Name: control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy
Uploaded: 2022-01-29T14:00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy at JoVE.com

Protokol video prodüksiyonunda destek için Bayan Rebecca Alvarado'ya ve el yazması hakkındaki yapıcı eleştiriler için Bay Stephen Casale'ye teşekkür ederiz. Yardımcı tartışmalar için Max Planck Tıbbi Araştırma Enstitüsü Hücresel Biyofizik Bölümü'nden meslektaşlarımıza teşekkür ederiz. Max-Planck-Gesellschaft'tan E.A.A.-A.'ya .C. ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15'den E.A.A.'ya.C-A. ve P4'den ABD'ye; DFG EXC 2082/1-390761711'den ABD'ye) ayrıca büyük ölçüde kabul edilir. J.B. Carl Zeiss Vakfı'na finansal destek için teşekkür eder. E.A.C.-A., C.S. ve U.S.S., Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF) tarafından desteklenen Max Planck Okul Meselesi aracılığıyla fon sağlayarak. C.S. Avrupa Araştırma Konseyi tarafından desteklenmektedir (Consolidator Grant PHOTOMECH, no.101001797).

1. Methacrylated kapakların hazırlanması
NOT: Cam kapaklar, PA hidrojellerini kovalent olarak bağlamak ve bu nedenle hücrelerle inkübasyon sırasında kopmalarını önlemek için metakrilatlanır. Mikroskop cam kapaklar yüksek görüntü kalitesi elde etmek için kullanılır.
<ol><li>300 mL'lik bir çözelti hazırlamak için temiz bir 400 mL cam beher alın ve bir duman kaputunun içine yerleştirin.</li>
	<li>Kabın içine 10 mL çift damıtılmış su (ddH2O) ekleyin. Serolojik pipet kullanarak 18,75 mL asetik asit (%≥99,8 pro analiz, s.a.), 18,75 mL 3-(Trimethoxysilyl)propil methakrilit ve 252,5 mL etanol (%≥99,8 p.a.) ekleyin. Çözeltiyi kristalize bir kaba dökün.</li>
	<li>24 mm yuvarlak cam kapak kapaklarını hassas mendillerle temizleyin. Kapakları özel yapım bir politetrafluoretilen rafa yerleştirin.</li>
	<li>Rafı çözeltiye daldırın ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rafı alın ve tüm kapakları etanol ile durulayın (%99,8 p.a.). Kapakları hava akışı altında kurutun. NOT: Methacrylated kapaklar RT'de 1 aya kadar saklanabilir.</li>
</ol>2. Hücre dışı matris proteinlerinin cam kapaklar üzerinde mikropatterning
NOT: Cam kapak örtüleri ilk olarak protein ve hücre kovucudan oluşan bir molekül tabakası ile kaplanır. Bu katman daha sonra mikropatterned bölgelerde hücre dışı matris proteinlerinin daha sonra birikmesine izin vermek için bir fotopatterning tekniği kullanılarak çıkarılır.
<ol><li>15 mm yuvarlak cam kapak kılıfı alın ve bir Petri kabına yerleştirin. Kapak kılıfının üst tarafını işaretlemek için elmas bir kalem kullanın. Daha sonra 0,4 mbar ve 200 W'da oksijen plazması tedavisi ile 2 dakika boyunca temizliğe devam edin.</li>
	<li>Pipet 100 μL% 0.01 poli-L-lizin çözeltisi her kapak kapağının yüzeyinde. RT'de 30 dakika kuluçkaya yatır. Kapakları 10 mM 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethanesülonik asit (HEPES) pH 8.5 ile yıkayın. Fazla sıvıyı çıkarın, ancak yüzeyi ıslak tutun.</li>
	<li>Pipet 100 μL 50 mg/mL poli(etilen glikol) metil eter süksinimimidyl valerik asit (mPEG-SVA) içinde 10 mM HEPES pH 8.5 her kapak kapağının yüzeyinde. RT'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>Yüzeye 2 μL UV'ye duyarlı fotoinitiatör (örneğin PLPP-jel) ve ardından 40 μL etanol (%≥ 99,8 p.a.) ekleyin. Jel ve etanolün yüzeyde homojen bir dağılımını elde etmek için Petri kabını hafifçe ileri geri eğin. Çözeltinin polimerize olmasını 5 dakika bekleyin.</li>
	<li>Altta 20 mm delikli 35 mm Petri kabının içine tek bir kapak kılıfı yerleştirin. Bu, altından gelen lazer ışınlarının doğrudan cam yüzeye ulaşmasını sağlar.</li>
	<li>Mikroskobu ve bir ışık desenleme modülini açın (bu cihazla çalışmaya yalnızca lazer güvenlik görevlilerinden bir güvenlik girişinden sonra izin verilir). UV-A lazerini 20x hava hedefinde kalibre edin. Örneği fotoinitiatörle birlikte sahneye koyun. Odağı camın yüzeyine ayarlayın ve odak kontrolünü açın. Önceden çizilmiş deseni yükleyin ve kilitleyin.<ol>
<li>Inkscape gibi bir grafik yazılımı kullanarak deseni hazırlayın. Desen dosyasının DMD boyutlarını aşmadığından emin olun (1824 x 1140 px, bu da 20 x lenste (0,28 μm/px) 552 x 325 μm'ye karşılık gelir). NOT: Desenleme sırasında hata olmamasını sağlayacağından, desen dosyası boyutu olarak DMD boyutunun (1824 x 1140 piksel) kullanılması önerilir. Örneğin, 1830 x 1130 piksel boyutunda bir desen dosyası üretmeyin.</li>
