantata per contrassegnare il lato superiore della scivolata di copertura. Quindi procedere alla pulizia tramite trattamento al plasma di ossigeno.Lo slittamento del coperchio è pulito a 0,4 millibar e 200 Watt per due minuti. Pipettare 100 microlitri dello 0,01% di soluzione di Poli-L-Lisina sulla superficie del coperchio scivolare e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare il coperchio con 10 millimolari ad un pH di 8,5.Estrarre il liquido in eccesso, ma mantenere la superficie bagnata. Pipettare 100 microlitri da 50 milligrammi per millilitro di mPEG-SVA in soluzione di pH 8,5 da 10 millimolari sulla superficie del coperchio scivolare e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo, risciacquare il coperchio scivola con pH 10 millimolare 8,5.Quindi aggiungere due microlitri di gel PLPP seguiti da 40 microlitri di etanolo sulla superficie. Inclinare delicatamente la capsula di Petri per omogeneizzare la soluzione. Attendere cinque minuti affinché la soluzione si polarizzi.Posizionare il coperchio all'interno di una capsula di Petri con foro inferiore di 35 millimetri. Metti la capsula di Petri contenente il coperchio sul palco del microscopio. Regolare la messa a fuoco sulla superficie del vetro.Caricare e bloccare la serie pre-disegnata. Iniziare il pattern con la dose UV di 30 millijoule per millimetro quadrato. Dopo aver completato la fase di creazione del modello, estrarre la scivolata del coperchio del modello e risciacquare la superficie con PBS.Incubare il campione con una miscela di 100 microlitri di 25 microgrammi per millilitro fibronectina e 25 microgrammi per millilitro fibrinogeno coniugato con Alexa 488 disciolto in PBS per un'ora a temperatura ambiente. Per preparare il substrato di idrogel, iniziare con il mettere la copertura metacrilata in una capsula di Petri. Per iniziare, preparare una soluzione di AgA appena ossidata aggiungendo 9,55 millilitri di acqua doppia distillata in un tubo Falcon da 15 millilitri.Quindi aggiungere 0,5 millilitri di AgA. Quindi aggiungere 42 milligrammi di meta piruvato di sodio alla soluzione. Impostare la soluzione sullo shaker per quattro ore.Quindi preparare la soluzione madre mescolando acrilammide, bis-acrilammide e acqua doppia distillata secondo la Tabella 1. La soluzione madre può essere conservata fino a un anno a quattro gradi Celsius. Preparare la soluzione di lavoro per lo strato inferiore mescolando 99,3 microlitri di soluzione madre con 0,5 microlitri di persolfato di ammonio 1% e 0,2 microlitri di TEMED.Prelevare 10 microlitri dalla soluzione e dalla pipetta a goccia sul coperchio metacrilato. Posizionare con attenzione un coperchio rotondo da 15 millimetri sulla goccia e attendere 45 minuti affinché polimerizzi. Quindi, staccare il coperchio superiore scivolare con il bisturi.Quindi preparare la soluzione di lavoro per lo strato superiore mescolando 93,3 microlitri di soluzione madre con un HEA ossidato a microlitri, cinque microlitri perle fluorescenti, 0,5 microlitri di persolfato di ammonio 1% e 0,2 microlitri di TEMED. Prendi cinque microlitri dalla soluzione e pipettala a goccia sull'idrogel dello strato inferiore. Posizionare con attenzione una copertura micro-pattern sulla goccia.Attendere 45 minuti affinché polimerizzi. Staccare delicatamente il coperchio scivolare con un bisturi. E incolla il coperchio scivola sul fondo di una piastra a sei pozzetti forata personalizzata.Aggiungi PBS ai pozzi. Per vedere le cellule, aspirare il PBS dalla piastra a sei pozzetti. Per i fibroblasti, aggiungere DMEM ad alto contenuto di glucosio contenente L-glutammina e integrarlo con 10% FPS e 1% penicillina e streptomicina.Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% CO2. Accendere la CO2 e il riscaldamento per la fase di microscopia. Quindi accendere il microscopio e posizionare la piastra del pozzo sul palco.Impostare il modello di illuminazione e contrassegnare le celle di interesse. Rimettere a fuoco sulla superficie dell'idrogel. Acquisire l'immagine delle celle nel canale brightfield.Per scattare l'immagine delle perline nello stato deformato, passare al canale. Quindi passare al canale laser e illuminare la cella secondo il modello per tre minuti. Ciò corrisponde a una dose di 6.000 millijoule per millimetro quadrato.Dopo, cambia canale e acquisisci l'immagine delle perline nello stato non deformato. Per calcolare le forze di trazione, apri le immagini di perline fluorescenti che hanno già corretto per la deriva laterale. L'analisi completa delle forze di trazione è dettagliata nello script allegato.Per verificare l'adesione selettiva delle cellule alle regioni micro-modellate sulla superficie degli idrogel, i campioni sono stati ripresi con microscopia fluorescente utilizzando proteine della matrice pre-marcate e con microscopia a campo luminoso per visualizzare le cellule. Le proprietà meccaniche degli idrogel di poliacrilammide sono state variate mescolando diverse quantità di acrilammide e bis-acrilammide. La rigidità dell'idrogel è stata valutata con esperimenti di nanoindentazione mediante microscopia a forza atomica.Le misurazioni della forza di trazione sono state eseguite dopo aver applicato un'illuminazione a fascio laser ultravioletto spaziale, controllata temporalmente, per illuminare selettivamente regioni di dimensioni micron dell'idrogel di poliacrilammide. Le forze di trazione sono state ricostruite utilizzando FTTC regolarizzato con un parametro di regolarizzazione scelto mediante validazione incrociata generalizzata. Il nostro approccio modulare basato sulla microscopia a forza di attrazione combinato con la luce e il rilascio di micro-pattern è versatile e potrebbe essere ulteriormente sfruttato con altre impostazioni di microscopia e imaging per migliorarne la risoluzione e la sensibilità.

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