Name: control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy
Uploaded: 2022-01-29T14:00:00
Duration: 12 min 26 s
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私たちは、レベッカ・アルバラド夫人がプロトコルビデオ制作のサポートをしてくれたことに感謝し、スティーブン・カザーレ氏は原稿に対する建設的な批判を受けました。マックスプランク医学研究所の細胞生物物理学科の同僚に、有益な議論に感謝します。マックス・プランク・ゲセルシャフトからE.A.C.-Aへの財政支援。ドイツ・フォルシュングスゲマイインシャフト(DFG SFB1129、プロジェクトンマー 240245660、P15からE.A.C.-A、P4から米国へ;DFG EXC 2082/1-390761711 to.S.)また、大いに認められています。J.Bカール・ツァイス財団の財政支援に感謝します。E.A.C.-A.、C.S.、米国は、ドイツ連邦教育研究省(BMBF)が支援するマックスプランクスクールマター・トゥ・ライフを通じた資金調達を認めています。C.S.は欧州研究評議会(統合グラント・フォトメック、No.101001797)によって支持されています。

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著者らは開示するものは何もない。

本プロトコルでは、蛍光ビーズを含むマイクロパターンPAヒドロゲルの調製について説明する。我々のアプローチは、3つのステップに基づいています: 1) 二重層PAヒドロゲルの調製;2)ECMタンパク質のマイクロパターン化とヒドロゲル表面への転写;3)TFMのためのパターン近紫明光の使用。基板への細胞の牽引を分析する実験のセットアップは、蛍光ビーズ26の変位に関連する力を計算するために既知の剛性値を持つ線形弾性材料の使用を必要とします。PAヒドロゲルは準備が容易で、剛性は容易に調整でき、剛性感知およびTFM18,28のために一般的に使用される。しかし、ヒドロゲル全体の再現可能な重合時間と均質な重合を得るためには、試薬の保存条件と時間に注意を払う必要があります。TEMED は直接光から保護する必要があります。酸化HEAを使用すると、ヒドロゲル表面上のマトリックスタンパク質の共有結合が可能となり、完全で安定したタンパク質層の形成を達成するのに有利である可能性があります。酸化されたHEA溶液は、PAヒドロゲルが製造されるたびに新鮮に調製する必要があります。二重層PAヒドロゲルは3つの主な利点を提供する:1)ゲルを非常に薄くする必要なしに、ヒドロゲル表面の近くで受託者ビーズの均質な分布を再現的に得るための代替方法を提供する(すなわち、<20 μm)。TFMを用いて正確な測定を行う上で、ヒドロゲルの厚さの制御が重要です。弾性基材が薄すぎると、線維芽細胞等の強固な接着性細胞が、基礎となる剛性ガラス基板29,30に感知し機械的に応答することがある。厚いヒドロゲルは力の再構成のためのイメージ獲得をより困難にする。さらに、多くの顕微鏡は、超薄顕微鏡スライドを使用しない限り、ヒドロゲルを取り付けるために使用されるガラス基板の追加の厚さを考慮して、それらを収容するのに十分なスペースを持っていません。2)二重層PAヒドロゲルでは、PAヒドロゲルの表面付近の受託者ビーズの均質な分布は遠心分離機を使用せずに達成され、むしろ正確な量のヒドロゲル溶液および蛍光ビーズの単純なインキュベーションで達成される。PIV分析を行う場合、PIV分析では、共焦点顕微鏡を必要とせずに牽引力と信号対雑音比の分解能が高くなるため、高いビーズ密度が大きな利点となります。3) 細胞材料界面に近い薄層にビーズを閉じ込めると、共焦点顕微鏡と同様に、発蛍光顕微鏡による牽引力のイメージングが可能になります。ハイドロゲルを調製する際には、プロトコルの後続のステップに進む前に、底面ガラスにしっかりと付着していることを確認する必要があります。ヒドロゲル表面を損傷することなく表面の上にガラスを取り除くのは難しい場合があるため、ヒドロゲル層の重合に示されたインキュベーション時間に従うことをお勧めします。
弾性特性を測定する最もよく知られている技術は、AFM、ナノインデント、引張試験、およびレオメトリーです。しかし、ナノインデンテーションは、弾性特性の決定に影響を与える可能性のある材料に非常に高い株を誘導する。一方、引張試験とレオメトリーは巨視的な測定技術であり、細胞は微視的な尺度31,32で相互作用する。AFMは生理学的条件の下で減らされた緊張とマイクロスケールで測定を可能にする。AFM測定の信頼性は、実験の詳細が欠落している場合(例えば、インデント力および速度)または不十分なデータが記録された場合に悪影響を受ける可能性がある27。Huthらは、AFMデータからヤングのモジュライを抽出するアルゴリズムを記述し、測定の詳細を定数27に保つことを強調する。このアルゴリズムはヤングのモジュライの正確で信頼性の高い決定を提供し、我々の実験に使用された。さらに、異なる日に作製されたサンプル上の多くの曲線を測定し、非常によく似た結果(ca. 1-2 kPaの平均値の変動)を得ました。これは、ゲルの剛性を確実に予測できることを示しています。