		<li>Desenin poliakrilamide aktarılması amacıyla, desenlemenin camın merkezinden kenara kadar yarıçapın sadece% 60-70'ine kadar yapıldığından emin olun.</li>
		<li>Tek bir hücreyi desenleme için, desenler arasında 100 μm mesafe ve bir hücre grubu için 150-300 μm çapında 50-100 μm çapında bir çap kullanın. Uygun desen boyutu tipik hücre boyutuna bağlıdır ve hücrelerin yapışmasına izin vermek için yeterince büyük olması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desenleme 30 mJ / mm2 UV dozu ile başlayın. Desenleme süresi desen sayısına bağlıdır. Tek bir desen yapmak yaklaşık 1 s sürer.</li>
	<li>Desenleme adımını tamamladıktan sonra, yüzeyi fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez durulayın. Numuneyi 1x PBS'de çözünmüş 100 μL 25 μg/mL fibronektin ve 25 μg/mL fibrinojen Alexa488 ile PBS'de RT'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Diğer ECM proteinleri için, desenli bölgeleri tamamen kapsayan en uygun konsantrasyonları bulun.</li>
	<li>Yüzeyi 1x PBS ile üç kez durulayın. Desenli camın cam-PA aktarımı için hemen kullanıldığından emin olun. Hidrojel hazırlığı sırasında desenli camı RT'de PBS'de saklayın.</li>
</ol>3. Desenli poliakrilamid hidrojellerin imalatı
NOT: Poliakrilamid hidrojeller, yüzeydeki matris proteinlerinin katalizen bağlanması için reaktif aldehit grupları sunmak için oksitlenmiş N-hidroksitil akrilamid (HEA) dahil olmak üzere hazırlanır. Ek olarak, çekiş kuvveti mikroskopi deneyleri sırasında boncuk deplasmanının kaydını iyileştirmek için sadece hidrojel'in üst tabakasına floresan boncukları gömmek için çift katmanlı bir yaklaşım kullanılır.
<ol><li>Methacrylated cam kapakları bir Petri kabına koyun.</li>
	<li>Taze oksitlenmiş HEA çözeltisi hazırlamak için, 15 mL santrifüj tüpüne 9,55 mL çift damıtılmış su ekleyin. Ardından, çözeltinin 10 mL'sini almak için 0,5 mL HEA ve 42 mg sodyum (meta) periyodik ekleyin. Çözeltiyi karanlıkta 4 saat boyunca sürekli karıştırın.</li>
	<li>10 mL stok çözeltisi hidrojel elde etmek için Tablo 1'e göre akrilamid, bis-akrilamid ve çift damıtılmış suyu karıştırın (duman kaputunun altında yapın, monomerler nörotoksiktir). Degas ve hava geçirmez bir contaya kapağı kapatın. NOT: Stok çözeltisi 4 °C'de 1 yıla kadar aliquotlarda tutulabilir. Kullanmadan önce her zaman Young'ın hidrojel modüllerini karakterize edin.</li>
	<li>Çift katmanlı bir PA hidrojel hazırlayın (duman kaputunun altında yapın, monomerler nörotoksiktir).<ol>
<li>1,5 mL'lik bir tüpte 99,3 μL stok çözeltisini, %1 amonyum persülfatın (APS) 0,5 μL'sini ve 0,2 μL tetrametrinediamin (TEMED) karıştırarak alt katmanla başlayın. Çözeltiden 10 μL alın ve methacrylated kapak kapağının ortasına damla yönünde pipetleyin.</li>
		<li>Damlacık üzerine dikkatlice 15 mm yuvarlak bir kapak kılıfı yerleştirin ve polimerizasyon için 45 dakika bekleyin. Üst örtü kapağını neşterle yavaşça ayırın.</li>
		<li>Üst katman için, 93,3 μLof stok çözeltisini 1 μL taze oksitlenmiş HEA çözeltisi ile hafifçe karıştırın, 5 μL floresan boncuk (200 nm büyüklüğünde boncuklar için kare mikron başına üç boncuklara karşılık gelir), 1.5 mL'lik bir tüpte 0.5 μL% 1 APS ve 0.2 μL TEMED. Çözeltiden 5 μL alın ve zaten polimerize alt tabakanın ortasına damla yönünde pipetleyin.</li>
		<li>Mikropatterned kapak kapağını damlacık üzerine hafifçe yerleştirin. Damlacık polimerize için RT'de 45 dakika bekleyin. Desenli tarafın damlacıklara dokunduğundan emin olun. Örtü kapağını neşterle hafifçe ayırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 mm kapakları iki bileşenli silikon yapıştırıcı kullanarak özel delinmiş 6 kuyulu plakaların altına yapıştırın. 5 dakika sonra kuyulara PBS ekleyin.</li>
	<li>Young'ın poliakrilamid hidrojel örneklerinin modülasyonunun atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile karakterize edilir.<ol>
<li>AFM tutucusuna küresel bir uçlu bir diyafram takın.</li>
