Name: control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy
Uploaded: 2022-01-29T14:00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy at JoVE.com

Мы благодарим г-жу Ребекку Альварадо за поддержку в производстве протокольного видео и г-на Стивена Казале за конструктивную критику рукописи. Мы благодарим коллег из Отдела клеточной биофизики Института медицинских исследований Макса Планка за полезные дискуссии. Финансовая поддержка со стороны Общества Макса Планка E.A.C.-A. и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15 - E.A.C.-A. и P4 - U.S.S.; DFG EXC 2082/1-390761711 в США) также широко признается. J.B. благодарит Фонд Carl Zeiss за финансовую поддержку. E.A.C.-A., C.S. и U.S.S. признают финансирование через Max Planck School Matter to Life при поддержке Федерального министерства образования и исследований Германии (BMBF). C.S. поддерживается Европейским исследовательским советом (Consolidator Grant PHOTOMECH, no.101001797).

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+neighborhood:+adhesion-coupled+cell+mechanosensors.">Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors.</a> Cell. 110 (2), 139-142 (2002).</li><li>Beningo, K. A., Hamao, K., Dembo, M., Wang, Y. -. l., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+of+fibroblasts+are+regulated+by+the+Rho-dependent+kinase+but+not+by+the+myosin+light+chain+kinase.">Traction forces of fibroblasts are regulated by the Rho-dependent kinase but not by the myosin light chain kinase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 456 (2), 7 (2006).</li><li>Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+traction+force+in+relation+to+cell+shape+and+focal+adhesions.">The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions.</a> Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).</li><li>Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+spread+area+and+traction+forces+determine+myosin-II-based+cortex+thickness+regulation.">Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation.</a> Biochimica Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123, 4201-4213 (2010).</li><li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+printing+by+light-induced+molecular+adsorption.">Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption.</a> Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).</li><li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microtubules: in vivo Methods in Cell Biology. , 133-146 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogel+micropatterning.">Polyacrylamide hydrogel micropatterning.</a> Methods Cell Biology. 120, 93-116 (2014).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Polacheck, W. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell-generated+forces:+a+guide+to+the+available+tools.">Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools.</a> Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1853, 3095-3104 (2015).</li><li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+forces+in+cell+biology.">Quantifying forces in cell biology.</a> Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).</li><li>Hanke, J., Probst, D., Zemel, A., Schwarz, U. S., Koster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+force+generation+by+spreading+platelets.">Dynamics of force generation by spreading platelets.</a> Soft Matter. 14 (31), 6571-6581 (2018).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+particle+image+velocimetry.">Digital particle image velocimetry.</a> Experiments in Fluids. 10, 181-193 (1991).</li><li>Lourenco, L., Krothapalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+accuracy+of+velocity+and+corticity+measurements+with+PIV.">On the accuracy of velocity and corticity measurements with PIV.</a> Experiments in Fluids. 18, 421-428 (1995).</li><li>Adrian, R. J., Westerweel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Particle Image Velocimetry. , (2011).</li><li>Westerweel, J., Scarano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+outlier+detection+for+PIV+data.">Universal outlier detection for PIV data.</a> Experiments in Fluids. 39 (6), 1096-1100 (2005).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+forces+at+focal+adhesions+from+elastic+substrate+data:+the+effect+of+localized+force+and+the+need+for+regularization.">Calculation of forces at focal adhesions from elastic substrate data: the effect of localized force and the need for regularization.</a> Biophysical Journal. 83 (3), 1380-1394 (2002).</li><li>Huang, Y., Gompper, G., Sabass, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bayesian+traction+force+microscopy+method+with+automated+denoising+in+a+user-friendly+software+package.">A Bayesian traction force microscopy method with automated denoising in a user-friendly software package.</a> Computer Physics Communications. 256, 107313 (2020).</li><li>Vedadghavami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+hydrogel+biomaterials+with+controlled+mechanical+properties+for+tissue+engineering+applications.">Manufacturing of hydrogel biomaterials with controlled mechanical properties for tissue engineering applications.</a> Acta Biomaterialia. 62, 42-63 (2017).</li><li>Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+soft+hydrogel+microindentation:+Impact+of+various+indentation+parameters+on+the+measurement+of+Young's+modulus.">Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus.</a> PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).</li><li>Oria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+loading+explains+spatial+sensing+of+ligands+by+cells.">Force loading explains spatial sensing of ligands by cells.</a> Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).</li><li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+cells+feel:+methods+for+thin+gels.">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).</li><li>Sen, S., Engler, A. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+strains+induced+by+cells:+Computing+how+far+cells+can+feel.">Matrix strains induced by cells: Computing how far cells can feel.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 2 (1), 39-48 (2009).</li><li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing.">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Letters. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li><li>Galluzzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+methodology+and+AFMech+Suite+software+for+nanomechanics+on+heterogeneous+soft+materials.">Atomic force microscopy methodology and AFMech Suite software for nanomechanics on heterogeneous soft materials.</a> Nat Communications. 9 (1), 3584 (2018).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