このプロトコルでは、フォトパターニングモジュールを使用してガラス上にマイクロパターン化された領域を作成し、ハイドロゲル表面に転送します。このプロトコルに示されているマイクロパターン化は、DMD (デジタルマイクロミラーデバイス)ベースのマスクレス近紫外リソグラフィー (λ = 375 nm)7 に基づいています。DMD は、チップ上の多数のマイクロミラーで構成されます。単一のピクセルは、単一のマイクロミラーに対応します。コンピュータのピクセル化パターン画像ファイルは、DMDを介して投影され、対物レンズを使用して表面に焦点を当てます。タンパク質のマイクロパターン化の場合、焦点を合わせるレーザー光は、光始子の助けを借りて忌避性ポリマーブラシを切断するために使用されます。その後、露出した領域はECMタンパク質で満たされます。このマスクレスアブレーション法は、フォトマスクの使用に依存しないため、新しいパターンを設計する際に大きな柔軟性を提供します。Inkscape のようなフリーウェアを使用して数分しかかからなくて済むので、パターンのデザインと適用は非常に簡単です。しかし、短時間で生成されるパターンやサンプルの数は大きな欠点であり、この方法は毎回単一の基板をパターン化するためにのみ使用することができる。フォトパターニングモジュールは、数ミリワットを放出する近くのUV固体レーザー光源を使用します。シールドされていないレーザービームは、目や皮膚に危険です。反射光と散乱光と放射線も危険です。取り扱いには、レーザー役員の安全指導を伴う必要があります。フォトパターニングモジュールを使用する際のプロトコルの最も重要なステップは、マイクロパターニングとアブレーションの間にレーザーが表面に適切に焦点を合わせられるようにすることです。パターニング中のUV光の一貫した照明線量(強度を時間で乗算)は、レーザーが表面に焦点を当てる方法に依存します。焦点不良による表面の強度が弱いと、ヒドロゲル表面へのECM転送が失敗し、ヒドロゲルに結合する細胞がなくなることがあります。
TFM実験では、接着細胞および受託マーカーの初期イメージング後、細胞は、それらのリラックスした状態を記録するためにトリプシン処理によってPAヒドロゲルから放出される。このステップを実行する際の欠点は、顕微鏡の段階でサンプルを処理することです。灌流チャンバーなし、皿の蓋を開け、媒体を吸引し、すすがり、ピペット化トリプシン溶液は初心者や経験豊富なユーザーのための課題を表します。実際、これらの手順は 、xyz 軸のドリフトの主要な原因であり、位置とフォーカスが失われます。当社のローカルUV照明プロトコルは、初心者のためのよりアクセスしやすい技術をTFMにします。市販の顕微鏡ベースのマスクレスフォトパターニングモジュールを使用しましたが、原理的にはUV-A照明システムを使用して、最終的には細胞牽引力を記録してはならない基板の領域を保護するためにマスクと組み合わせて使用することができます。低波長可視光(例えば、DAPI発光を励起する紫色光)の有意な用量で細胞を曝露すると、酸化ストレスが増大し、光毒性や細胞死を引き起こす可能性があります。したがって、この技術は、UVレーザーモジュールを使用しない蛍光顕微鏡でも適用することができる。しかし、強度がはるかに弱いので、この場合の酵素処理でTFMを達成することははるかに容易になります。
LUVI-TFMを使用すると、単一セルまたはセルの小グループの局所剥離のために、複数の測定に同じサンプルを使用することが可能です。ただし、隣接するセルからの力を記録しないように、取り外すセルの選択に注意を払う必要があります。したがって、マイクロパターンがない場合の単一細胞測定では、混雑した領域は避けるべきです。単一のマイクロパターン化されたセルでの測定では、単一の構造間の距離がパターン化された領域の直径の少なくとも 2 倍になるようにパターンを設計する必要があります。また、隣接するパターンの細胞を順番に使用するのではなく、基板上の遠くの領域からサンプリングすることもお勧めします。我々の測定は焦点制御特徴および40 x空気NA=0.9レンズを備えた、十分に長く、ある井戸から別の井戸への急速な動きが高い上昇の顕微鏡で行われる。TFMアプリケーション用の細胞のターゲット剥離は、単一の細胞または小さな細胞クラスタ全体(直径300μmまで)の細胞力を測定するのに有効です。我々のセットアップを用いて、単一細胞のUV処理のための細胞の丸めと剥離を観察した(図3A)が、小細胞クラスターでは剥離がほとんど起こらなかった。これは、細胞牽引力の過小評価につながる可能性があります。より大きなセルクラスタの場合、ユーザーは20倍の空気目標を使用してクラスタ全体をイメージし、フォーカス制御機能が必要であるため、酵素剥離をお勧めします。20xエアレンズの焦点深度がはるかに長くなるので、取り扱いはより高い倍率の目的ほど重要ではありません。照明線量は表面のレーザーフォーカスに依存するため、ユーザーは細胞のアブレーションに焦点が正しく設定されていることを確認する必要があります。隣接する未処理細胞との機械的相互作用が可能なため、細胞集団でLUVI-TFMを使用する場合の可能性は認識していますが、この側面は、実際には上皮単層からの標的細胞押出の力学に関する研究に役立つ可能性があります。
結論として、マイクロパターン化細胞の光誘導放出と組み合わせたTFMアプローチにより、細胞接着力を測定するための堅牢で高スループットのプロトコルを提供します。この方法の多様性は、解像度と感度の向上を目的とした顕微鏡およびイメージング設定を使用して、さらに活用される可能性があります。