		<li>Sert bir substratta (örneğin, cam veya mika) kuvvet mesafesi eğrisi (3-4 V setpoint) elde ederek her bir kantileveri kalibre edin, kantilever hassasiyetini tahmin edin, yüzeyden geri çekin ve yay sabitini elde etmek için bir termal ayar yapın.</li>
		<li>Kalibre edilmiş elverdekleri hidrojel numunesinin üzerine yerleştirin ve aşağıdaki parametreleri kullanarak PBS tamponuna kuvvet eğrileri elde edin: 20-30 nN kuvvet setpoint, 5 veya 10 μm/ s yaklaşım ve geri çekme hızı, 5 μm rampa boyutu. NOT: PA hidrojel numuneleri içindeki ECM mikropatterned alanları görselleştirmek ve hedeflemek için hava 40x hedefi ve yeşil floresan protein (GFP) filtresi ile donatılmış ters optik mikroskop kullanılmıştır.</li>
		<li>AFM analiz yazılımı ile elde edilen kuvveti mesafe eğrilerine karşı çizin.</li>
		<li>Temas noktasını bulun ve kuvvete karşı mesafe eğrilerini girinti eğrilerine karşı kuvvete dönüştürün.</li>
		<li>Eğrinin girinti kısmını 0,2 ile 0,5 arasında bir Poisson oranı kullanarak Hertz modeline (veya uç geometrisinin işlevine uygun bir mekanik modele) takın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Hücre çekiş kuvvetlerinin UV-A lazer aydınlatma (LUVI-TFM) ile lokal salınımı
NOT: UV-A lazer, hidrojellerin tanımlanmış bölgelerinde lokalize hücrelerde çekiş kuvvetlerini serbest bırakmak için uygulanır. UV-A lazer (yani, φ = 375 nm katı hal lazer, <15 mW) sınıf bir 3B lazerdir. Korumasız lazer ışını gözler ve genellikle cilt için tehlikelidir. Yansıyan ve dağılmış ışık ve radyasyon tehlikeli olabilir. Ayrıca, UV radyasyon cilt kanserine neden olabilir. Cihazlarla çalışmaya ancak lazer güvenlik görevlilerinin güvenlik girişinden sonra izin verilir.
<ol><li>PBS'i kuyulardan apire edin.</li>
	<li>Büyüme ortamında 6 kuyu plakası başına tohum 3 x 106 hücre. Fibroblastlar için, L-glutamin içeren ve% 10 Foetal Sığır Serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş yüksek glikoz Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM) kullanın. Hücreleri gece boyunca %37 °C/5 CO2'de kuluçkaya yatırın. Mikroskopiye başlamadan önce yüzen hücreleri çıkarmak için örnekleri yıkayın.</li>
	<li>37 °C ve %5 CO2 atmosfer sıcaklığı elde etmek için mikroskop inkübasyon odasını ve gaz kaynağını açın.</li>
	<li>Mikroskobu ve lazer desen modülini açın. Gerekirse, Leonardo yazılımını kullanarak UV-A lazerini 20x hava hedefinde yeniden kalibre edin. Özel yapım 6 kuyu plakasını numunelerle birlikte sahneye yerleştirin. Pa'nın yüzeyine odaklanın.</li>
	<li>Aydınlatma desenini kur ve ilgi çekici hücreleri işaretle. Hidrojel yüzeyine yeniden odaklanın. Brightfield kanalındaki hücrelerin görüntüsünü alın. Cy5 kanalına geçin (uzak kırmızı filtre, 650 nm ekscitasyon, 670 nm emisyon) ve deforme olmuş durumdaki boncukların görüntüsünü alın.</li>
	<li>Lazer kanalına kay. Lazeri 3 dakika açın. Özel kurulumumuzda, bu 6.000 mJ / mm2'lik bir ışık dozu ile karşılık geldi.</li>
	<li>Cy5 kanalına geçin ve boncukların biçimlendirilmemiş durumda bir görüntüsünü alın. NOT: Fare embriyonik fibroblastlarını kullanarak deneme yapmak için, referans/biçimsiz görüntüyü kaydetmek için 15 dakika pozlama sonrası bekleyin ( Temsili Sonuçlar bölümüne bakın). Diğer hücre türlerinde farklı olabilir. İlgi çekici başka bir hücre için 4,5-4,7 adımlarını yeniden yineleyin.</li>
	<li>UV-A aydınlatmadan sonra yüksek oksidatif stresi ölçmek için piyasada bulunan reaktifi (CellRox) kullanın. CellRox azaltılmış durumda floresan değildir ve reaktif oksijen türleri tarafından oksitlendiğinde, maksimum ~665 nm emisyona sahip floresanlardır.</li>
	<li>Sağlanan protokole göre, görüntüleme ortamına 5 μM reaktif ekleyin ve 37 °C/5% CO2'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın. Ardından, hücreleri ılık 1x PBS ile 3x yıkayın ve görüntüleme medyasını değiştirin. Cy5 sinyalini, benzer bir ışık maruziyeti kullanarak UV-A aydınlatması öncesi ve sonrası floresan görüntüleme ile kaydedin.</li>
</ol>5. Görüntü işleme, parçacık görüntü velosimetrisi ve çekiş kuvvetlerinin hesaplanması
NOT: Hücre çekiş kuvvetleri floresan boncukların yer değiştirmesi analiz edilerek kaydedilir ve parçacık görüntü velosimetrisine dayalı görüntü analiz araçları kullanılarak hesaplanır.
