Name: control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy
Uploaded: 2022-01-29T14:00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy at JoVE.com

Vi takker Fru Rebecca Alvarado for støtten i protokollvideoproduksjonen og Mr. Stephen Casale for konstruktiv kritikk av manuskriptet. Vi takker kollegene fra Institutt for cellulær biofysikk, Max Planck Institute for Medical Research for de nyttige diskusjonene. Den økonomiske støtten fra Max-Planck-Gesellschaft til E.A.C.-A. og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15 til E.A.C.-A. og P4 til USA; DFG EXC 2082/1-390761711 til USA) er også sterkt anerkjent. J.B. takk Carl Zeiss Foundation for økonomisk støtte. E.A.C.-A., C.S. og U.S.S. anerkjenner finansiering gjennom Max Planck School Matter to Life støttet av det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF). C.S. støttes av Det europeiske forskningsrådet (Consolidator Grant PHOTOMECH, nr.101001797).

1. Forberedelse av metakrylaterte deksler
MERK: Glassdeksler er metakrylatert for å kovalent koble PA hydrogeler og derfor forhindre deres løsrivelse under inkubasjon med celler. Mikroskopglassdeksler brukes til å oppnå høy bildekvalitet.
<ol><li>For å lage en 300 ml løsning, ta et rent 400 ml glassbeger og legg det inne i en avtrekkshette.</li>
	<li>Tilsett 10 ml dobbelt destillert vann (ddH2O) i begeret. Tilsett 18,75 ml eddiksyre (≥99,8 % proanalyse, p.a.), 18,75 ml 3-(Trimethoxysilyl)propylmetakrylat og 252,5 ml etanol (≥99,8 % p.a.) ved hjelp av en serologisk pipette. Hell løsningen i en krystalliserende tallerken.</li>
	<li>Rengjør 24 mm runde glassdeksler med presisjonsservietter. Plasser dekslene i et skreddersydd polytetrafluoretylenstativ.</li>
	<li>Senk stativet ned i oppløsningen og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur (RT).</li>
	<li>Ta stativet og skyll alle deksler med etanol (99,8% p.a.). Tørk dekslene under luftstrømmen. MERK: Methacrylated coverlips kan lagres i opptil 1 måned på RT.</li>
</ol>2. Mikropattering av ekstracellulære matriseproteiner på glassdeksler
MERK: Glassdeksler er først belagt med et lag av molekyler, bestående av protein og celleavstøtende. Dette laget fjernes deretter ved hjelp av en fotopatteringsteknikk, for å tillate etterfølgende avsetning av ekstracellulære matriseproteiner i mikropatternerte regioner.
<ol><li>Ta en 15 mm rund glassdekslerlip og legg den på en Petri-tallerken. Bruk en rombepenn til å markere oversiden av dekslene. Fortsett deretter med rengjøring via oksygenplasmabehandling på 0,4 mbar og 200 W i 2 minutter.</li>
	<li>Pipette 100 μL 0,01% poly-L-lysinoppløsning på overflaten av hvert deksle. Inkuber i 30 min ved RT. Vask dekslene med 10 mM 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES) pH 8,5. Fjern overflødig væske, men hold overflaten våt.</li>
	<li>Pipette 100 μL 50 mg/ml poly (etylenglykol) metyleteruccinimidyl valeriksyre (mPEG-SVA) i 10 mM HEPES pH 8,5 på overflaten av hvert deksle. Inkuber i 1 time ved RT. Skyll dekslene med 10 mM HEPES pH 8.5 og tørk av under luftstrømmen.</li>
	<li>Tilsett 2 μL UV-sensitiv fotoinitiator (f.eks. PLPP-gel) etterfulgt av 40 μL etanol (≥99,8 % p.a.) på overflaten. For å oppnå en homogen fordeling av gel og etanol på overflaten, vipp Petri-parabolen forsiktig frem og tilbake. Vent i 5 min for at løsningen skal polymeriseres.</li>
	<li>Legg en enkelt deksleslip inne i en 35 mm Petri-tallerken med et 20 mm hull i bunnen. Dette gjør at laserstrålen som kommer fra undersiden, kan nå glassoverflaten direkte.</li>
	<li>Slå på mikroskopet og en lysmønstermodul (arbeid med denne enheten er bare tillatt etter en sikkerhetsinnledning fra lasersikkerhetsansvarlige). Kalibrer UV-A-laseren på 20x luftmålet. Sett prøven med fotoinitiatoren på scenen. Juster fokuset på glassoverflaten og slå på fokuskontrollen. Last inn og lås det forhåndstegnede mønsteret.<ol>
<li>Forbered mønsteret ved hjelp av en grafikkprogramvare som Inkscape. Kontroller at mønsterfilen ikke overskrider DMD-dimensjonene (1824 x 1140 piksler, som tilsvarer 552 x 325 μm på 20 x objektiv (0,28 μm/px)). MERK: Det anbefales å bruke DMD-størrelsen (1824 x 1140 piksler) som mønsterfilstørrelse, da dette ikke vil sikre noen feil under mønsteret. Du må for eksempel ikke lage en mønsterfil med dimensjonen 1830 x 1130 piksler.</li>
		<li>Med tanke på mønsteroverføring til polyakrylamid, sørg for at mønsteret bare gjøres opptil 60% -70% av radiusen fra midten av glasset til kanten.</li>
		<li>For å mønstre en enkelt celle, bruk en diameter på 50-100 μm med en avstand på 100 μm mellom mønstre og en diameter på 150-300 μm for en cellegruppe. Den riktige mønsterstørrelsen avhenger sterkt av den typiske cellestørrelsen, og den må være tilstrekkelig stor til at cellene kan følge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Start mønsteret med UV-dose på 30 mJ/mm2. Mønstervarigheten avhenger av antall mønstre. Å lage et enkelt mønster tar omtrent 1 s.</li>
	<li>Etter å ha fullført mønstertrinnet, skyll overflaten med fosfatbufret saltvann (PBS) tre ganger. Inkuber prøven med 100 μL 25 μg/ml fibronektin oppløst i 1x PBS og 25 μg/ml fibrinogen Alexa488 konjugat i PBS i 1 time ved RT. For andre ECM-proteiner, finn de optimale konsentrasjonene som helt dekker de mønstrede områdene.</li>
	<li>Skyll overflaten med 1x PBS tre ganger. Påse at det mønstrede glasset umiddelbart brukes til glass-PA-overføring. Oppbevar det mønstrede glasset i PBS ved RT under hydrogelpreparatet.</li>
</ol>3. Fabrikasjon av mønstrede polyakrylamidhydrgeler
MERK: Polyakrylamidhydrgeler fremstilles, inkludert oksidert N-hydroksyetylakrylamid (HEA) for å presentere reaktive aldehydgrupper for kovalent binding av matriseproteiner på overflaten. I tillegg brukes en tolags tilnærming til å legge inn fluorescerende perler bare på det øverste laget av hydrogelen til å forbedre registreringen av perleforskyvning under mikroskopieksperimenter med trekkraft.