В этом протоколе мы описываем получение микроструктурированных гидрогелей ПА, содержащих флуоресцентные шарики, которые используются в качестве фидуциальных маркеров для исследований TFM. Наш подход основан на трех этапах: 1) получение двухслойных гидрогелей ПА; 2) микроструктурирование белков ECM и перенос их на поверхность гидрогеля; 3) использование узорчатого ближнего УФ-света для TFM. Экспериментальная установка для анализа тяги клеток к подложке требует использования линейных упругих материалов с известными значениями жесткости для расчета сил, связанных со смещением флуоресцентных шариков26. Гидрогели PA просты в приготовлении, жесткость может быть легко настроена, и они обычно используются для измерения жесткости и TFM18,28. Однако для получения воспроизводимого времени полимеризации и однородной полимеризации всего гидрогеля следует обратить внимание на условия хранения и время хранения реагентов, например, APS следует хранить в осушителе, чтобы избежать потери своей активности; TEMED должен быть защищен от прямого света. Использование окисленного HEA позволяет ковалентное связывание матричных белков на поверхности гидрогеля, что может быть выгодно для достижения образования полного и стабильного белкового слоя. Окисленный раствор HEA следует готовить свежим каждый раз, когда изготавливаются гидрогели ПА. Двухслойный гидрогель ПА предлагает три основных преимущества: 1) он обеспечивает альтернативный способ воспроизводимого получения однородного распределения фидуциальных шариков вблизи поверхности гидрогеля без необходимости делать гель чрезвычайно тонким (т.е. <20 мкм). Контроль толщины гидрогеля имеет решающее значение для получения точных измерений с помощью TFM. Когда эластичная подложка слишком тонкая, сильные адгезивные клетки, такие как фибробласты, могут ощущать и механически реагировать на лежащую в основе жесткую стеклянную подложку29,30. Толстые гидрогели усложняют получение изображения для силовой реконструкции. Более того, многие микроскопы не будут иметь достаточного пространства для их размещения, учитывая дополнительную толщину стеклянной подложки, используемой для прикрепления гидрогеля, если не используются ультратонкие микроскопические слайды. 2) В двухслойном гидрогеле ПА однородное распределение фидуциальных шариков вблизи поверхности гидрогеля ПА достигается без использования центрифуги, а путем простой инкубации точных количеств растворов гидрогеля и флуоресцентных шариков. Высокая плотность шариков имеет значительное преимущество при выполнении анализа PIV, поскольку она увеличивает разрешение тяговых сил и отношение сигнал/шум без необходимости конфокальной микроскопии. 3) Ограничение шариков тонким слоем, близким к интерфейсу клеточного материала, позволяет визуализировать тяговые силы с помощью эпифлуоресцентных микроскопов, а также конфокальных микроскопов. При приготовлении гидрогеля пользователь должен убедиться, что он прочно прилипает к нижнему стеклу, прежде чем приступать к последующим этапам протокола. Мы рекомендуем соблюдать время инкубации, указанное для полимеризации слоев гидрогеля, так как может быть трудно удалить стекло поверх поверхности, не повредив поверхность гидрогеля.
Наиболее известными методами измерения упругих свойств являются AFM, наноиндентирование, испытания на растяжение и реометрия. Однако наноиндентирование вызывает очень высокие нагрузки на материалы, которые могут влиять на определение упругих свойств. Испытания на растяжение и реометрия, с другой стороны, являются макроскопическими методами измерения, тогда как клетки взаимодействуют в микроскопическом масштабе31,32. AFM позволяет проводить измерения на микроуровне с уменьшенными штаммами в физиологических условиях. На надежность измерений ОВМ может отрицательно сказаться, если отсутствуют экспериментальные детали (например, сила отступа и скорость) или регистрируется недостаточно данных27. Huth et al. описывает алгоритм извлечения модулей Юнга из данных AFM, который подчеркивает сохранение деталей измерения постоянными27. Этот алгоритм предлагает точное и надежное определение модулей Юнга и использовался для наших экспериментов. Кроме того, мы измерили много кривых на образцах, изготовленных в разные дни, и получили очень похожие результаты (вариация средних значений около 1-2 кПа). Это показывает, что жесткость наших гелей может быть надежно предсказана.
В этом протоколе мы используем модуль фотоструктурирования для создания микроструктурированных областей на стекле, которые затем переносятся на поверхности гидрогеля. Микроструктурирование, показанное в этом протоколе, основано на безмасочной литографии без маски DMD (цифровое микрозеркальное устройство) (λ = 375 нм)7. МДД состоит из большого количества микрозеркал на чипе. Один пиксель соответствует одному микрозеркалу. Файл пиксельного изображения шаблона с компьютера проецируется через DMD и фокусируется на поверхности с помощью объектива. Для микроструктурирования белков сфокусированный лазерный свет используется для расщепления репеллентных полимерных кистей с помощью фотоинициатора. После этого открытые области заполняются белками ECM. Этот метод абляции без маски предлагает большую гибкость в разработке новых шаблонов, поскольку он не полагается на использование фотомаски. Разработка и применение