<ol><li>Fiji'yi kullanarak lazerden önce (yani deforme olmuş) ve lazerden sonra floresan boncuk görüntülerini açın. İki görüntüyü tek yığın olarak birleştirme (Resim | Yığınlar | Yığına Resimler).</li>
	<li>StackReg eklentisini kullanarak iki görüntü arasındaki yanal sürüklenmeyi düzeltin (P. Thévenaz, İsviçre Federal Teknoloji Enstitüsü Lozan). Görüntüleri 8 bit'e değiştirme (Resim | | yazın 8 bit) ve 1024 x 1024 pix'e yeniden ölçeklendirin (Resim | Ölçek). Her zaman başında referans görüntüsü olan bir Görüntü Sırası (TIFF biçimi) olarak kaydedin.</li>
	<li>OpenPIV projesinde uygulandığı gibi PIV alanından bir çapraz korelasyon tekniği19 kullanarak öteleme vektör alanını alın.<ol>
<li>Rahat (biçimsiz) görüntünün ve deforme olmuş görüntünün piksel cinsinden wR ve wD boyutunda arama pencereleriyle kaplatılmış olduğundan emin olun. Her arama penceresi için, aşağıdaki formülü kullanarak bir çapraz korelasyon işlevi tanımlayın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq01.jpg"> Burada, R(i,j) ve D(i,j), seçili arama penceresine kesilen ve daha sonra ayna dolgulu iki görüntünün yoğunluk alanlarını açıklar. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq02.jpg"> ve <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq03.jpg"> ortalama değerlerini açıklar. Pencere boyutları wR = 32 ve wD = 32 olarak seçilir ve komşu arama pencereleri arasında %70'lik bir çakışma kullanılır.</li>
		<li>Her arama penceresi için, çapraz korelasyon işlevini en iyi duruma getiren ve arama penceresinin orta konumuna atayan bir yer değiştirme vektörü <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq04.jpg"> belirleyin. Subpixel doğruluk, açıklandığı gibi maxima bölgesinin etrafına bir Gauss uyumu kullanılarak elde edilir20.</li>
		<li>Belirsiz yer değiştirme vektörlerini bulun ve kaldırın. Çapraz korelasyon işlevinin 1,5 eşiğinin altındaki en yüksek iki yerel maksima arasındaki oranın belirsiz olarak kabul edildiği arama pencerelerine karşılık gelen yer değiştirme vektörleri21.</li>
		<li>1.522 artık eşiği için normalleştirilmiş ortanca testini başarısız olan yer değiştirme vektörlerini atın.</li>
		<li>(İsteğe bağlı) Tüm yer değiştirmelerden sabit bir vektör <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq05.jpg"> çıkararak kalan yanal sürüklenmeyi düzeltin. Bu, hücreden uzak seçili bir alandaki yer değiştirme kaybolduğu için yapılır.</li>
		<li>Elde ettiği deplasman vektör alanını, kübik bir polinom enterpolasyonu kullanarak giriş görüntülerinin 4 px aralığıyla normal bir ızgaraya enterpolasyon yapın. Eksik veri noktaları düzgün bir çift değişkenli spline ekstrapolasyon kullanılarak doldurulur. Piksel cinsinden bir yer değiştirme vektörü, görüntünün piksel oranına göre yerel bir deformasyonla ilgilidir (20x hava lensi için 0,33 μm/px).</li>
		<li>(İsteğe bağlı) Sonraki analizde zil takıntı yapıtlarını azaltmak için görüntüyü aynala ped.</li>
		<li>Sürüklenme düzeltmesi nedeniyle kenar etkisini ortadan kaldırmak için deformasyon alanını Tukey pencere işleviyle 0,2-0,3 parametresiyle çarpın. Bu deneyde, FOV'un merkezinde yer alan mikropatterned alan ilgi çekicidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Düzenli Fourier Transform Traction Sitometrisi (FTTC)18 kullanarak çekişi yeniden yapılandırın. Düzenlileştirme olarak en basit makul seçimi, yani 0. 26 tarafından tanımlanan Genelleştirilmiş Çapraz Doğrulama (GCV) işlevini en aza indirebilecek şekilde en uygun normalleştirme parametresi φ seçilir: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63121/63121eq06.jpg"> Burada, tüm Fourier örnekleme modları için verilen φ değeri için yeniden yapılandırılmış çekiş alanının x ve y bileşenlerini içeren yığılmış bir vektör bulunur ve G, FTTC için tanımlandığı gibi çekiş alanlarını karşılık gelen deplasman alanlarına eşleyen doğrusal operatördür. Toplam vektör bileşenleri üzerinde çalışıyor. ui, tüm Fourier örnekleme modları için yer değiştirme alanının x ve y bileşenleridir. GCV, kötü pozlanmış ters problemler alanında yaygın olarak kullanılır ve TFM'de sıklıkla kullanılan L eğrisi kriterine iyi bir alternatiftir. Lanzcos filtresi, sınırlı frekans alanı ve yer değiştirme alanı yukarı örneklemesi nedeniyle yapıtları azaltmak için kullanılır. Çekiş hesaplaması, Young'ın PA modülüne (örneğin, 11,3 kPa) ve Poisson'un oranına (örneğin, çapraz bağ konsantrasyonuna bağlı olarak 0,2 ile 0,5 aralığındaki PA için) bağlıdır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+neighborhood:+adhesion-coupled+cell+mechanosensors.">Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors.</a> Cell. 110 (2), 139-142 (2002).