<ol><li>Legg de metakrylaterte glassdekslene i en Petri-tallerken.</li>
	<li>For å tilberede fersk oksidert HEA-løsning, tilsett 9,55 ml dobbeltdestillert vann i et 15 ml sentrifugerør. Tilsett deretter 0,5 ml HEA, og 42 mg natrium (meta)periodate for å få 10 ml av løsningen. Rør kontinuerlig løsningen i mørket i 4 timer.</li>
	<li>Bland akrylamid, bis-akrylamid og dobbeltdestillert vann i henhold til tabell 1, for å få 10 ml lagerløsning hydrogel (gjør det under avtrekkshetten, monomerer er nevrotoksiske). Degas og lukk lokket til en lufttett forsegling. MERK: Lagerløsningen kan oppbevares i aliquots i opptil 1 år ved 4 °C. Karakteriser alltid Ungdommens modul av hydrogelen før bruk.</li>
	<li>Forbered en tolags PA hydrogel (gjør det under avtrekkshetten, monomerer er nevrotoksiske).<ol>
<li>Start med bunnlaget ved å blande forsiktig 99,3 μL lagerløsning, 0,5 μL 1% ammoniumpersulfat (APS) og 0,2 μL tetrametyletylendiamin (TEMED) i et 1,5 ml rør. Ta 10 μL fra løsningen og pipette den dråpevis på midten av den metakrylaterte dekslen.</li>
		<li>Plasser forsiktig en 15 mm rund deksler på dråpen og vent i 45 min for polymerisering. Løsne forsiktig toppdekslene med en skalpell.</li>
		<li>For det øverste laget, Bland forsiktig 93,3 μLof lagerløsning med 1 μL fersk oksidert HEA-løsning, 5 μL fluorescerende perler (tilsvarende tre perler per kvadratmikron for perler på 200 nm størrelse perler), 0,5 μL 1% APS og 0,2 μL TEMED i et 1,5 ml rør. Ta 5 μL fra løsningen og pipette den dråpevis på midten av det allerede polymeriserte bunnlaget.</li>
		<li>Plasser de mikropatterned dekslene forsiktig på dråpen. Vent i 45 min på RT for at dråpen skal polymeriseres. Pass på at den mønstrede siden berører dråpen. Løsne forsiktig dekslene med en skalpell.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lim de 24 mm dekslene til bunnen av spesialborede 6-brønnsplater ved hjelp av to-komponent silikonlim. Etter 5 min, tilsett PBS til brønnene.</li>
	<li>Karakteriserer Youngs modulus av polyakrylamidhydrgelprøver ved atomkraftmikroskopi (AFM).<ol>
<li>Monter en sfærisk spisskantilever på AFM-holderen.</li>
		<li>Kalibrer hver cantilever ved å skaffe seg en kraftavstandskurve (3-4 V settpunkt) på et hardt substrat (f.eks. glass eller glimmer), ekstrapoler cantilever-følsomheten, trekk tilbake fra overflaten og utfør en termisk melodi for å få fjærkonstanten.</li>
		<li>Plasser de kalibrerte cantilevers over hydrogelprøven og skaff kraftkurver i PBS-buffer, ved hjelp av følgende parametere: 20-30 nN kraftsettpunkt, 5 eller 10 μm / s tilnærming og tilbaketrekkingshastighet, 5 μm rampestørrelse. MERK: Et invertert optisk mikroskop, utstyrt med et luftmål på 40x og et grønt fluorescerende proteinfilter (GFP), ble brukt til å visualisere og målrette ECM-mikropatternerte områder i PA-hydrogelprøvene.</li>
		<li>Plott den oppkjøpte kraften kontra avstandskurvene med AFM-analyseprogramvaren.</li>
		<li>Finn kontaktpunktet og konverter kraft kontra avstandskurver til kraft kontra innrykkskurver.</li>
		<li>Tilpass innrykksdelen av kurven med Hertz-modellen (eller en egnet mekanikkmodell i funksjon av spissgeometrien), ved hjelp av et Poisson-forhold mellom 0,2 og 0,5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Lokal frigjøring av celle trekkraft krefter ved UV-A laserbelysning (LUVI-TFM)
MERK: UV-A-laser påføres for å frigjøre trekkraftkrefter i celler lokalisert i definerte områder av hydrogelene. UV-A-laseren (dvs. λ = 375 nm solid state laser, <15 mW) er en klasse 3B laser. Den uskjermede laserstrålen er farlig for øynene og ofte for huden. Reflektert og spredt lys og stråling kan være farlig. Videre kan UV-stråling forårsake hudkreft. Arbeid med apparater er kun tillatt etter sikkerhetsinnføring fra lasersikkerhetsansvarlige.
<ol><li>Aspirer PBS fra brønnene.</li>
	<li>Frø 3 x 106 celler per 6-brønns plate i vekstmedium. For fibroblaster, bruk høy glukose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) som inneholder L-glutamin og supplert med 10% føtal Bovine Serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin. Inkuber cellene over natten ved 37 °C/5 % CO2. Vask prøver for å fjerne flytende celler før du starter mikroskopi.</li>
	<li>Slå på mikroskopinkubasjonskammeret og gassforsyningen for å oppnå en temperatur på 37 °C og 5 % CO2-atmosfære .</li>
	<li>Slå på mikroskopet og lasermønstermodulen. Kalibrer om nødvendig UV-A-laseren på 20x luftmålet ved hjelp av Leonardo-programvaren. Plasser den skreddersydde 6-brønnsplaten med prøvene på scenen. Juster fokuset på overflaten av PA.</li>
	<li>Sett opp belysningsmønsteret og merk cellene av interesse. Fokuser på overflaten av hydrogelen. Skaff deg bildet av cellene i brightfield-kanalen. Bytt til Cy5-kanalen (fjernt rødt filter, 650 nm eksitasjon, 670 nm utslipp) og ta et bilde av perler i deformert tilstand.</li>
	<li>Skift til laserkanalen. Slå på laseren i 3 min. I vårt spesielle oppsett tilsvarte dette en lysdose på 6000 mJ/mm2.</li>
	<li>Bytt til Cy5-kanalen og få et bilde av perlene i ubeformet tilstand. MERK: For forsøk med å bruke musens embryonale fibroblaster, vent i 15 minutter etter eksponering for å registrere referansen /undeformed image (se avsnittet Representative resultater ). Det kan være forskjellig for andre typer celler. Gjenta trinn 4.5-4.7 på nytt for en annen(e) celle(er) av interesse.</li>
	<li>For å måle forhøyet oksidativt stress etter UV-A-belysning, bruk det kommersielt tilgjengelige reagenset (CellRox). CellRox er ikke-fluorescerende i redusert tilstand, og når det oksideres av reaktive oksygenarter, fluoresces med et utslipp maksimalt ~ 665 nm.</li>
	<li>I henhold til den medfølgende protokollen, tilsett 5 μM reagens i bildemediet og inkuber i 30 min ved 37 °C/5 % CO2. Vask deretter cellene 3x med varm 1x PBS og erstatt bildemediet. Registrer Cy5-signalet ved fluorescensavbildning før og etter UV-A-belysning ved hjelp av en lignende lyseksponering.</li>
</ol>5. Bildebehandling, partikkelbildehastighet og beregning av trekkraftkrefter
MERK: Celle trekkraft krefter registreres ved å analysere forskyvning av fluorescerende perler og beregnes ved hjelp av bilde analyse verktøy basert på partikkel bilde velocimetry.