細胞外の環境と相互作用する場合、接着細胞は主にインテグリンベースの焦点接着によって媒介される力を発揮し、細胞外マトリックス(ECM)をアクチン細胞骨格に接続します。焦点付着は、フィブロネクチンやコラーゲンのようなECMタンパク質へのインテグリンの結合を中心とするマルチタンパク質集合体です。インテグリンクラスタリングと焦点接着の成長は、機械的に安定した接続の確立のためだけでなく、細胞収縮性の調節のためのRhoA経路を活性化するものを含む他の焦点接着タンパク質の募集のためにも重要です1。ローア依存性のアクチン細胞骨格の収縮性は、細胞が広がり、基礎となるECM上で移動することを可能にし、また、その剛性を感知する2。牽引力の分布は、細胞の広がり領域と形状に強く依存し、どちらもマトリックス特性に依存し、したがって細胞骨格組織に影響を与え、最終的にはマトリックス力学と細胞骨格組織3,4の間に閉じたフィードバックループを形成する。
表面マイクロパターニング技術は、ECM接着タンパク質を提示するミクロンサイズの領域を作成することによって、細胞形状の定義された制御を可能にします。これらの領域のサイズに従って、単一の細胞、またはマイクロパターン5に付着する細胞のグループ。ECMタンパク質は、マイクロコンタクト印刷、フォトパターニング、レーザーパターニング6などの異なるアプローチによってガラス基板上でパターン化することができます。UVライト(λ = 185または375 nm)を表面防汚戦略と組み合わせることで、異なる形状やサイズを設計し、表面エッジの近くに高精度で複数のタンパク質タイプを固定化するための柔軟性を提供します7,8。ポリエチレングリコール(PEG)などのタンパク質忌避剤化学物質でコーティングされた領域は、クロムフォトマスクまたはデジタルミラーデバイス(DMD)ベースのマスクレスリソグラフィーシステムのいずれかで保護されています。マスクのパターンは、ECMタンパク質でパターン化される領域のUV光への暴露を可能にします。ECMタンパク質を用いたヒドロゲル表面のパターニングには、ガラス表面からタンパク質を除去し、パターンに架橋する伝達ステップが必要です。あるいは、柔らかい材料に対するパターニングは、まずフォトマスクを忌避タンパク質でコーティングし、続いて深いUV照明を使用してマスクされていない領域を燃焼させることによって達成することができる。深い紫外線はオゾンを生成し、表面をタンパク質結合のために反応性にするので、マスクされていない領域はECMタンパク質でコーティングされ、最後にゲルはマスクされていない領域の上に直接重合される9,10。
パターン化されたヒドロゲルは、TFMを行うために使用され、細胞材料界面11における細胞力を測定する技術である。2D-TFMでは、1つは、マーカービーズが変形を追跡するために埋め込まれている厚いポリマーフィルムの平らな表面を使用しています12、13、14、15。変位ベクトルを抽出するには、変形のない変形状態と参照画像の2つの画像を組み合わせることが不可欠です。その後、2 つの画像は、画像処理によって相互にマッピングされます。高いマーカー密度では、これは通常、流体力学的流れを再構築するための確立された方法である粒子画像Velocimetry(PIV)で行われます。低マーカー密度および3D-TFMでは、これは通常、実験データセットの特定の特徴を含む粒子追跡ヴェロシメトリー(PTV)で行われます。計算上安価な代替手段の例として、カナデ・ルーカス・トマシ(KLT)アルゴリズム16のようなオプティカルフローがあります。ヒドロゲル基質の場合、蛍光ビーズは通常、材料重合中に高密度で埋め込まれ、酵素剥離時に細胞放出の前後に画像が記録されます。接着性細胞の酵素剥離、例えばトリプシン法により、ヒドロゲル上のすべての細胞からの細胞牽引の同時放出を招き、多数の細胞から詳細な分析を得ることが困難になる。
ここでは、細胞の形状と局在を制御するマイクロパターン化ヒドロゲルを調製するプロトコルと、UVを用いてシーケンス内の牽引力を効率よく測定し、個々の細胞を基板から切り離す方法を提示する。牽引力測定では、蛍光ビーズが最上層にのみ埋め込まれ、密度が高まり、垂直拡散を低減する二重層PAヒドロゲルを製造する技術を紹介します。細胞牽引力のUV媒介放出をマイクロパターニングと組み合わせることで、細胞剥離(例えば、対象領域における他の細胞の接着に影響を与えることなく単一細胞の)に対する空間制御を得ることを可能にする、パターン化された細胞間の十分な距離がある場合。その後、セルラートラクションは、2D-TFM、すなわち、正則化17,18を有するフーリエ変換トラクションサイトメトリー(FTTC)のための最も効率的で信頼性の高い方法を使用して再構築されます。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>#440159</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>#33209</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %</td>
			<td>#1610140</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>#CP-CONT-BSG-A-G</td>
			<td>NanoAndMore</td>
			<td>5 &#956;m spherical tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system</td>