</li><li>Beningo, K. A., Hamao, K., Dembo, M., Wang, Y. -. l., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+of+fibroblasts+are+regulated+by+the+Rho-dependent+kinase+but+not+by+the+myosin+light+chain+kinase.">Traction forces of fibroblasts are regulated by the Rho-dependent kinase but not by the myosin light chain kinase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 456 (2), 7 (2006).</li><li>Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+traction+force+in+relation+to+cell+shape+and+focal+adhesions.">The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions.</a> Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).</li><li>Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+spread+area+and+traction+forces+determine+myosin-II-based+cortex+thickness+regulation.">Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation.</a> Biochimica Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123, 4201-4213 (2010).</li><li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+printing+by+light-induced+molecular+adsorption.">Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption.</a> Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).</li><li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microtubules: in vivo Methods in Cell Biology. , 133-146 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogel+micropatterning.">Polyacrylamide hydrogel micropatterning.</a> Methods Cell Biology. 120, 93-116 (2014).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Polacheck, W. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell-generated+forces:+a+guide+to+the+available+tools.">Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools.</a> Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1853, 3095-3104 (2015).</li><li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+forces+in+cell+biology.">Quantifying forces in cell biology.</a> Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).</li><li>Hanke, J., Probst, D., Zemel, A., Schwarz, U. S., Koster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+force+generation+by+spreading+platelets.">Dynamics of force generation by spreading platelets.</a> Soft Matter. 14 (31), 6571-6581 (2018).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+particle+image+velocimetry.">Digital particle image velocimetry.</a> Experiments in Fluids. 10, 181-193 (1991).</li><li>Lourenco, L., Krothapalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+accuracy+of+velocity+and+corticity+measurements+with+PIV.">On the accuracy of velocity and corticity measurements with PIV.</a> Experiments in Fluids. 18, 421-428 (1995).</li><li>Adrian, R. J., Westerweel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Particle Image Velocimetry. , (2011).</li><li>Westerweel, J., Scarano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+outlier+detection+for+PIV+data.">Universal outlier detection for PIV data.</a> Experiments in Fluids. 39 (6), 1096-1100 (2005).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+forces+at+focal+adhesions+from+elastic+substrate+data:+the+effect+of+localized+force+and+the+need+for+regularization.">Calculation of forces at focal adhesions from elastic substrate data: the effect of localized force and the need for regularization.</a> Biophysical Journal. 83 (3), 1380-1394 (2002).</li><li>Huang, Y., Gompper, G., Sabass, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bayesian+traction+force+microscopy+method+with+automated+denoising+in+a+user-friendly+software+package.">A Bayesian traction force microscopy method with automated denoising in a user-friendly software package.</a> Computer Physics Communications. 256, 107313 (2020).</li><li>Vedadghavami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+hydrogel+biomaterials+with+controlled+mechanical+properties+for+tissue+engineering+applications.">Manufacturing of hydrogel biomaterials with controlled mechanical properties for tissue engineering applications.</a> Acta Biomaterialia. 62, 42-63 (2017).</li><li>Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+soft+hydrogel+microindentation:+Impact+of+various+indentation+parameters+on+the+measurement+of+Young's+modulus.">Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus.</a> PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).</li><li>Oria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+loading+explains+spatial+sensing+of+ligands+by+cells.">Force loading explains spatial sensing of ligands by cells.</a> Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).</li><li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+cells+feel:+methods+for+thin+gels.">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).</li><li>Sen, S., Engler, A. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+strains+induced+by+cells:+Computing+how+far+cells+can+feel.">Matrix strains induced by cells: Computing how far cells can feel.