<ol><li>Åpne fluorescerende perler bilder, før (dvs. deformert) og etter laser (dvs. undeformert) ved hjelp av Fiji. Slå sammen to bilder som én stakk (bilde | Stabler | Bilder som skal stables).</li>
	<li>Riktig lateral drift mellom de to bildene ved hjelp av StackReg plugin (P. Thévenaz, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne). Endre bilder til 8-biters (bilde | Skriv inn | 8-biters) og skaleres til 1024 x 1024 pix (bilde | skala). Lagre som en bildesekvens (TIFF-format) med referansebildet alltid i begynnelsen.</li>
	<li>Anskaffe forskyvningsvektorfeltet ved hjelp av en krysskorrelasjonsteknikk19 fra PIV-feltet som implementert i OpenPIV-prosjektet.<ol>
<li>Forsikre deg om at det avslappede (ubeformede) bildet og det deformerte bildet er dekket med søkevinduer av størrelse wR og wD i piksler. For hvert søkevindu definerer du en krysskorrelasjonsfunksjon ved hjelp av følgende formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq01.jpg"> Her beskriver R(i,j) og D(i,j) intensitetsfeltene for de to bildene som er avkortet til det valgte søkevinduet og deretter speilpolert. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq02.jpg"> og <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq03.jpg"> beskrive gjennomsnittsverdien. Vindusstørrelsene velges som wR = 32 og wD = 32, og en overlapping på 70 % brukes mellom søkevinduene i nabolandene.</li>
		<li>For hvert søkevindu bestemmer en forskyvningsvektor <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq04.jpg"> som optimaliserer krysskorrelasjonsfunksjonen og tilordner den midterste plasseringen av søkevinduet. Subpikselnøyaktighet oppnås ved hjelp av en gaussisk passform rundt maxima-regionen som beskrevet20.</li>
		<li>Finn og fjern tvetydige forskyvningsvektorer. Forskyvningsvektorer som tilsvarer søkevinduer der forholdet mellom to høyeste lokale maksimering av krysskorrelasjonsfunksjonen under en terskel på 1,5 betraktes som tvetydig21.</li>
		<li>Kast forskyvningsvektorer som ikke består den normaliserte mediantesten for en restterskel på 1,522.</li>
		<li>(Valgfritt) Korriger den gjenværende laterale driften ved å trekke en fast vektor <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq05.jpg"> fra alle forskyvninger. Dette gjøres fordi forskyvningen i et merket område langt borte fra cellen forsvinner.</li>
		<li>Interpoler vektorfeltet for forskyvning til et vanlig rutenett med en avstand på 4 piksler av inndatabildene ved hjelp av en kubisk polynom interpolering. Manglende datapunkter fylles ved hjelp av en jevn bivariat spline-ekstrapolering. En forskyvningsvektor i piksler er relatert til en lokal deformasjon av bildepunktforholdet i bildet (0,33 μm/px for 20x luftlinse).</li>
		<li>(Valgfritt) Speilbeskytter bildet for å redusere ringeartefakter i den påfølgende analysen.</li>
		<li>Multipliser deformasjonsfeltet med en Tukey-vindusfunksjon for å eliminere kanteffekten på grunn av driftkorrigeringen, med en parameter på 0,2-0,3. I dette eksperimentet er det mikropatternerte området som er i sentrum av FOV av interesse.</li>
	</ol></li>
	<li>Rekonstruer trekkraften ved hjelp av regularisert Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC)18. Som regularisering bruker vi det enkleste rimelige valget, nemlig 0. En optimal regulariseringsparameter λ velges slik at den minimerer GCV-funksjonen (Generalized Cross Validation) definert av26: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq06.jpg"> Her er τλ en stablet vektor som inneholder x- og y-komponentene i det rekonstruerte trekkraftfeltet for den gitte verdien av λ for alle Fourier-prøvetakingsmoduser, og G er de lineære operatørtilordningsgrepfeltene til deres tilsvarende forskyvningsfelt, som definert for FTTC. Summen kjører over vektorkomponenter. ui er x- og y-komponentene i forskyvningsfeltet for alle Fourier-prøvemoduser. GCV er mye brukt innen dårlig poserte inverse problemer og er et godt alternativ til L-kurvekriteriet som ofte brukes i TFM. Et Lanzcos-filter brukes til å redusere artefakter som introduseres på grunn av det begrensede frekvensområdet og forskyvningsfeltets oppsampling. Trekkraftberegningen avhenger av Youngs modulus av PA (f.eks. 11,3 kPa) og Poissons forhold (f.eks. for PA i området mellom 0,2 og 0,5 avhengig av krysskoblingskonsentrasjon).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+neighborhood:+adhesion-coupled+cell+mechanosensors.">Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors.</a> Cell. 110 (2), 139-142 (2002).</li><li>Beningo, K. A., Hamao, K., Dembo, M., Wang, Y. -. l., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+of+fibroblasts+are+regulated+by+the+Rho-dependent+kinase+but+not+by+the+myosin+light+chain+kinase.">Traction forces of fibroblasts are regulated by the Rho-dependent kinase but not by the myosin light chain kinase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 456 (2), 7 (2006).</li><li>Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+traction+force+in+relation+to+cell+shape+and+focal+adhesions.">The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions.</a> Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).</li><li>Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+spread+area+and+traction+forces+determine+myosin-II-based+cortex+thickness+regulation.">Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation.</a> Biochimica Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123, 4201-4213 (2010).</li><li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+printing+by+light-induced+molecular+adsorption.">Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption.</a> Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).</li><li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microtubules: in vivo Methods in Cell Biology. , 133-146 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogel+micropatterning.">Polyacrylamide hydrogel micropatterning.</a> Methods Cell Biology. 120, 93-116 (2014).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Polacheck, W. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell-generated+forces:+a+guide+to+the+available+tools.">Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools.</a> Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1853, 3095-3104 (2015).</li><li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+forces+in+cell+biology.">Quantifying forces in cell biology.</a> Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).</li><li>Hanke, J., Probst, D., Zemel, A., Schwarz, U. S., Koster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+force+generation+by+spreading+platelets.">Dynamics of force generation by spreading platelets.</a> Soft Matter. 14 (31), 6571-6581 (2018).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+particle+image+velocimetry.">Digital particle image velocimetry.</a> Experiments in Fluids. 10, 181-193 (1991).</li><li>Lourenco, L., Krothapalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+accuracy+of+velocity+and+corticity+measurements+with+PIV.">On the accuracy of velocity and corticity measurements with PIV.</a> Experiments in Fluids. 18, 421-428 (1995).</li><li>Adrian, R. J., Westerweel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Particle Image Velocimetry. , (2011).</li><li>Westerweel, J., Scarano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+outlier+detection+for+PIV+data.">Universal outlier detection for PIV data.</a> Experiments in Fluids. 39 (6), 1096-1100 (2005).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+forces+at+focal+adhesions+from+elastic+substrate+data:+the+effect+of+localized+force+and+the+need+for+regularization.">Calculation of forces at focal adhesions from elastic substrate data: the effect of localized force and the need for regularization.</a> Biophysical Journal. 83 (3), 1380-1394 (2002).</li><li>Huang, Y., Gompper, G., Sabass, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bayesian+traction+force+microscopy+method+with+automated+denoising+in+a+user-friendly+software+package.">A Bayesian traction force microscopy method with automated denoising in a user-friendly software package.</a> Computer Physics Communications. 256, 107313 (2020).</li><li>Vedadghavami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+hydrogel+biomaterials+with+controlled+mechanical+properties+for+tissue+engineering+applications.">Manufacturing of hydrogel biomaterials with controlled mechanical properties for tissue engineering applications.</a> Acta Biomaterialia. 62, 42-63 (2017).</li><li>Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+soft+hydrogel+microindentation:+Impact+of+various+indentation+parameters+on+the+measurement+of+Young's+modulus.">Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus.</a> PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).</li><li>Oria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+loading+explains+spatial+sensing+of+ligands+by+cells.">Force loading explains spatial sensing of ligands by cells.</a> Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).</li><li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+cells+feel:+methods+for+thin+gels.">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).</li><li>Sen, S., Engler, A. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+strains+induced+by+cells:+Computing+how+far+cells+can+feel.">Matrix strains induced by cells: Computing how far cells can feel.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 2 (1), 39-48 (2009).</li><li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing.">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Letters. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li><li>Galluzzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+methodology+and+AFMech+Suite+software+for+nanomechanics+on+heterogeneous+soft+materials.">Atomic force microscopy methodology and AFMech Suite software for nanomechanics on heterogeneous soft materials.</a> Nat Communications. 9 (1), 3584 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

I denne protokollen beskriver vi fremstilling av mikropatterned PA hydrogeler som inneholder fluorescerende perler, som brukes som fiducial markører for TFM-studier. Vår tilnærming er basert på tre trinn: 1) tilberedning av tolags PA hydrogeler; 2) mikropattering av ECM-proteiner og deres overføring til hydrogeloverflaten; 3) bruk av mønstret nær UV-lys for TFM. Det eksperimentelle oppsettet for å analysere cellegrep til substratet krever bruk av lineære elastiske materialer med kjente stivhetsverdier for å beregne kreftene knyttet til forskyvning av fluorescerende perler26. PA hydrogeler er enkle å forberede, stivheten kan enkelt justeres, og de brukes ofte til stivhetssensor og TFM18,28. For å oppnå reproduserbare polymerisasjonstider og homogen polymerisering av hele hydrogelen, bør det imidlertid tas hensyn til lagring av forhold og tid for reagensene, for eksempel bør APS holdes i en desiccator for å unngå å miste sin aktivitet; TEMED skal beskyttes mot direkte lys. Bruken av oksidert HEA tillater kovalent binding av matriseproteiner på hydrogeloverflaten, noe som kan være fordelaktig for å oppnå dannelsen av et fullt og stabilt proteinlag. Den oksiderte HEA-oppløsningen skal tilberedes fersk hver gang PA-hydrogeler fremstilles. Den tolags PA hydrogelen gir tre hovedfordeler: 1) det gir en alternativ måte å reprodusere en homogen fordeling av fiducial perler nær hydrogeloverflaten, uten behov for å gjøre gelen ekstremt tynn (dvs. <20 μm). Kontroll over hydrogeltykkelsen er avgjørende for å oppnå nøyaktige målinger med TFM. Når det elastiske substratet er for tynt, kan sterke festeceller som fibroblaster føle og reagere mekanisk på det underliggende stive glasssubstratet29,30. Tykke hydrogeler gjør bildeanskaffelsen for kraftrekonstruksjonen mer utfordrende. Videre vil mange mikroskoper ikke ha tilstrekkelig plass til å imøtekomme dem, med tanke på den ekstra tykkelsen på glasssubstratet som brukes til å feste hydrogelen, med mindre ultratynne mikroskopiske lysbilder brukes. 2) I den tolags PA hydrogel oppnås den homogene fordelingen av fiducial perler nær overflaten av PA-hydrogelen uten å bruke sentrifuge, men heller med en enkel inkubasjon av presise mengder hydrogelløsninger og fluorescerende perler. Høy perletetthet er av betydelig fordel når du utfører PIV-analysen fordi den øker oppløsningen av trekkraftkreftene og signal-til-støy-forholdet uten behov for konfektmikroskopi. 3) Begrensende perler i et tynt lag nær cellematerialegrensesnittet muliggjør avbildning av trekkraftkrefter med epifluorescensmikroskop samt konfokale mikroskoper. Når du forbereder hydrogelen, bør brukeren sørge for at den fester seg godt til bunnglasset før du fortsetter med de påfølgende trinnene i protokollen. Vi anbefaler å følge inkubasjonstiden som er angitt for polymerisering av hydrogellagene, da det kan være vanskelig å fjerne glasset på toppen av overflaten uten å skade hydrogeloverflaten.
De mest kjente teknikkene for å måle elastiske egenskaper er AFM, nanoindentasjon, strekkprøver og reometri. Nanoindentasjon induserer imidlertid svært høye stammer på materialene som kan påvirke bestemmelsen av elastiske egenskaper. Strekkprøver og reometri er derimot makroskopiske måleteknikker, mens celler samhandler på en mikroskopisk skala31,32. AFM tillater målinger på mikroskalaen med reduserte stammer under fysiologiske forhold. Påliteligheten til AFM-målinger kan påvirkes negativt hvis eksperimentelle detaljer mangler (f.eks. innrykkskraft og hastighet) eller utilstrekkelige data registreres27. Huth et al. beskriver en algoritme for å trekke ut Youngs moduli fra AFM-data, som legger vekt på å holde måledetaljene konstante27. Denne algoritmen tilbyr en presis og pålitelig bestemmelse av Youngs moduli og ble brukt til våre eksperimenter. I tillegg målte vi mange kurver på prøver fremstilt på forskjellige dager og fikk svært like resultater (variasjon av gjennomsnittsverdier på ca. 1-2 kPa). Dette viser at stivheten i gelene våre kan forutsies pålitelig.
I denne protokollen bruker vi en fotopatteringsmodul for å lage mikropatternerte områder på glass, som deretter overføres til hydrogeloverflatene. Mikropatterningen som vises i denne protokollen er basert på DMD (digital mikrospeilenhet)-basert maskeløs nær UV-litografi (λ = 375 nm)7. En DMD består av et stort antall mikromirrorer på en brikke. En enkelt piksel tilsvarer ett enkelt mikrospeil. Bildefilen med pikselert mønster fra en datamaskin projiseres gjennom DMD og fokuserer på overflaten ved hjelp av et objektiv. For mikropattering av proteiner brukes det fokuserte laserlyset til å spalte avstøtende polymerbørster ved hjelp av en fotoinitiator. Etterpå er de eksponerte områdene fylt med ECM-proteiner. Denne maskeløse ablasjonsmetoden gir stor fleksibilitet i utformingen av nye mønstre, da den ikke er avhengig av bruk av en fotomaske. Det er veldig enkelt å designe og bruke et mønster, da det bare tar flere minutter å bruke en freeware som Inkscape. Antall mønstre og utvalg som produseres på kort tid er imidlertid en stor ulempe, da denne metoden bare kan brukes til å mønstre et enkelt substrat hver gang. Fotopatteringsmodulen bruker en laserkilde i nær UV-fast tilstand som avgir flere milliwatt. Den uskjermede laserstrålen er farlig for øynene og huden. Reflektert og spredt lys og stråling kan også være farlig. Håndtering må ledsages av en sikkerhetsinstruksjon fra laseroffiserer. Det mest kritiske trinnet i protokollen når du bruker en fotopatteringsmodul er å sikre at laseren under mikropatterningen og ablasjonen er riktig fokusert på overflaten. En konsistent belysningsdose (intensitet multiplisert med tid) av UV-lys under mønster er avhengig av hvordan laseren er fokusert på overflaten. En svak intensitet på overflaten på grunn av dårlig fokus kan føre til svikt i ECM-overføringen til hydrogeloverflaten, noe som resulterer i at ingen celler blir festet til hydrogelen.
I TFM-eksperimenter, etter den første avbildningen av tilhengerceller og fiducial markører, frigjøres celler fra PA-hydrogelen ved trypsinbehandling for å registrere deres avslappede tilstand. En ulempe med å utføre dette trinnet er å håndtere prøven på mikroskopistadiet. Uten et perfusjonskammer representerer åpning av lokket på parabolen, aspirering av medium, skylling og pipettering trypsin-løsning en utfordring for nybegynnere og erfarne brukere. Faktisk er disse prosedyrene en viktig kilde til driften i xyz-akser , noe som resulterer i tap av posisjon og fokus. Vår lokale UV-belysningsprotokoll gjør TFM til en mer tilgjengelig teknikk for nybegynnere. Det skal bemerkes at vi brukte en kommersielt tilgjengelig mikroskopibasert maskeringsfri fotopatteringsmodul, men i prinsippet kan ethvert UV-A-belysningssystem brukes, til slutt i kombinasjon med en maske for å beskytte regioner i underlagene, hvor cellegrep ikke skal registreres. Eksponering av celler med en betydelig dose synlig lys med lav bølgelengde (f.eks. fiolett lys som begeistrer DAPI-utslipp) vil føre til økende oksidativt stress, noe som kan føre til fototoksisitet og celledød. Derfor kan denne teknikken brukes selv i et epifluorescensmikroskop uten EN UV-lasermodul. Men siden intensiteten er mye svakere, vil det være mye lettere å oppnå TFM med den enzymatiske behandlingen i dette tilfellet.