			<td>#NanoWizard3</td>
			<td>JPK</td>
			<td>Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>#A3678</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2 %</td>
			<td>#1610142</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#C11440-42U30</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#ANDORZYLA4.2</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox</td>
			<td>#C10422</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom incubator chamber</td>
			<td></td>
			<td>EMBLEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>#1300 100</td>
			<td>Picodent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>#41965</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Eclipse Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Axiovert200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>#9065.3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>#S181T</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>#F13191</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Alexa488 conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>#F1141</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8805</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (365/415)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8848</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (505/515)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8810</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (580/605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8807</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (660/680)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 15 mm round</td>
			<td>#41001115</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 24 mm round</td>
			<td>#41001124</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>#MRH08230</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>20x air NA 0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td>#CRL-2991</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>#MPEG-SVA-5000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxyethyl acrylamide</td>
			<td>#697931</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>#100-E</td>
			<td>TePla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>#PLPPgel</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>#P4823</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)</td>
			<td>#PLL(20-g[3.5]-PEG(2)</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium(meta) periodate</td>
			<td>#S1878</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>#17919</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Pattening module</td>
			<td>#PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVO cleaner</td>
			<td>#342-220</td>
			<td>Jelight</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy

牽引力顕微鏡(TFM)は、細胞力を測定するためにメカノバイオロジーで使用される主な方法です。一般的にこれは、細胞の牽引下で変形する平らなソフト基質(2D-TFM)に付着した細胞に使用されています。TFM は、ポリジメチルシロキサン (PDMS) やポリアクリルアミド (PA) などの線形弾性材料の使用に依存しています。PA上の2D-TFMでは、主に細胞形状と牽引力の大きなばらつきから高スループットを達成するのが難しくなり、標準化が求められております。我々は、2D-TFM研究のために、マイクロパターン化PAヒドロゲルを迅速かつ効率的に製造するためのプロトコルを提示する。マイクロパターンは、細胞外マトリックスタンパク質がマイクロパターン化された領域にのみ結合する近紫外線光を使用したマスクレスフォトリソグラフィーによって最初に作成され、残りの表面は細胞に対して非接着剤のままです。細胞外マトリックスタンパク質のマイクロパターニングは、活性アルデヒド基の存在に起因し、単一細胞または細胞群に対応するために異なる形状の接着領域を生じる。TFM測定では、アクリルアミドとビスアクリルアミドの量を変化させ、埋め込み蛍光ビーズの変位を追跡して、規則化フーリエ変換トラクションサイトメトリー(FTTC)で細胞牽引フィールドを再構築することで、異なる弾性のPAヒドロゲルを使用します。
さらに細胞力の正確な記録を達成するために、我々は、単一細胞または細胞群の定義された領域における細胞牽引を放出するために、制御されたパターン光の用量の使用を記述する。このメソッドをローカル UV 照明牽引力顕微鏡(LUVI-TFM)と呼びます。酵素処理では、すべての細胞が同時にサンプルから切り離され、一方、サンプルの異なる領域にある細胞のLUVI-TFM牽引力を順番に記録することができます。我々は、このプロトコル(i)が基板への制御接着の関数として細胞牽引力を研究し、(ii)同じサンプルからより多くの実験観測を達成することを実証する。

PAヒドロゲルをメタクリレートガラスカバーリップ上に重合し、PAの共有結合に反応基を提示した。このようにして、ヒドロゲルを水溶液に入れた場合、基板からのそれらの剥離が防止された(図1A-D)。ヒドロゲル表面付近の高密度の受託マーカーを得るために、我々は二重層PAヒドロゲルの調製を開発した。一番下の層を、蛍光ビーズを一切含まず、メタクリレートされたカバースリップ上に重合した。続いて、ビーズを含む別の層を最下層(図1E-H)の上に重合し、沈降の必要性を置き換え、これはしばしば単一の焦点面でビーズ分布を達成し、ビーズ密度を高めるために使用される。TFM測定中の細胞形状の制御を達成するために、ガラスカバースリップからプリポリマーPAへのフィブロネクチンパターン化微細構造の直接移動を介した微パターンPAヒドロゲルを製造しました(図1F-F')。最上ヒドロゲル層溶液に1%非従来型架橋剤(酸化HEA)を添加すると、フィブロネクチンのアミン基に共有結合するアルデヒド基を提供する。
厚さ約60μmのPAヒドロゲルと、ヒドロゲル表面に近い上層に閉じ込められた蛍光ビーズを用意しました。このタイプのヒドロゲルは、ガラス基板の影響を防ぐために、反転顕微鏡と十分な厚さ(TFMを行うのに最小厚さ)18 で細胞トラクションを撮影するのに適した基板です。蛍光ビーズの局在化は共焦点顕微鏡法で画像化した(図1I)。ヒドロゲル上でのタンパク質の転写を可視化するために、蛍光標識ECMタンパク質を使用し、蛍光顕微鏡で画像化しました(図1J)。フィブロネクチンの微パターン円を直径100μm(左側)、50μm(右側)で調製し、接着性細胞の明るいフィールド画像のオーバーレイに示すように、細胞または単一細胞のグループの接着を可能にし、受託者ビーズとフィブロネクチンの微小パターンを蛍光標識した。別のサンプルでは、単一細胞の微小パターン化フィブロネクチンへの接着応答を、パキシリンなどの焦点接着タンパク質の局在化を画像化するために間接的免疫蛍光顕微鏡法により検証した(図1K)。
ECMプロテインコーティングとヒドロゲルの剛性は、細胞接着26にとって重要なパラメータです。PAヒドロゲルの機械的特性を特徴付けるために、AFM27によるナノインデンテーション実験を、蛍光顕微鏡と組み合わせたもので行いました。3種類の剛性のヒドロゲル基材を、当社のセットアップで調製し、試験しました(図2 および 表1)。球形のAFM片持ち体は、力距離曲線を記録しながら、パターン化されていないPAヒドロゲルおよびフィブリノーゲンをAlexa488マイクロパターン化された領域に結合させた周期的に接近し、引き込まれた。その後、Hertzモデルの接触点評価と応用により、各サンプルのヤング率(E)を推定することができました。ECMマイクロパターニングはヤング率を変化させることはなかったが、これはパターン化されていないPAヒドロゲルのそれぞれに匹敵するままであった。