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 2 (1), 39-48 (2009).</li><li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing.">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Letters. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li><li>Galluzzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+methodology+and+AFMech+Suite+software+for+nanomechanics+on+heterogeneous+soft+materials.">Atomic force microscopy methodology and AFMech Suite software for nanomechanics on heterogeneous soft materials.</a> Nat Communications. 9 (1), 3584 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokolde, TFM çalışmaları için fidüsyal belirteçler olarak kullanılan floresan boncuk içeren mikropatterned PA hidrojellerinin hazırlanmasını açıklıyoruz. Yaklaşımımız üç adıma dayanmaktadır: 1) çift katmanlı PA hidrojellerin hazırlanması; 2) ECM proteinlerinin mikropatterning ve hidrojel yüzeye aktarılması; 3) TFM için desenli UV'ye yakın ışık kullanımı. Alt tabakadaki hücre çekişlerini analiz etmek için deneysel kurulum, floresan boncukların yer değiştirmesiyle ilgili kuvvetleri hesaplamak için bilinen sertlik değerlerine sahip doğrusal elastik malzemelerin kullanılmasını gerektirir26. PA hidrojellerin hazırlanması kolaydır, sertlik kolayca ayarlanabilir ve genellikle sertlik algılama ve TFM18,28 için kullanılırlar. Bununla birlikte, tekrarlanabilir polimerizasyon süreleri ve tüm hidrojelin homojen polimerizasyonunu elde etmek için, reaktiflerin depolama koşullarına ve zamanına dikkat edilmelidir, örneğin, APS aktivitesini kaybetmemek için bir kurutucuda tutulmalıdır; TEMED doğrudan ışıktan korunmalıdır. Oksitlenmiş HEA kullanımı, tam ve istikrarlı bir protein tabakasının oluşumunu sağlamak için avantajlı olabilecek hidrojel yüzeydeki matris proteinlerinin katalent bağlanmasına izin verir. Oksitlenmiş HEA çözeltisi, PA hidrojelleri her imal ettiğinde taze olarak hazırlanmalıdır. Çift katmanlı PA hidrojel üç ana avantaj sunar: 1) jeli son derece ince hale getirmeye gerek kalmadan hidrojel yüzeye yakın fidücial boncukların homojen bir dağılımını yeniden elde etmek için alternatif bir yol sağlar (yani, <20 μm). Hidrojel kalınlığı üzerindeki kontrol, TFM ile doğru ölçümler elde etmek için çok önemlidir. Elastik substrat çok ince olduğunda, fibroblastlar gibi güçlü yapışık hücreler alttaki sert cam substratı hissedebilir ve mekanik olarak yanıt verebilir29,30. Kalın hidrojeller, kuvvetin yeniden inşası için görüntü alımını daha zor hale getirir. Ayrıca, ultra ince mikroskopi slaytları kullanılmadığı sürece, hidrojel takmak için kullanılan cam substratın ek kalınlığı göz önüne alındığında, birçok mikroskop bunları barındırmak için yeterli alana sahip olmayacaktır. 2) Çift katmanlı PA hidrojelde, PA hidrojel yüzeyine yakın fidüsyal boncukların homojen dağılımı, bir santrifüj kullanmadan, aksine hassas miktarlarda hidrojel çözeltilerinin ve floresan boncukların basit bir inkübasyonu ile elde edilir. PiV analizi yapılırken yüksek boncuk yoğunluğu önemli bir avantajdır, çünkü konfokal mikroskopiye gerek kalmadan çekiş kuvvetlerinin çözünürlüğünü ve sinyal-gürültü oranını arttırır. 3) Boncukların hücre malzemesi arayüzüne yakın ince bir tabakaya hapsedilmesi, epifluoresans mikroskoplarının yanı sıra konfokal mikroskoplarla çekiş kuvvetlerinin görüntülenmesini sağlar. Hidrojel hazırlarken, kullanıcı protokolün sonraki adımlarına geçmeden önce alt cama sıkıca yapışdığından emin olmalıdır. Hidrojel yüzeyine zarar vermeden yüzeyin üstündeki camı çıkarmak zor olabileceğinden, hidrojel tabakalarının polimerizasyonu için belirtilen kuluçka süresini takip etmenizi öneririz.
Elastik özellikleri ölçmek için en iyi bilinen teknikler AFM, nanoindentasyon, çekme testleri ve romatizmadır. Bununla birlikte, nanoindentasyon, elastik özelliklerin belirlenmesini etkileyebilecek malzemeler üzerinde çok yüksek suşlara neden olan suşlara neden eder. Öte yandan çekme testleri ve romatizma makroskopik ölçüm teknikleridir, hücreler ise mikroskobik ölçekte etkileşime girer31,32. AFM, fizyolojik koşullar altında daha az suşla mikro ölçekli ölçümlere izin verir. Deneysel ayrıntılar eksikse (örneğin, girinti kuvveti ve hızı) veya yetersiz veri kaydedilirse AFM ölçümlerinin güvenilirliği olumsuz etkilenebilir27. Huth ve arkadaşları, Ölçüm ayrıntılarını sabit tutmayı vurgulayan Young'ın modülünü AFM verilerinden çıkarmak için bir algoritma tanımlar27. Bu algoritma Young'ın modülünün kesin ve güvenilir bir şekilde belirlenmesini sunar ve deneylerimiz için kullanılmıştır. Ek olarak, farklı günlerde üretilen numunelerde birçok eğri ölçtük ve çok benzer sonuçlar elde ettik (ortalama değerlerin değişimi 1-2 kPa). Bu, jellerimizin sertliğinin güvenilir bir şekilde tahmin edilebileceğini göstermektedir.