Med LUVI-TFM er det mulig å bruke samme prøve for flere målinger på grunn av lokal løsrivelse av enkeltceller eller små grupper av celler. Det bør imidlertid tas hensyn til valg av celler for å løsne, for å unngå å registrere krefter fra nærliggende celler. Således, for enkeltcellemålinger i fravær av mikropatterns, bør overfylte regioner unngås; For målinger på enkeltmikropatternede celler, bør mønstrene utformes slik at avstanden mellom enkeltstrukturer er minst dobbelt så stor diameter som det mønstrede området. Vi anbefaler også at du ikke bruker celler fra tilstøtende mønstre i rekkefølge, men heller prøver dem fra fjerne områder på substratet. Vår måling er godt utført på et epifluorescence mikroskop utstyrt med en fokuskontrollfunksjon og en 40 x luft NA = 0,9 linse, hvor arbeidsavstanden til linsen er tilstrekkelig lang og den raske bevegelsen fra en brønn til en annen er svært justerbar. Den målrettede løsningen av celler for TFM-applikasjoner er effektiv for måling av cellulær kraft i en enkelt celle eller en hel liten celleklynge (f.eks. opptil 300 μm i diameter). Ved hjelp av oppsettet vårt observerte vi celleavrunding og løsrivelse for UV-behandling av enkeltceller (figur 3A), mens løsrivelse sjelden skjedde for små celleklynger. Dette kan føre til en undervurdering av celle trekkraft krefter. For større celleklynger anbefales enzymatisk løsrivelse, siden brukerne bør bruke et 20x luftmål for å avbilde hele klyngen og en fokuskontrollfunksjon er nødvendig. Siden fokusdybden til 20x-luftlinsen er mye lengre, vil håndteringen ikke være så kritisk som det høyere forstørrelsesmålet. Brukeren bør sørge for at fokuset er riktig innstilt for ablasjon av celler, siden belysningsdosen er avhengig av laserfokuset på overflaten. Selv om vi er klar over de mulige begrensningene ved bruk av LUVI-TFM i cellekollektiver på grunn av mulige mekaniske interaksjoner med nærliggende ubehandlede celler, kan dette aspektet faktisk vise seg å være nyttig for studier på mekanikken til målrettet celleekstrudering, for eksempel fra epitelale monolayers.
Til slutt, med vår TFM-tilnærming kombinert med lysindusert frigjøring av mikropatternede celler, tilbyr vi en robust og høy gjennomstrømningsprotokoll for å måle celleadhesjonskrefter. Allsidigheten til denne metoden kan utnyttes ytterligere ved hjelp av mikroskopi og bildebehandlingsoppsett med sikte på å forbedre oppløsning og følsomhet.

Når de samhandler med sitt ekstracellulære miljø, utøver tilhengerceller krefter som hovedsakelig formidles av integrinbaserte fokaladhesjoner som forbinder den ekstracellulære matrisen (ECM) til aktincytoskjelettet. Fokale vedheft er multiproteinsamlinger som er sentrert rundt bindingen av integrins til ECM-proteiner som fibronectin og kollagen. Integrinsk klynger og vekst av fokale vedheft er avgjørende ikke bare for etableringen av en mekanisk stabil forbindelse, men også for rekruttering av andre fokale vedheftproteiner, inkludert de som aktiverer RhoA-banen for regulering av cellulær kontraktilitet1. Den RhoA-avhengige kontraktiliteten til actin cytoskeleton gjør det mulig for celler å spre seg og migrere på den underliggende ECM, og også å føle stivheten2. Fordelingen av trekkraftkrefter avhenger sterkt av cellenes spredningsområde og form, som begge er avhengige av matriseegenskaper og påvirker derfor cytoskeletal organisering, og danner til slutt en lukket tilbakemeldingssløyfe mellom matrisemekanikk og cytoskeletal organisasjon3,4.
Overflatemikropatterningsteknikker tillater en definert kontroll av celleform ved å skape mikron-størrelse regioner som presenterer ECM-limproteiner; i henhold til størrelsen på disse regionene, enkeltceller eller grupper av celler som holder seg til micropattern5. ECM-proteiner kan mønstres på glasssubstrater ved forskjellige tilnærminger som mikrokontaktutskrift, fotomønster eller lasermønster6. Bruk av UV-lys (λ = 185 eller 375 nm) kombinert med overflate antifouling strategier gir fleksibiliteten til å designe ulike former og størrelser og immobilisering av flere proteintyper med høy presisjon nær overflatekanter7,8. Regionene belagt med proteinavstøtende kjemikalier som polyetylenglykol (PEG) er beskyttet med enten en kromfotomaske eller en digital speilenhet (DMD)-basert maskeløs litografisystem. Mønstrene i maskene tillater eksponering for UV-lys av regioner som deretter vil bli mønstret med ECM-proteiner. Mønsteret av hydrogeloverflater med ECM-proteiner krever et overføringstrinn for å fjerne proteiner fra glassoverflaten og krysskoble dem til mønstrene. Alternativt kan mønster på myke materialer oppnås ved først å belegge fotomasken med et avstøtende protein, etterfulgt av å brenne de umaskerte områdene ved hjelp av dyp UV-belysning. Siden dyp UV genererer ozon og gjør overflaten reaktiv for proteinbinding, er de umaskerte områdene belagt med ECM-proteiner, og til slutt polymeriseres gelen direkte på toppen av de umaskerte områdene9,10.
De mønstrede hydrogelene kan brukes til å utføre TFM, en teknikk som måler cellekrefter ved cellematerialegrensesnittet11. I 2D-TFM bruker man den flate overflaten av en tykk polymerfilm, der markørperler har blitt innebygd for å spore deformasjoner12,13,14,15. For å trekke ut forskyvningsvektorer er det viktig å kombinere to bilder, en av deformert tilstand og ett referansebilde uten deformasjoner. De to bildene tilordnes deretter til hverandre med bildebehandling. Ved høy markørtetthet gjøres dette vanligvis med PIV (Particle Image Velocimetry), som er en veletablert metode for å rekonstruere hydrodynamisk strømning. Ved lav markørtetthet og i 3D-TFM gjøres dette vanligvis med PTV (Particle Tracking Velocimetry), som inkluderer spesifikke funksjoner i det eksperimentelle datasettet. Et eksempel på et beregningsmessig billigere alternativ er optisk flyt, for eksempel Kanade-Lucas-Tomasi (KLT) algoritme16. Når det gjelder hydrogelsubstrater, er fluorescerende perler vanligvis innebygd ved høy tetthet under materialpolymeriseringen, og bilder registreres før og etter celleutgivelse ved enzymatisk løsing. Enzymatisk løsrivelse av tilhengerceller, for eksempel ved trypsinisering, fører til samtidig frigjøring av cellulære trekkrafter fra alle celler på hydrogelene, noe som gjør det vanskelig å få en detaljert analyse fra et høyt antall celler.