基板上の接着細胞が発揮する牽引力を測定するために、UVレーザーモジュール(UV-A 6000 mJ/mm2)近傍を搭載した広視野発蛍光顕微鏡(UV-A 6000 mJ/mm2)で行った基準ベースのTFMの実験セットアップを開発し、細胞牽引力を放出しました(図3A)。レーザー光照射は時間的に制御できるため、単一の細胞または細胞クラスターを高いレーザー線量で選択的に露光することができるだけでなく、さらに重要なことに、トリプシンのような消化酵素を用いたサンプル全体からの細胞除去の破壊的な中間工程は不要になった。このような高いレーザー線量で細胞を照らして、細胞死につながる酸化ストレスの上昇を誘発した(図3B)。細胞死は、ビーズ変位によって示されるように、基質からの牽引の放出をもたらした(図3Aに示す)。UV-A照明と光パターニングモジュールを組み合わせて、PAヒドロゲルのミクロンサイズの領域を選択的に照射しました(図3B-C)。このようにして、マイクロパターン化された細胞クラスター(図3C、F)または単一細胞(図3B)のトラクションを解除することができる。重要なことに、我々の時間スケールでは、ECMパターン化ヒドロゲルの機械的特性は、UV露光によって有意に影響を受けなかった(図2C)。酸化ストレスの増加を図3D,Eに示す。トラクションフォースは、一般化クロス検証によって選択された正規化パラメータを持つ正規化FTTCを使用して再構築されました(図3B、F)。単一セルの力の放出は15分の期間にわたって起こり、LUVI-TFMの結果はトリプシンベースのTFM(図3G-H)と同等である。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig01.jpg"> 図1:TFM用のパターン化フィブロネクチン基質調製物のスキーム (A)下層の溶液は、メタクリル化された表面に配管される。(B)小さなきれいなカバースリップは、慎重に液滴に置かれます。(C)ゲル化時間は45分(D)上部カバースリップが取り外されている。一番下のレイヤーの準備ができました。(E)最上層の溶液をヒドロゲルにピペット処理する。(F) パターン化されたカバースリップは、液滴に慎重に配置されます。(F')ガラス上の接着タンパク質のマイクロパターニングは、UVリソグラフィ付近のマスクレスによって生成され、ガラスからPAヒドロゲルに移されます。接着タンパク質の遊離アミン基は、例えば、フィブロネクチン、PA表面上のアルデヒド基に共有結合する。(G)ゲル化時間は45分(H)上部カバースリップが取り外されている。パターンPAヒドロゲルは準備ができています。(I) 表面近くの受託者ビーズの高密度を示す共焦点xyz顕微鏡写真の3D表現。(J)細胞の明視野画像を重ねたPA表面に蛍光標識フィブロネクチン(マゼンタ)を埋め込んだ蛍光ビーズ(緑色)の顕微鏡写真。(K)円状のフィブロネクチンマイクロパターン(100μm)に付着した単一細胞の間接免疫蛍光顕微鏡イメージング。核(青)、パキシリン(赤)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig02.jpg"> 図2:AFMによるサンプル力学特性の特性評価 (A) AFMナノインデンテーション実験セットアップ。球状のカンチレバーは、UV処理の前後のECMマイクロパターンと、二重層PA(5%アクリルアミド、0.3%ビスアクリルアミド)領域の非パターン領域をプローブするために使用されます。(B) ECM マイクロパターン(黒)の代表的な力とインデント曲線。ヘルツフィット(赤)は、サンプルのヤング率(E)を計算するために使用されます。(C) UV-A曝露後の非パターン二重層PA領域(ECMなし)、ECMマイクロパターンおよびECMマイクロパターンの機械的測定。バーはS.E..M±平均を示しています(ブラウン・フォーサイスとウェルチANOVAテスト)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig03.jpg"> 図 3.ローカル UV-A 照明 TFM (LUVI-TFM) は、大きな視野内での局所的な牽引力測定を可能にします。 (A) 局部UV-A照明TFMのスキーム。細胞は、未変形(参照)画像を得るために高用量のUV-Aレーザーで処理される。(B) UV-A レーザー照明前の単一セルの明視野画像。中央: UV-A レーザー照明後の単一セルの明視野画像。右:フィブロネクチン被覆PAヒドロゲル(E = 5.74 kPa)に付着した単一のMEFの牽引力を、直径50μmのUV光ビーム(赤色の破線)で照らした。(C)左:マイクロパターン化フィブロネクチン(円、直径100μm)に付着したマウス胚性線維芽細胞(MEF)のクラスターの牽引力の記録。クラスターは直径 200 μm の UV ライトビーム (赤い破線) で照らされました。右:マイクロパターン化フィブロネクチン(円、直径300μm)に付着したマウス胚性線維芽細胞(MEF)のクラスターの牽引力の記録。