Bu protokolde, cam üzerinde mikropatterned bölgeler oluşturmak için bir fotopatterning modülü kullanıyoruz, daha sonra hidrojel yüzeylere aktarılıyor. Bu protokolde gösterilen mikropatterning, DMD (dijital mikro ayna cihazı) tabanlı maskesiz UV'ye yakın litografiye (φ = 375 nm)7 dayanmaktadır. Bir DMD, bir çip üzerinde çok sayıda mikromirrörden oluşur. Tek bir piksel tek bir mikro aynaya karşılık gelir. Bir bilgisayardan pikselli desen görüntü dosyası DMD aracılığıyla yansıtılır ve objektif bir lens kullanılarak yüzeye odaklanır. Proteinlerin mikropatterning için, odaklanmış lazer ışığı bir fotoinitiatör yardımıyla itici polimer fırçaları cleave için kullanılır. Daha sonra, maruz kalan bölgeler ECM proteinleri ile doldurulur. Bu maskesiz ablasyon yöntemi, foto maskesi kullanımına dayanmediği için yeni desenler tasarlamada büyük esneklik sunar. Bir desen tasarlamak ve uygulamak çok kolaydır, çünkü Inkscape gibi ücretsiz bir yazılım kullanmak sadece birkaç dakika sürer. Ancak, kısa sürede üretilen desen ve numune sayısı büyük bir dezavantajdır, çünkü bu yöntem her seferinde yalnızca tek bir substratı desenlamak için kullanılabilir. Fotopatterning modülü, birkaç miliwatt yayan yakın bir UV katı hal lazer kaynağı kullanır. Korumasız lazer ışını gözler ve cilt için tehlikelidir. Yansıyan ve dağılmış ışık ve radyasyon da tehlikeli olabilir. Elleçleme, lazer subaylarından gelen bir güvenlik talimatı ile birlikte verilmelidir. Bir fotopatterning modülü kullanırken protokoldeki en kritik adım, mikropatterning ve ablasyon sırasında lazerin yüzeye düzgün bir şekilde odaklandığından emin olmaktır. Desenleme sırasında UV ışığının tutarlı bir aydınlatma dozu (zamanla çarpılır) lazerin yüzeye nasıl odaklandığına bağlıdır. Zayıf odak nedeniyle yüzeydeki zayıf bir yoğunluk, ECM'nin hidrojel yüzeyine transferinin başarısız olmasına neden olabilir ve bu da hiçbir hücrenin hidrojele bağlanmamasına neden olabilir.
TFM deneylerinde, yapışık hücrelerin ve fidüsiyal belirteçlerin ilk görüntülemesinden sonra, hücreler rahat durumlarını kaydetmek için trypsin tedavisi ile PA hidrojelinden salınır. Bu adımı gerçekleştirmenin bir dezavantajı, örneği mikroskopi aşamasında işlemektir. Perfüzyon odası olmadan, kabın kapağını açmak, ortamı aspire etmek, durulama ve pipetleme tripsin çözeltisi yeni başlayanlar ve deneyimli kullanıcılar için bir meydan okumadır. Aslında, bu prosedürler ksyz eksenlerindeki sürüklenmenin önemli bir kaynağıdır ve pozisyon ve odaklanma kaybına neden olandır. Yerel UV aydınlatma protokolümüz, TFM'i yeni başlayanlar için daha erişilebilir bir teknik haline getirir. Ticari olarak mevcut bir mikroskopi tabanlı maskesiz fotopatterning modülü kullandığımız belirtilmelidir, ancak prensip olarak herhangi bir UV-A aydınlatma sistemi, sonunda hücre çekiş kuvvetlerinin kaydedilmediği substratların bölgelerini korumak için bir maske ile birlikte kullanılabilir. Hücrelerin önemli dozda düşük dalga boyu görünür ışığa (örneğin, DAPI emisyonunu heyecanlandıran mor ışık) maruz bırakılması, fototoksikite ve hücre ölümü ile sonuçlanabilecek oksidatif stresin artmasına neden olacaktır. Bu nedenle, bu teknik UV lazer modülü olmayan bir epifluoresans mikroskopunda bile uygulanabilir. Ancak yoğunluk çok daha zayıf olduğu için bu durumda enzymatik tedavi ile TFM'yi başarmak çok daha kolay olacaktır.