шаблона очень просты, так как это занимает всего несколько минут с использованием бесплатного программного обеспечения, такого как Inkscape. Тем не менее, количество образцов и образцов, полученных за короткий промежуток времени, является основным недостатком, поскольку этот метод может быть использован только для моделирования одной подложки каждый раз. Модуль фотоструктурирования использует почти УФ-твердотельный лазерный источник, который излучает несколько милливатт. Неэкранированный лазерный луч опасен для глаз и кожи. Отраженный и рассеянный свет и излучение также могут быть опасными. Управление должно сопровождаться инструкцией по технике безопасности от лазерных офицеров. Наиболее важным шагом в протоколе при использовании модуля фотоструктурирования является обеспечение того, чтобы во время микроструктурирования и абляции лазер правильно фокусировался на поверхности. Постоянная доза освещения (интенсивность, умноженная на время) ультрафиолетового света во время моделирования зависит от того, как лазер сфокусирован на поверхности. Слабая интенсивность на поверхности из-за плохой фокусировки может привести к нарушению переноса ECM на поверхность гидрогеля, что приведет к тому, что клетки не будут прикреплены к гидрогелю.
В экспериментах TFM после первоначальной визуализации адгезивных клеток и фидуциальных маркеров клетки высвобождаются из гидрогеля ПА путем лечения трипсином для записи их расслабленного состояния. Недостатком выполнения этого шага является обработка образца на стадии микроскопии. Без перфузионной камеры открытие крышки тарелки, аспирация среды, промывка и пипетка раствора трипсина представляют собой проблему для начинающих и опытных пользователей. Фактически, эти процедуры являются основным источником дрейфа в осях xyz , что приводит к потере положения и фокуса. Наш протокол локального УФ-освещения делает TFM более доступной техникой для начинающих. Следует отметить, что мы использовали коммерчески доступный модуль фотоструктурирования на основе микроскопии, но в принципе можно было использовать любую систему освещения UV-A, в конечном итоге в сочетании с маской для защиты областей подложек, где силы тяги клеток не должны регистрироваться. Воздействие на клетки значительной дозы низковолнового видимого света (например, фиолетового света, который возбуждает излучение DAPI) приведет к увеличению окислительного стресса, что может привести к фототоксичности и гибели клеток. Поэтому данная методика может применяться даже в эпифлуоресцентном микроскопе без модуля УФ-лазера. Однако, поскольку интенсивность намного слабее, в этом случае будет намного легче выполнить TFM с ферментативным лечением.
С LUVI-TFM можно использовать один и тот же образец для нескольких измерений из-за локальной отслойки отдельных клеток или небольших групп клеток. Однако следует обратить внимание на отбор клеток для отсоединения, чтобы избежать регистрации сил от соседних клеток. Таким образом, для одноклеточных измерений при отсутствии микроструктур следует избегать переполненных областей; для измерений на одиночных микроструктурированных ячейках узоры должны быть спроектированы таким образом, чтобы расстояние между одиночными структурами по меньшей мере в два раза превышало диаметр узорчатой области. Мы также рекомендуем не использовать клетки из соседних паттернов последовательно, а скорее отбирать их из отдаленных областей на подложке. Наше измерение хорошо проводится на эпифлуоресцентном микроскопе, оснащенном функцией управления фокусировкой и линзой 40 x air NA = 0,9, где рабочее расстояние объектива достаточно велико, а быстрое движение от одного колодца к другому очень настраивается. Целевое отделение клеток для применения TFM эффективно для измерения клеточной силы одной клетки или целого кластера малых клеток (например, до 300 мкм в диаметре). Используя нашу установку, мы наблюдали округление и отслоение клеток для УФ-обработки одиночных клеток (рисунок 3A), тогда как отслоение редко происходило для кластеров мелких клеток. Это может привести к недооценке сил тяги клеток. Для больших кластеров клеток рекомендуется ферментативное отделение, так как пользователи должны использовать 20-кратный воздушный объектив для изображения всего кластера, и необходима функция управления фокусировкой. Поскольку глубина фокусировки 20-кратного воздушного объектива намного больше, управляемость не будет такой критической, как при более высоком увеличении объектива. Пользователь должен убедиться, что фокус правильно настроен для абляции клеток, так как доза освещения зависит от лазерного фокуса на поверхности. Хотя мы знаем о возможных ограничениях в использовании LUVI-TFM в клеточных коллективах из-за возможных механических взаимодействий с соседними необработанными клетками, этот аспект может оказаться полезным для исследований механики экструзии целевых клеток, например, из эпителиальных монослоев.
В заключение, благодаря нашему подходу TFM в сочетании со светоиндуцированным высвобождением микроструктурированных клеток, мы обеспечиваем надежный и высокопроизводительный протокол для измерения сил адгезии клеток. Универсальность этого метода может быть дополнительно использована с использованием микроскопии и настройки визуализации, направленной на улучшение разрешения и чувствительности.