Her presenterer vi en protokoll for å forberede mikropatterned hydrogeler for å kontrollere celleform og lokalisering og en metode for effektivt å måle trekkraftkrefter i rekkefølge ved hjelp av UV for å løsne individuelle celler fra substratet. For trekkraftmålinger presenterer vi en teknikk for å produsere tolags PA-hydrogeler, der fluorescerende perler bare er innebygd i topplaget, noe som øker tettheten og reduserer deres vertikale spredning. Ved å kombinere UV-mediert frigjøring av cellulære trekkraftkrefter med mikropattering gjør det mulig å oppnå romlig kontroll over celleavløsning (f.eks. av enkeltceller uten å påvirke vedheft av andre celler i interesseområdet), forutsatt at det er tilstrekkelig avstand mellom mønstrede celler. Cellulær trekkraft rekonstrueres deretter ved hjelp av den mest effektive og pålitelige metoden for 2D-TFM, nemlig Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC) med regularisering17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>#440159</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>#33209</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %</td>
			<td>#1610140</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>#CP-CONT-BSG-A-G</td>
			<td>NanoAndMore</td>
			<td>5 &#956;m spherical tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system</td>
			<td>#NanoWizard3</td>
			<td>JPK</td>
			<td>Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>#A3678</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2 %</td>
			<td>#1610142</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#C11440-42U30</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#ANDORZYLA4.2</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox</td>
			<td>#C10422</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom incubator chamber</td>
			<td></td>
			<td>EMBLEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>#1300 100</td>
			<td>Picodent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>#41965</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Eclipse Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Axiovert200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>#9065.3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>#S181T</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>#F13191</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Alexa488 conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>#F1141</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8805</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (365/415)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8848</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (505/515)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8810</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (580/605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8807</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (660/680)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 15 mm round</td>
			<td>#41001115</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 24 mm round</td>
			<td>#41001124</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>#MRH08230</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>20x air NA 0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td>#CRL-2991</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>#MPEG-SVA-5000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxyethyl acrylamide</td>
			<td>#697931</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>#100-E</td>
			<td>TePla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>#PLPPgel</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>#P4823</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)</td>
			<td>#PLL(20-g[3.5]-PEG(2)</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium(meta) periodate</td>
			<td>#S1878</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>#17919</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Pattening module</td>
			<td>#PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVO cleaner</td>
			<td>#342-220</td>
			<td>Jelight</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy

Trekkraftmikroskopi (TFM) er hovedmetoden som brukes i mekanobiologi for å måle cellekrefter. Vanligvis brukes dette til celler som holder seg til flate myke substrater som deformeres under celle trekkraft (2D-TFM). TFM er avhengig av bruk av lineære elastiske materialer, som polydimetylsiloksan (PDMS) eller polyakrylamid (PA). For 2D-TFM på PA er vanskeligheten med å oppnå høye gjennomstrømningsresultater hovedsakelig fra den store variasjonen av celleformer og trekkrafter, og krever standardisering. Vi presenterer en protokoll for raskt og effektivt å fremstille mikropatterned PA hydrogeler for 2D-TFM-studier. Mikropatternene opprettes først av maskløs fotolitografi ved hjelp av nær UV-lys der ekstracellulære matriseproteiner bare binder seg til de mikropatternerte områdene, mens resten av overflaten forblir ikke-klebende for celler. Mikropattering av ekstracellulære matriseproteiner skyldes tilstedeværelsen av aktive aldehydgrupper, noe som resulterer i limområder av forskjellige former for å imøtekomme enten enkeltceller eller grupper av celler. For TFM-målinger bruker vi PA-hydrogeler av forskjellig elastisitet ved å variere mengden akrylamid og bisakrylamid og spore forskyvningen av innebygde fluorescerende perler for å rekonstruere celletraksjonsfelt med regularisert Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
For ytterligere å oppnå presis registrering av cellekrefter beskriver vi bruken av en kontrollert dose mønstret lys for å frigjøre cellegrep i definerte regioner for enkeltceller eller grupper av celler. Vi kaller denne metoden lokal UV-belysningskraftmikroskopi (LUVI-TFM). Ved enzymatisk behandling løsnes alle celler fra prøven samtidig, mens med LUVI-TFM kan trekkraftkrefter av celler i forskjellige regioner i prøven registreres i rekkefølge. Vi demonstrerer anvendelsen av denne protokollen (i) for å studere celletraksjonskrefter som en funksjon av kontrollert vedheft til substratet, og (ii) for å oppnå et større antall eksperimentelle observasjoner fra samme prøve.

PA-hydrogelene ble polymerisert på metakrylaterte glassdeksler, som presenterer reaktive grupper for kovalent kobling av PA. På denne måten, når hydrogelene plasseres i en vandig løsning, ble deres løsrivelse fra substratet forhindret (figur 1A-D). For å oppnå en høy tetthet av fiducial markører nær hydrogeloverflaten, utviklet vi utarbeidelsen av en tolags PA hydrogel. Bunnlaget, uten fluorescerende perler, ble polymerisert på den metakrylaterte dekslen. Deretter ble et annet lag som inneholder perler polymerisert på toppen av bunnlaget (figur 1E-H), som erstatter behovet for sedimentering, som ofte brukes til å oppnå perlefordeling i et enkelt fokalplan og øke perletettheten. For å oppnå kontroll over celleform under TFM-målinger produserte vi mikropatterned PA-hydrogeler via direkte overføring av fibronektinmønstrede mikrostrukturer fra en glassdekslelip til den prepolymererte PA (figur 1F-F'). Tilsetningen av 1% ikke-konvensjonell krysskobling (oksidert HEA) i den øverste hydrogellagløsningen gir aldehydgrupper som kovalent binder seg til amingrupper av fibronectin.
Vi forberedte PA hydrogeler, som er ca 60 μm i tykkelse og begrensede fluorescerende perler i det øvre laget nær hydrogeloverflaten. Denne typen hydrogel er et egnet substrat for avbildning av cellulære trekkrafter med inverterte mikroskoper og tykke nok (minimumstykkelse for å utføre TFM er rapportert å være 20-30 μm)18 for å forhindre innvirkning av glasssubstratet. Lokalisering av fluorescerende perler ble avbildet ved konfokal mikroskopi (figur 1I). For å visualisere proteinoverføring på hydrogelen brukte vi fluorescerende merkede ECM-proteiner og avbildet dem ved epifluorescensmikroskopi (figur 1J). Vi forberedte mikropatterned sirkler av fibronectin med en diameter på 100 μm (venstre side) og 50 μm (høyre side) for å tillate vedheft av grupper av celler eller enkeltceller, som vist i overlegget av lyse feltbilder av tilhørende celler, og fluorescerende merket fiducial perler og fibronectin mikropatterns. På en annen prøve ble adhesjonsresponsen til enkeltceller til mikropattern fibronectin validert av indirekte immunfluorescensmikroskopi for å avbilde lokaliseringen av fokale vedheftproteiner som paxillin (figur 1K).
Både ECM proteinbelegg og hydrogelstivhet er avgjørende parametere for celleadhesjon26. For å karakterisere de mekaniske egenskapene til våre PA-hydrogeler utførte vi nanoindentasjonseksperimenter av AFM27, kombinert med et epifluorescensmikroskop. Hydrogelsubstrater med tre ulike stivheter ble utarbeidet og testet med vårt oppsett (figur 2 og tabell 1). Sfæreformede AFM-cantilevers ble syklisk nærmet seg og trukket tilbake fra uberørte PA-hydrogeler og fibrinogen konjugert til Alexa488-mikropatternerte områder, mens de registrerte kraftavstandskurver. Deretter tillot kontaktpunktevaluering og anvendelse av Hertz-modellen oss å estimere Youngs modulus (E) for hvert utvalg. ECM-mikropatterning endret ikke Youngs modulus, som forble sammenlignbar med hver av de uberørte PA-hydrogelene.