クラスターは直径 300 μm の UV ライトビーム (赤い破線) で照らされました。スケールバー=200μm(D,E)高いUV-Aレーザー線量が蛍光顕微鏡で検出された後のCy5シグナル強度の増加によって示される細胞における酸化ストレスの増加。酸化ストレスは細胞死につながる。スケールバー=200μm(F)左:マウス胚性線維芽細胞(MEF)のクラスターから微小パターン化フィブロネクチン(円、直径100μm)に付着したストレスヒートマップ。右:マウス胚性線維芽細胞(MEF)のクラスターから微量パターン化フィブロネクチン(円、直径300μm)に付着したストレスヒートマップ。(G)100μmフィブロネクチンマイクロパターンに付着したMEF細胞は、UV-A曝露後に徐々にトラクションを放出する。完全な放出は15分後に達成される(参照画像は、その後、15分後露光を撮影した)。(H) 直径300μmのパターンフィブロネクチンに付着したMEF細胞に対する従来のトリプシンベースTFMとの比較。UV-Aイルミネーション(6,000 mJ/mm2)の後に15分待ちの結果は、従来のトリプシン処理(すなわち、20分間0.05%)とは有意に異なっています。バーはS.E.Mを意味します(両側の学生の tテスト、****P<0.0001、* P <0.05、ns P ≤0.5)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>アクリルアミド (%)</td>
			<td>ビスアクリルアミド (%)</td>
			<td>40% ストック溶液 (ml) からのアクリルアミド</td>
			<td>2%ストック溶液(ml)からビスアクリルアミド</td>
			<td>水 (ml)</td>
			<td>ヤングの係数 (kPa)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>8.5</td>
			<td>5,74 ± 0,53</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.15</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.75</td>
			<td>8</td>
			<td>9,69 ± 0,68</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.3</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>7.25</td>
			<td>11,33 ± 1,06</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:ヒドロゲルストック溶液混合物と得られた弾力性
すべてのデータは、マックスプランク協会(Edmond)のオープンアクセスデータリポジトリに預け、次のアドレスからアクセスすることができます https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf。

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Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

近紫外線リソグラフィーとトラクションフォース顕微鏡を組み合わせて、マイクロパターン化されたヒドロゲル上の細胞力を測定します。単一細胞のターゲット光誘導放出により、同じサンプル上で多数の測定が可能になります。

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

この手順の全体的な目標は、2D牽引力顕微鏡試験用のマイクロパターンヒドロゲルを製造することです。これは、最初にメタクリル化ガラスカバースリップを作り、その上にポリアクリルアミドヒドロゲルの第1層を形成することによって達成される。第2のステップは、牽引力顕微鏡用蛍光ビーズを含む別のヒドロゲル層を作成することです。ヒドロゲルは、その上にマイクロパターンカバースリップで挟み込み、ヒドロゲル表面上のマイクロパターンマトリックスタンパク質の転写をもたらす。次に、ポリアクリルアミドヒドロゲルを室温で45分間重合する。上部カバースリップは慎重に取り外されます。蛍光顕微鏡イメージングは、ビーズの存在とマイクロパターンの細胞外マトリックスタンパク質の正常な移動を示すために使用されます。この方法は、光を使用して、細胞の放出を使用して、効率的かつ正確にいくつかの牽引力を測定するのに役立ちます。同一試料からより多くの実験観察を得ることを可能にする。だから、手順を実証することはジョエルクリスチャン、私の研究室の大学院生になります。ビーカーに10ミリリットルの二重蒸留水を加えます。その後、18.75ミリリットルの酢酸、3-プロピルメタクリレート18.75ミリリットル、エタノール252.5ミリリットルを溶液に加えます。溶液が完成したら、結晶化皿に移します。24ミリメートルの丸いカバースリップを取り、精密なワイプでそれらをきれいにし、カスタムメイドのテフロンラックに入れます。その後、溶液に浸し、15分間インキュベートします。ラックを取り、エタノールですすります。カバースリップを気流下で乾かします。メタクリレートカバースリップは、室温で1ヶ月まで保存することができます。15ミリメートルの丸いカバースリップを取り、ペトリ皿に置きます。