При взаимодействии со своей внеклеточной средой адгезивные клетки оказывают силы, которые в основном опосредованы фокальными спайками на основе интегрина, соединяющими внеклеточный матрикс (ECM) с актиновым цитоскелетом. Фокальные спайки представляют собой многопротеиновые сборки, которые сосредоточены вокруг связывания интегринов с ECM-белками, такими как фибронектин и коллаген. Кластеризация интегрина и рост очаговых спаек имеют решающее значение не только для установления механически стабильного соединения, но и для рекрутирования других белков фокальной адгезии, в том числе активирующих путь RhoA для регуляции клеточной сократимости1. RhoA-зависимая сократимость актинового цитоскелета позволяет клеткам распространяться и мигрировать на лежащем в основе ECM, а также ощущать его жесткость2. Распределение сил тяги сильно зависит от площади и формы распространения клеток, которые зависят от свойств матрицы и, следовательно, влияют на организацию цитоскелета, в конечном итоге образуя замкнутую петлю обратной связи между матричной механикой и цитоскелетной организацией3,4.
Методы поверхностного микроструктурирования позволяют определенно контролировать форму клеток путем создания областей микронного размера, представляющих адгезивные белки ECM; в зависимости от размера этих областей, одиночных клеток или групп клеток, которые прилипают к микрошаблону5. Белки ECM могут быть структурированы на стеклянных подложках с помощью различных подходов, таких как микроконтактная печать, фотоструктурирование или лазерное моделирование6. Использование ультрафиолетового света (λ = 185 или 375 нм) в сочетании со стратегиями поверхностного противообрастания обеспечивает гибкость для проектирования различных форм и размеров и иммобилизации нескольких типов белков с высокой точностью вблизи краев поверхности7,8. Области, покрытые химическими веществами, отталкивающими белок, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), защищены либо хромовой фотомаской, либо системой литографии на основе цифрового зеркального устройства (МДД). Узоры в масках позволяют подвергать воздействию ультрафиолетового света областей, которые затем будут структурированы белками ECM. Структурирование поверхностей гидрогеля белками ECM требует стадии переноса для удаления белков со стеклянной поверхности и сшивания их с узорами. Альтернативно, рисунок на мягких материалах может быть достигнут путем предварительного покрытия фотомаски репеллентным белком, а затем сжигания незамаскированных областей с использованием глубокого ультрафиолетового освещения. Поскольку глубокий УФ-излучение генерирует озон и делает поверхность реакционноспособной для связывания белка, незамаскированные области покрываются белками ECM и, наконец, гель полимеризуется непосредственно поверх незамаскированных областей9,10.
Узорчатые гидрогели могут быть использованы для выполнения TFM, метода, который измеряет клеточные силы на границе раздела ячейка-материал11. В 2D-TFM используется плоская поверхность толстой полимерной пленки, в которую встроены маркерные шарики для отслеживания деформаций12,13,14,15. Чтобы извлечь векторы смещения, необходимо объединить два изображения, одно из деформированного состояния и одно эталонное изображение без деформаций. Затем два изображения сопоставляются друг с другом с помощью обработки изображений. При высокой плотности маркеров это обычно делается с помощью велоциметрии изображения частиц (PIV), которая является хорошо зарекомендовавшим себя методом реконструкции гидродинамического потока. При низкой плотности маркеров и в 3D-TFM это обычно делается с помощью велоциметрии слежения за частицами (PTV), которая включает в себя специфические особенности набора экспериментальных данных. Примером более дешевой в вычислительном отношении альтернативы является оптический поток, такой как алгоритм Канаде-Лукаса-Томази (KLT)16. В случае гидрогелевых подложек флуоресцентные шарики обычно встраиваются с высокой плотностью во время полимеризации материала, а изображения регистрируются до и после высвобождения клеток при ферментативной отслойке. Ферментативная отслойка адгезивных клеток, например, путем трипсинизации, приводит к одновременному высвобождению клеточных тракций из всех клеток на гидрогелях, что затрудняет получение подробного анализа из большого числа клеток.