For å måle trekkraftkrefter som utøves av tilhengerceller på substratet, utviklet vi et eksperimentelt oppsett for referansebasert TFM utført på et widefield epifluorescence mikroskop utstyrt med nær UV-lasermodul (UV-A 6000 mJ / mm2) for å frigjøre cellegrep (figur 3A). Siden laserstrålebelysningen kan styres romlig, er det ikke bare mulig å selektivt eksponere en enkelt celle eller en celleklynge med høy laserdose, men også og enda viktigere, det forstyrrende mellomtrinnet for cellefjerning fra hele prøven ved hjelp av et fordøyelsesenzym som trypsin er ikke lenger nødvendig. Belysning av celler med en så høy laserdose induserte et forhøyet oksidativt stress som førte til celledød (figur 3B). Celledød ga frigjøring av trekkraft fra substratet, som angitt av perleforskyvningen (illustrert i figur 3A). Vi kombinerte UV-A-belysningen med en lysmønstermodul for selektivt å belyse mikronstørrelsesregioner i PA-hydrogelene (figur 3B-C). På denne måten er det mulig å frigjøre trekkraftene til mikropatterned celleklynger (figur 3C, F) eller enkeltceller (figur 3B). Det er viktig at de mekaniske egenskapene til ECM-mønstrede hydrogeler på vårt tidspunkt ikke ble signifikant påvirket av UV-eksponering (figur 2C). Økning i oksidativt stress er vist i figur 3D,E. Trekkraftkreftene ble rekonstruert ved hjelp av regularisert FTTC med en regulariseringsparameter valgt av Generalized Cross Validation (Figur 3B,F). Frigjøringen av krefter for enkeltceller skjedde over en periode på 15 min, og resultatet av LUVI-TFM er sammenlignbart med den trypsinbaserte TFM (figur 3G-H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig01.jpg"> Figur 1: Skjema for mønstret fibronectin-substratforberedelse for TFM. (A) Oppløsningen for bunnlaget pipetteres på en metakrylert overflate. (B) En mindre, ren deksleslip er forsiktig plassert på dråpen. (C) Gelasjonstiden er 45 min. (D) Toppdekslene er løsnet. Det nederste laget er klart. (E) Oppløsningen for topplaget pipetteres på hydrogelen. (F) Den mønstrede dekslen er forsiktig plassert på dråpen. (F') Mikropattering av limproteiner på glass produseres ved maskeløs nær UV-litografi, og overføres deretter fra glass til PA hydrogel. De frie amingruppene av limproteiner, for eksempel fibronectin, binder seg kovalent til aldehydgrupper på PA-overflaten. (G) Gelasjonstiden er 45 min. (H) Toppdekslene er løsnet. Den mønstrede PA-hydrogelen er klar. (I) En 3D-representasjon av en konfokal xyz mikrograf som viser en høy tetthet av fiducial perler nær overflaten. (J) En mikrograf av fluorescerende merket fibronectin (magenta) på overflaten av PA med innebygde fluorescerende perler (grønn), overlagt med et lyst feltbilde av celler. (K) Indirekte immunfluorescensmikroskopiavbildning av en enkelt celle som holder seg til en sirkelformet fibronectinmikropattern (100 μm). Nucleus (blå), paxillin (rød). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig02.jpg"> Figur 2: Karakterisering av prøvemekaniske egenskaper ved AFM. (A) AFM nanoindentation eksperimentelt oppsett. En sfæreformet cantilever brukes til å sondere ECM mikropatterns før eller etter UV-behandling, og de ikke-mønstrede områdene av tolags PA (5% akrylamid, 0,3% Bis-akrylamid) områder. (B) Representativ kraft kontra innrykkskurve for ECM mikropattern (svart). Hertz fit (rød) brukes til å beregne Youngs modulus (E) av prøven. (C) Mekaniske målinger for ikke-mønstrede tolags PA-områder (ingen ECM), ECM mikropattern og ECM mikropattern etter UV-A-eksponering. Barene viser gjennomsnittlig ± S.E.M. (Brown-Forsythe og Welch ANOVA test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig03.jpg"> Figur 3. Lokal UV-A-belysning TFM (LUVI-TFM) muliggjør lokale trekkraftmålinger innenfor et stort synsfelt. (A) Ordning med lokal UV-A-belysning TFM. Celler behandles med en høy dose UV-A-laser for å få det ubeformede (referanse)bildet. (B) Brightfield-bildet av en enkelt celle før UV-A-laserbelysning. Midten: Brightfield-bildet av en enkelt celle etter UV-A-laserbelysning. Høyre: Trekkraft av en enkelt MEF som holder seg til en fibronektinbelagt PA-hydrogel (E = 5,74 kPa) opplyst med en UV-lysstråle med diameter på 50 μm (rød stiplet linje). (C) Venstre: Registrering av trekkraft krefter av en klynge av mus embryonale fibroblaster (MEF) som holder seg til mikropatterned fibronectin (sirkel, 100 μm diameter). Klyngen ble opplyst med en UV-lysstråle med diameter på 200 μm (rød stiplet linje). Høyre: Registrering av trekkraft krefter av en klynge av mus embryonale fibroblaster (MEF) som holder seg til mikropatterned fibronectin (sirkel, 300 μm diameter). Klyngen ble opplyst med en UV-lysstråle med diameter på 300 μm (rød stiplet linje). Skalastang = 200 μm. (D,E) En økning i oksidativt stress i celler indikert av den økte Cy5-signalintensiteten etter en høy UV-A-laserdose oppdages ved fluorescensmikroskopi. Det oksidative stresset fører til celledød. Skalastang = 200 μm. (F) Venstre: Spenningsvarmekartet fra en klynge av mus embryonale fibroblaster (MEF) som holder seg til mikropatterned fibronectin (sirkel, 100 μm diameter). Høyre: Stressvarmekartet fra en klynge av mus embryonale fibroblaster (MEF) som holder seg til mikropatterned fibronectin (sirkel, 300 μm diameter). (G) MEF-celler som holder seg til 100 μm fibronectin mikropatterns slipper sakte ut sine trekkrafter etter UV-A-eksponering. Full utgivelse oppnås etter 15 min (referansebildet ble deretter tatt 15 min etter eksponering). (H) En sammenligning med konvensjonelle trypsin basert-TFM for MEF celler som holder seg til 300 μm diameter mønstret-fibronectin. Resultatet av UV-A-belysning (6000 mJ/mm2) etterfulgt av 15 minutters venting er ikke signifikant forskjellig fra konvensjonell trypsinbehandling (dvs. 0,05% i 20 minutter). Stolpene viser gjennomsnittlig S.E.M. (to-tailed Student's t-test, ****P < 0,0001, * P < 0,05, ns P ≤0,5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Akrylamid (%)</td>
			<td>Bis-akrylamid (%)</td>
			<td>Akrylamid fra 40 % lageroppløsning (ml)</td>
			<td>Bis-akrylamid fra 2 % lageroppløsning (ml)</td>
			<td>Vann (ml)</td>
			<td>Youngs modulus (kPa)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>8.5</td>
			<td>5,74 ± 0,53</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.15</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.75</td>
			<td>8</td>
			<td>9,69 ± 0,68</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.3</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>7.25</td>
			<td>11,33 ± 1,06</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Blandinger av hydrogelbestandsløsninger og resulterende elastisitet
Alle data deponeres i Open Access Data Repository i The Max Planck Society (Edmond) og kan nås via følgende adresse: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy at JoVE.com

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Nær UV-litografi og trekkraftmikroskopi kombineres for å måle cellulære krefter på mikropatterned hydrogeler. Den målrettede lysinduserte frigjøringen av enkeltceller muliggjør et høyt antall målinger på samme prøve.