ダイヤモンドペンを使用して、カバースリップの上側に印を付けます。その後、酸素プラズマ処理を介して洗浄に進みます。カバースリップは0.4ミリバールできれいで、200ワットで2分間きれいです。ポリL-リジン溶液のピペット100マイクロリットルをカバースリップの表面に、室温で30分間インキュベートします。その後、カバースリップを10ミリモルで8.5のpHで洗います。余分な液体を取り出しますが、表面を濡らしてください。ピペット100マイクロリットルのmPEG-SVAのミリリットル当たり50ミリグラムのカバースリップの表面に10ミリモルpH 8.5溶液を、室温で1時間インキュベートします。その後、カバースリップを10ミリモルpH 8.5ですすります。その後、PLPPゲルを2マイクロリットル加え、その後40マイクロリットルのエタノールを表面に加えます。ペトリ皿を軽く傾けて溶液を均質化します。溶液が偏光するまで5分待ちます。35ミリメートルの底穴ペトリ皿の中にカバースリップを置きます。カバースリップを含むペトリ皿を顕微鏡のステージに置きます。ガラスの表面に焦点を合わせます。描画済みパターンをロードしてロックします。1ミリメートルあたり30ミリジュールの紫外線量でパターニングを開始します。パターニングステップが完了したら、パターンカバースリップを取り出し、PBSで表面をすすきます。サンプルを100マイクロリットルのフィブロネクチンあたり25マイクログラム、室温で1時間PBSに溶解したAlexa 488と共役した1ミリリットルフィブリノーゲンあたり25マイクログラムの混合物でインキュベートします。ヒドロゲル基板を準備するには、メタクリレートされたカバースリップをペトリ皿に入れることから始めます。開始するには、15ミリリットルのファルコンチューブに9.55ミリリットルの二重蒸留水を加えて、新鮮な酸化AgA溶液を調製します。その後、AgAの0.5ミリリットルを追加します。その後、溶液に42ミリグラムのメタピルビン酸ナトリウムを加える。シェーカーに溶液を4時間セットします。次に、表1に記載のアクリルアミド、ビスアクリルアミド、及び二重蒸留水を混合してストック液を調製する。ストックソリューションは摂氏4度で最長1年間保つことができます。99.3マイクロリットルのストック溶液を0.5マイクロリットルの過硫酸アンモニウム1%と0.2マイクロリットルのTEMEDと混合して、底層に対する作業溶液を調製します。溶液から10マイクロリットルを取り、ピペットはメタクリレートカバースリップにドロップします。15ミリメートルの丸いカバースリップを液滴に慎重に置き、重合するまで45分待ちます。次に、上部カバースリップをメスで取り外します。次に、93.3マイクロリットルのストック溶液を1マイクロリットル酸化HEA、5マイクロリットル蛍光ビーズ、0.5マイクロリットルの過硫酸アンモニウム1%および0.2マイクロリットルのTEMEDと混合して、最上層の作業溶液を調製します。溶液から5マイクロリットルを取り、ピペットは底層ヒドロゲルに滴下します。慎重に液滴にマイクロパターンカバースリップを置きます。重合するまで45分待ちます。カバースリップをメスでそっと取り外します。そして、カスタムドリル6ウェルプレートの底にカバースリップを接着します。井戸にPBSを追加します。細胞を見るために、6ウェルプレートからPBSを吸引する。線維芽細胞の場合, L-グルタミンを含む高グルコース DMEM を追加し、それを補う 10%FPS と 1%ペニシリンとストレプトマイシン.摂氏37度と5%CO2で一晩細胞をインキュベートします。微視段階のCO2と暖房をオンにします。その後、顕微鏡をオンにし、ステージ上のウェルプレートを配置します。照明パターンを設定し、対象のセルをマークします。ヒドロゲルの表面に再び焦点を合わせます。明視野チャネルのセルの画像を取得します。変形状態のビーズの画像を撮るためには、チャンネルに切り替えます。その後、レーザーチャンネルに切り替え、3分間パターンに従ってセルを照らします。これは、1ミリメートルあたり6,000ミリジュールの用量に相当します。その後、チャネルを切り替えて、未変形状態のビーズの画像を取得します。牽引力を計算するには、横ドリフトを補正した蛍光ビーズ画像を開きます。牽引力の完全な分析は、添付のスクリプトで詳述されています。ヒドロゲル表面のマイクロパターン領域に対する細胞の選択的接着性を検証するために、サンプルを、事前標識されたマトリックスタンパク質を用いた蛍光顕微鏡法と、明視野顕微鏡で細胞を可視化して画像化した。ポリアクリルアミドヒドロゲルの機械的特性は、異なる量のアクリルアミドとビスアクリルアミドを混合することによって変化した。ヒドロゲルの剛性を原子間力顕微鏡によるナノインデンテーション実験で評価した。トラクションフォース測定は、ポリアクリルアミドヒドロゲルのミクロンサイズの領域を選択的に照射するために、空間的、時間的に制御された、紫外線レーザービーム照明を適用した後に行った。トラクションフォースは、一般化されたクロス検証によって選択された正規化パラメータを使用して、正規化されたFTTCを使用して再構築されました。光とマイクロパターン細胞の使用放出と組み合わせた引力顕微鏡に基づくモデルモジュラーアプローチは汎用性が高く、他の顕微鏡およびイメージング設定でさらに利用され、その解像度と感度を向上させる可能性があります。

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