Здесь мы представляем протокол приготовления микроструктурированных гидрогелей для контроля формы и локализации клеток и метод эффективного измерения сил тяги в последовательности с использованием ультрафиолета для отделения отдельных клеток от субстрата. Для измерения силы тяги мы представляем методику получения двухслойных гидрогелей ПА, где флуоресцентные шарики встраиваются только в верхний слой, что увеличивает их плотность и уменьшает их вертикальное распространение. Сочетание УФ-опосредованного высвобождения клеточных сил тяги с микроструктурированием позволяет получить пространственный контроль над отслоением клеток (например, отдельных клеток, не влияя на адгезию других клеток в интересующей области), при условии наличия достаточного расстояния между узорчатыми клетками. Затем клеточная тяга реконструируется с использованием наиболее эффективного и надежного метода для 2D-TFM, а именно цитометрии тяги с преобразованием Фурье (FTTC) с регуляризацией17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>#440159</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>#33209</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %</td>
			<td>#1610140</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>#CP-CONT-BSG-A-G</td>
			<td>NanoAndMore</td>
			<td>5 &#956;m spherical tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system</td>
			<td>#NanoWizard3</td>
			<td>JPK</td>
			<td>Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>#A3678</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2 %</td>
			<td>#1610142</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#C11440-42U30</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#ANDORZYLA4.2</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox</td>
			<td>#C10422</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom incubator chamber</td>
			<td></td>
			<td>EMBLEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>#1300 100</td>
			<td>Picodent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>#41965</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Eclipse Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Axiovert200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>#9065.3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>#S181T</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>#F13191</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Alexa488 conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>#F1141</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8805</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (365/415)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8848</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (505/515)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8810</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (580/605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8807</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (660/680)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 15 mm round</td>
			<td>#41001115</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 24 mm round</td>
			<td>#41001124</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>#MRH08230</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>20x air NA 0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td>#CRL-2991</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>#MPEG-SVA-5000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxyethyl acrylamide</td>
			<td>#697931</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>#100-E</td>
			<td>TePla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>#PLPPgel</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>#P4823</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)</td>
			<td>#PLL(20-g[3.5]-PEG(2)</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium(meta) periodate</td>
			<td>#S1878</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>#17919</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Pattening module</td>
			<td>#PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVO cleaner</td>
			<td>#342-220</td>
			<td>Jelight</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy

Тракционная силовая микроскопия (TFM) является основным методом, используемым в механобиологии для измерения клеточных сил. Обычно это используется для клеток, придерживающихся плоских мягких подложек, которые деформируются под тягой клеток (2D-TFM). TFM полагается на использование линейных упругих материалов, таких как полидиметилсилоксан (PDMS) или полиакриламид (PA). Для 2D-TFM на PA трудность достижения высокой пропускной способности обусловлена главным образом большой изменчивостью форм и тяг ячеек, что требует стандартизации. Мы представляем протокол для быстрого и эффективного изготовления микроструктурированных гидрогелей ПА для исследований 2D-TFM. Микрошарики впервые создаются с помощью фотолитографии без маски с использованием почти ультрафиолетового света, где белки внеклеточного матрикса связываются только с микроструктурированными областями, в то время как остальная часть поверхности остается неадгезионной для клеток. Микроструктурирование белков внеклеточного матрикса происходит из-за присутствия активных альдегидных групп, в результате чего адгезивные области различной формы вмещают либо отдельные клетки, либо группы клеток. Для измерений TFM мы используем гидрогели ПА различной упругости путем изменения количества акриламида и бис-акриламида и отслеживания смещения встроенных флуоресцентных шариков для реконструкции полей тяги клеток с помощью регуляризированной цитометрии тяги преобразования Фурье (FTTC).
Для дальнейшего достижения точной регистрации клеточных сил мы описываем использование контролируемой дозы узорчатого света для высвобождения клеточных тяг в определенных областях для отдельных клеток или групп клеток. Мы называем этот метод локальной УФ-подсветкой тяговой силовой микроскопии (LUVI-TFM). При ферментативной обработке все клетки отделяются от образца одновременно, тогда как при LUVI-TFM силы тяги клеток в разных областях образца могут регистрироваться последовательно. Мы демонстрируем применимость этого протокола (i) для изучения сил тяги клеток как функции контролируемой адгезии к подложке и (ii) для достижения большего числа экспериментальных наблюдений из одного и того же образца.

Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy at JoVE.com

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Почти УФ-литография и микроскопия силы тяги объединяются для измерения клеточных сил на микроструктурированных гидрогелях. Целенаправленное светоиндуцированное высвобождение отдельных клеток позволяет проводить большое количество измерений на одном и том же образце.

Контроль клеточной адгезии с помощью методов гидрогелевого паттернинга для применения в тракционной силовой микроскопии

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Общей целью этой процедуры является изготовление микроструктурных гидрогелей для 2D-исследований тракционной силовой микроскопии. Это достигается путем предварительного изготовления метакрилированного стеклянного покрытия и формирования первого слоя полиакриламидного гидрогеля на нем. Вторым шагом является создание еще одного слоя гидрогеля, содержащего флуоресцентные шарики для тракционной силовой микроскопии.Гидрогель зажат с микроструктурным покрытием поверх него, что приводит к переносу микроструктурных матричных белков на поверхность гидрогеля. Далее полиакриламидный гидрогель оставляют полимеризоваться при комнатной температуре в течение 45 минут. Затем верхний скольжение крышки аккуратно удаляется.Флуоресцентная микроскопическая визуализация используется, чтобы показать наличие шариков и успешную передачу микроструктурированных белков внеклеточного матрикса. Этот метод помогает эффективно и точно измерить несколько тяговых сил с помощью света и использовать высвобождение клеток. Что позволяет получить большее количество экспериментальных наблюдений из одного и того же образца.Таким образом, продемонстрировать процедуру будет Джоэл Кристиан, аспирант из моей лаборатории. Добавьте в стакан 10 миллилитров двойной дистиллированной воды. После добавьте в раствор 18,75 миллилитра уксусной кислоты, 18,75 миллилитра 3-пропилметакрилата и 252,5 миллилитра этанола.Когда раствор будет готов, переложите его в кристаллизующуюся посуду. Возьмите 24-миллиметровые круглые крышки, очистите их прецизионной салфеткой и поместите в изготовленную на заказ тефлоновую стойку. Затем погрузить его в раствор и инкубировать в течение 15 минут.Возьмите стойку и промойте ее этанолом. Высушит крышка под воздушным потоком. Метакрилированные крышки могут храниться до одного месяца при комнатной температуре.Возьмите 15-миллиметровый круглый чехол и установите его на чашку Петри. Используйте алмазную ручку, чтобы отметить верхнюю сторону крышки. Затем приступают к очистке с помощью кислородно-плазменной обработки.Крышка проскальзывает при 0,4 миллибар и 200 Вт в течение двух минут. Пипетка 100 микролитров 0,01% раствора поли-L-лизина на поверхность крышки скользит и насиживается в течение 30 минут при комнатной температуре. После промыть крышку с 10-миллимоларом при рН 8,5.Выньте лишнюю жидкость, но держите поверхность влажной. Пипетка 100 микролитров по 50 миллиграмм на миллилитр mPEG-SVA в 10-миллимолярном растворе рН 8,5 наносится на поверхность крышки и инкубируется в течение одного часа при комнатной температуре. После промойте крышку с 10-миллимолярным рН 8,5.Затем добавьте на поверхность два микролитра геля PLPP, а затем 40 микролитров этанола. Осторожно наклоните чашку Петри, чтобы гомогенизировать раствор. Подождите пять минут, пока раствор поляризуется.Поместите крышку внутрь 35-миллиметрового отверстия чашки Петри. Поставьте чашку Петри, содержащую крышку, на ступень микроскопа. Отрегулируйте фокусировку на поверхности стекла.Загрузите и заблокируйте предварительно нарисованный узор. Начните структурирование с УФ-дозы 30 миллиджоулей на миллиметр в квадрате. После завершения этапа создания рисунка выньте скольжение крышки шаблона и промойте поверхность PBS.Инкубируют образец со 100-микролитровой смесью 25 мкг на миллилитр фибронектина и 25 мкг на миллилитр фибриногена, конъюгированного с Alexa 488, растворенным в PBS в течение одного часа при комнатной температуре. Чтобы приготовить субстрат для гидрогелей, начните с помещения метакрилированной крышки в чашку Петри. Для начала приготовьте свежий окисленный раствор AgA, добавив 9,55 миллилитров двойной дистиллированной воды в 15-миллилитровую трубку Falcon.Затем добавляют 0,5 миллилитра AgA. Затем добавьте в раствор 42 миллиграмма метапирувата натрия. Поставьте раствор на шейкер на четыре часа.Затем готовят бульонный раствор, смешивая акриламид, бис-акриламид и двойную дистиллированную воду согласно таблице 1. Запасной раствор можно хранить до года при четырех градусах Цельсия. Готовят рабочий раствор для нижнего слоя, смешивая 99,3 микролитра стокового раствора с 0,5 микролитрами персульфата аммония 1% и 0,2 микролитра TEMED.