Kontroll av celleadhesjon ved hjelp av Hydrogel mønsterteknikker for applikasjoner i trekkraft kraftmikroskopi

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Det overordnede målet med denne prosedyren er å fremstille mikromønsterhydrgeler for 2D-trekkraftmikroskopistudier. Dette oppnås ved først å lage et metakrylatert glassdeksel som glir og danner det første laget av en polyakrylamidhydrgel på den. Det andre trinnet er å lage et annet hydrogellag som inneholder fluorescerende perler for trekkraftmikroskopi.Hydrogelen er sandwiched med et mikromønsterdeksel på toppen av det, noe som resulterer i overføring av mikromønstermatriseproteiner på hydrogeloverflaten. Deretter blir polyakrylamidhydrgelen igjen for å polymerisere ved romtemperatur i 45 minutter. Toppdekselslippet fjernes deretter forsiktig.Fluorescensmikroskopiavbildning brukes til å vise tilstedeværelsen av perlene og vellykket overføring av mikromønstrede ekstracellulære matriseproteiner. Denne metoden bidrar til å effektivt og presist måle flere trekkraftkrefter ved å bruke lyset og bruke frigjøring av celler. Gjøre det mulig å oppnå et høyere antall eksperimentell observasjon fra samme utvalg.Så å demonstrere prosedyren vil være Joel Christian, en avgangsstudent fra laboratoriet mitt. Tilsett 10 milliliter dobbelt destillert vann i et beger. Deretter tilsettes 18,75 milliliter eddiksyre, 18,75 milliliter 3-propylmetakrylat og 252,5 milliliter etanol til løsningen.Når løsningen er fullført, overfør den til en krystalliserende tallerken. Ta 24 millimeter runde dekselslipper, rengjør dem med en presisjonsserviett, og legg dem i et skreddersydd teflonstativ. Senk den deretter ned i løsningen og inkuber i 15 minutter.Ta stativet og skyll det med etanol. Tørk dekselet under luftstrøm. Metakrylaterte dekselslipper kan lagres opptil en måned ved romtemperatur.Ta en 15 millimeter rund dekselslipp og sett den på en Petri-tallerken. Bruk en rombepenn til å markere oversiden av dekselslippet. Fortsett deretter med rengjøring via oksygenplasmabehandling.Dekselslippet er rent på 0,4 millibar og 200 watt i to minutter. Pipette 100 mikroliter av 0,01% av Poly-L-Lysine-løsningen på overflaten av dekselet glir og inkuberer i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter vasker du dekselslippet med 10 millimolar ved en pH på 8,5.Ta ut overflødig væske, men hold overflaten våt. Pipette 100 mikroliter med 50 milligram per milliliter mPEG-SVA i 10 millimolar pH 8,5 oppløsning på overflaten av dekselet glir og inkuberer i en time ved romtemperatur. Skyll deretter dekselet med 10 millimolar pH 8,5.Tilsett deretter to mikroliter PLPP gel etterfulgt av 40 mikroliter etanol på overflaten. Vipp Petri-parabolen forsiktig for å homogenisere løsningen. Vent i fem minutter til løsningen polariserer.Plasser dekselslippet inne i et 35 millimeter bunnhull Petri-tallerken. Sett Petri-parabolen som inneholder dekselslippet på mikroskopstadiet. Juster fokuset på glassoverflaten.Last inn og lås det forhåndstegnede mønsteret. Start mønsteret med UV-dose på 30 millijoule per millimeter kvadrert. Etter å ha fullført mønstertrinnet, ta ut mønsterdekselslippet og skyll overflaten med PBS.Inkuber prøven med en 100-mikroliterblanding på 25 mikrogram per milliliter fibronektin og 25 mikrogram per milliliter fibrinogen konjugert med Alexa 488 oppløst i PBS i en time ved romtemperatur. For å forberede hydrogelsubstratet, begynn med å sette det metakrylaterte dekselet gli inn i en Petri-tallerken. For å starte, lag fersk oksidert AgA-løsning ved å legge til 9,55 milliliter dobbelt destillert vann i et 15 milliliter Falcon-rør.Tilsett deretter 0,5 milliliter AgA. Tilsett deretter 42 milligram natriummeta pyruvat til løsningen. Sett løsningen på shakeren i fire timer.Forbered deretter lagerløsningen ved å blande akrylamid, bis-akrylamid og dobbelt destillert vann i henhold til tabell 1. Lagerløsningen kan holdes i opptil et år ved fire grader Celsius. Forbered arbeidsløsningen for bunnlaget ved å blande 99,3 mikroliter lagerløsning med 0,5 mikroliter ammoniumpersulfat 1% og 0,2 mikroliter TEMED.Ta 10 mikroliter fra løsningen og pipettedråpevis på den metakrylaterte dekselslippet. Plasser forsiktig en 15 millimeter rund dekselslipp på dråpen og vent i 45 minutter for at den skal polymeriseres. Deretter løsner du toppdekselslippet med skalpellen.Forbered deretter arbeidsløsningen for topplaget ved å blande 93,3 mikroliter lagerløsning med en mikroliter oksidert HEA, fem mikroliter fluorescerende perler, 0,5 mikroliter ammoniumpersulfat 1% og 0,2 mikroliter TEMED. Ta fem mikroliter fra løsningen og pipette den drop-wise på bunnlaget hydrogel. Plasser forsiktig en mikromønsterdekselslipp på dråpen.Vent i 45 minutter til den polymeriseres. Løsne forsiktig dekselslippet med en skalpell. Og lim dekselet på bunnen av en tilpasset boret seksbrønnsplate.Tilsett PBS i brønnene. For å se cellene aspirerer du PBS fra seksbrønnplaten. For fibroblaster, tilsett høy glukose DMEM som inneholder L-glutamin og supplere det med 10% FPS og 1% penicillin og streptomycin.Inkuber cellene over natten ved 37 grader Celsius og 5% CO2. Slå på CO2 og oppvarming for mikroskopitrinnet. Slå deretter på mikroskopet og plasser brønnplaten på scenen.Sett opp belysningsmønsteret og merk celler av interesse. Fokuser på overflaten av hydrogelen. Skaff deg bildet av cellene i brightfield-kanalen.Hvis du vil ta bildet av perlene i deformert tilstand, bytter du til kanalen. Bytt deretter til laserkanalen og belys cellen i henhold til mønsteret i tre minutter. Dette tilsvarer en dose på 6000 millijoule per millimeter kvadrert.Deretter bytter du kanal og skaffer bildet av perlene i ubeformet tilstand. For å beregne trekkraftkreftene, åpne fluorescerende perlebilder som allerede er korrigert for lateral drift. Den komplette analysen av trekkraftkrefter er detaljert i vedlagte skript.For å verifisere selektiv vedheft av celler til de mikromønstrede områdene på hydrogeloverflaten, ble prøver avbildet med fluorescerende mikroskopi ved hjelp av forhåndsmerkede matriseproteiner og med brightfieldmikroskopi for å visualisere celler. De mekaniske egenskapene til polyakrylamidhydrgeler ble variert ved å blande forskjellige mengder akrylamid og bis-akrylamid. Hydrogelens stivhet ble evaluert med nanoindentasjonseksperimenter ved atomkraftmikroskopi.Trekkraftmålinger ble utført etter påføring av en romlig, temporalt kontrollert, ultrafiolett laserstrålebelysning for å selektivt belyse mikronstørrelsesregioner i polyakrylamidhydrgelen. Trekkraftkreftene ble rekonstruert ved hjelp av regularisert FTTC med en regulariseringsparameter valgt av generalisert kryssvalidering. Vår modell modulære tilnærming basert på tiltrekningskraftmikroskopi kombinert med lys og bruk av mikromønsterceller er allsidig og kan utnyttes ytterligere med annet mikroskopi- og bildeoppsett for å forbedre oppløsningen og følsomheten.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Engineering A Bilayered Hydrogel å kontrollere ASC differensiering

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering av Cortex Organisasjon og Dynamics i Mikroorganismer, bruke Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Samtidig Fange sanntidsbilder i to utslippskanalen med en Dual Camera Emission Splitting System: Søknader til celle adhesjon

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metode for lokalisering Reporter fluoriserende perler Nær Cell Culture Surface for trekkraft Mikros

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Ved hjelp av Cell-substrat Impedans og Live Cell Imaging å måle sanntid Endringer i Cellular Grep og De-adhesjon indusert av Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging and Force spektroskopi av Supported lipidbilag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Lys-mediert Dannelse og fordelingen av Hydrogeler for cellekultur Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Mønstre bioaktive proteiner eller peptider på Hydrogel bruker fotokjemi for biologiske programmer

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Mønstre geometrien av menneskelige embryonale Stamcelle kolonier på kompatible underlag for å kontrollere vevs nivået mekanikk

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Fabrikasjon og implementering av en referanse-fri traction Force mikroskopi plattform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...