Возьмите 10 микролитров из раствора и пипетку по каплям на метакрилированную крышку. Осторожно поместите на каплю 15-миллиметровый круглый чехол и подождите 45 минут, пока она полимеризуется. Далее отсоедините верхнюю крышку скальпелем.Затем готовят рабочий раствор для верхнего слоя, смешивая 93,3 микролитра исходного раствора с одним микролитром окисленного HEA, пятью микролитрами флуоресцентных шариков, 0,5 микролитра персульфата аммония 1% и 0,2 микролитра TEMED. Возьмите пять микролитров из раствора и пипеткой по капле на нижний слой гидрогеля. Аккуратно поместите на каплю крышку с микроструктурой.Подождите 45 минут, пока он полимеризуется. Аккуратно отсоедините крышку скальпелем. И приклейте крышку на дно изготовленной на заказ шестилуночной пластины.Добавьте PBS в скважины. Чтобы увидеть клетки, аспирируйте PBS из шестилуночной пластины. Для фибробластов добавьте высокий уровень глюкозы DMEM, содержащий L-глютамин, и дополните его 10% FPS и 1% пенициллином и стрептомицином.Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% CO2. Включите CO2 и нагрев для этапа микроскопии. Затем включите микроскоп и поместите пластину лунки на сцену.Настройте рисунок освещения и отметьте интересующие ячейки. Перефокусировка на поверхности гидрогеля. Получите изображение клеток в канале brightfield.Чтобы сделать снимок бусин в деформированном состоянии, переключитесь на канал. Затем переключитесь на лазерный канал и осветите ячейку по рисунку в течение трех минут. Это соответствует дозе 6 000 миллиджоулей на миллиметр в квадрате.После переключите канал и получите изображение бусин в недеформированном состоянии. Чтобы рассчитать тяговые силы, откройте флуоресцентные изображения шариков, которые уже скорректированы для бокового дрейфа. Полный анализ тяговых сил подробно описан в прилагаемом скрипте.Чтобы проверить селективную адгезию клеток к микроструктурированным областям на поверхности гидрогелей, образцы были визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием предварительно меченых матричных белков и с помощью микроскопии яркого поля для визуализации клеток. Механические свойства полиакриламидных гидрогелей варьировались путем смешивания различных количеств акриламида и бис-акриламида. Жесткость гидрогеля оценивали с помощью экспериментов с наноиндентированием с помощью атомно-силовой микроскопии.Измерения силы тяги проводились после применения пространственного, контролируемого во времени, ультрафиолетового лазерного излучения для селективного освещения микронных областей полиакриламидного гидрогеля. Тяговые силы были реконструированы с использованием регуляризированного FTTC с параметром регуляризации, выбранным обобщенной перекрестной валидацией. Наш модульный подход, основанный на микроскопии силы притяжения в сочетании со светом и использованием микроструктурных клеток, является универсальным и может быть дополнительно использован с другой микроскопией и настройкой визуализации для улучшения ее разрешения и чувствительности.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Инжиниринг двухслойных гидрогель для управления ASC дифференциации

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Визуализация Cortex организация и динамика у микроорганизмов, с помощью микроскопии полного внутреннего отражения флуоресценции

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Одновременно Захват изображения в реальном времени в двух выбросов каналов Использование Разделение системы двойной камеры выбросов: Заявки на клеточной адгезии

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Новый метод для локализации Reporter флуоресцентные шарики Ближних культуре клеток для увеличения силы сцепления силовой микроскопии

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Использование Cell-субстрата сопротивление и живых изображений сотовый измерить в реальном времени изменения в клеточной адгезии и Де адгезии, индуцированной Matrix модификации

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Атомно-силовая микроскопия изображений и силовая спектроскопия поддерживаемых липидного бислоя

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Свет-опосредованной Формирование и структурирование гидрогелей для клеточных культур

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Кучность биоактивные белки или пептидов на гидрогеля с помощью фотохимии биологических приложений

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Узор геометрия человеческих эмбриональных колоний стволовых клеток на совместимых субстратов для управления тканью уровня механики

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Изготовление и внедрение платформы микроскопии безсправочной тяговой силы

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...