LUVI-TFM ile tek hücrelerin veya küçük hücre gruplarının lokal olarak birleşmesi nedeniyle aynı örneği çeşitli ölçümler için kullanmak mümkündür. Bununla birlikte, komşu hücrelerden güç kaydedilmemesi için ayırmak için hücre seçimine dikkat edilmelidir. Bu nedenle, mikropatternlerin yokluğunda tek hücreli ölçümler için kalabalık bölgelerden kaçınılmalıdır; tek mikropatterned hücreler üzerinde ölçümler için, desenler tek yapılar arasındaki mesafe desenli alanın çapının en az iki katı olacak şekilde tasarlanmalıdır. Ayrıca, bitişik desenlerdeki hücreleri sırayla kullanmamanızı, aksine alt tabakadaki uzak bölgelerden örneklemenizi öneririz. Ölçümümüz, odak kontrol özelliği ve lensin çalışma mesafesinin yeterince uzun olduğu ve bir kuyudan diğerine hızlı hareketin yüksek oranda ayarlanabilir olduğu 40 x hava NA = 0,9 lens ile donatılmış bir epifluoresans mikroskobu üzerinde iyi bir şekilde gerçekleştirilir. TFM uygulamaları için hücrelerin hedeflenen ayırması, tek bir hücrenin veya tüm küçük hücre kümesinin (örneğin, çapı 300 μm'ye kadar) hücresel kuvvetini ölçmek için etkilidir. Kurulumumuzu kullanarak, tek hücrelerin UV tedavisi için hücre yuvarlama ve dekupeksleme gözlemledik (Şekil 3A), küçük hücre kümeleri için ise nadiren kopma meydana geldi. Bu, hücre çekiş kuvvetlerinin hafife almasına neden olabilir. Daha büyük hücre kümeleri için, kullanıcıların tüm kümeyi görüntülemesi için 20x hava hedefi kullanması gerektiğinden ve bir odak denetimi özelliği gerektiğinden, enzimatik ayırma önerilir. 20x hava lensinin odak derinliği çok daha uzun olduğundan, yol tutuşu daha yüksek büyütme hedefi kadar kritik olmayacaktır. Aydınlatma dozu yüzeydeki lazer odağına bağlı olduğundan, kullanıcı odakların hücrelerin ablasyonu için doğru ayar olduğundan emin olmalıdır. Komşu işlenmemiş hücrelerle olası mekanik etkileşimler nedeniyle hücre kolektiflerinde LUVI-TFM'nin kullanılmasındaki olası sınırlamaların farkında olsak da, bu yönün hedeflenen hücre ekstrüzyonunun mekaniği üzerine yapılan çalışmalar için yararlı olabileceği ortaya çıkabilir, örneğin epitel monolayerlerden.
Sonuç olarak, TFM yaklaşımımız mikropatterned hücrelerin ışık kaynaklı salınımı ile birleştiğinde, hücre yapıştırma kuvvetlerini ölçmek için sağlam ve yüksek verimli bir protokol sağlıyoruz. Bu yöntemin çok yönlülüğü, çözünürlüğü ve duyarlılığı artırmayı amaçlayan mikroskopi ve görüntüleme kurulumu kullanılarak daha fazla kullanılabilir.

Hücre dışı ortamlarıyla etkileşime giren yapışkan hücreler, esas olarak hücre dışı matrisi (ECM) aktin sitoskeleton'a bağlayan integrin bazlı odak yapışmalarının aracılık ettiği kuvvetler uygular. Odak yapışıklıkları, integrinlerin fibronektin ve kollajen gibi ECM proteinlerine bağlanması etrafında ortalanan multiprotein montajlarıdır. Integrin kümelenmesi ve odak yapışıklıklarının büyümesi sadece mekanik olarak istikrarlı bir bağlantının kurulması için değil, aynı zamanda hücresel kontrtinaklığın düzenlenmesi için RhoA yolunu etkinleştirenler de dahil olmak üzere diğer odak yapışıklık proteinlerinin işe alınması için de çok önemlidir1. Aktin sitoskeletonunun RhoA'ya bağımlı kontrtinizitesi, hücrelerin alttaki ECM'ye yayılmasına ve göç etmesine ve ayrıca sertliğini hissetmesine izin verir2. Çekiş kuvvetlerinin dağılımı, her ikisi de matris özelliklerine dayanan ve bu nedenle sitoskeletal organizasyonu etkileyen hücrelerin yayılma alanına ve şekline bağlıdır ve sonunda matris mekaniği ile sitoskeletal organizasyon arasında kapalı bir geri bildirim döngüsü oluşturur3,4.
Yüzey mikropatterning teknikleri, ECM yapışkan proteinleri sunan mikron boyutlu bölgeler oluşturarak hücre şeklinin tanımlanmış bir şekilde kontrol altına alınabilmesini sağlar; bu bölgelerin büyüklüğüne, tek hücrelere veya mikropattern5'e yapışan hücre gruplarına göre. ECM proteinleri mikrokontact baskı, foto-desenleme veya lazer desenleme6 gibi farklı yaklaşımlarla cam yüzeyler üzerinde desenlenebilir. UV ışığının (φ = 185 veya 375 nm) yüzey güçlendirme stratejileri ile birlikte kullanılması, farklı şekil ve boyutlarda tasarım ve yüzey kenarlarına yakın yüksek hassasiyete sahip birden fazla protein türünün hareketsiz hale getirilmesi için esneklik sunar7,8. Polietilen glikol (PEG) gibi protein itici kimyasallarla kaplı bölgeler, krom fotomask veya dijital ayna cihazı (DMD) tabanlı maskesiz litografi sistemi ile korunmaktadır. Maskelerdeki desenler, daha sonra ECM proteinleri ile desenlenecek bölgelerin UV ışığına maruz kalmasını sağlar. Hidrojel yüzeylerin ECM proteinleri ile desenlenilmesi, proteinleri cam yüzeyden çıkarmak ve desenlere çapraz bağlantı sağlamak için bir transfer adımı gerektirir. Alternatif olarak, yumuşak malzemeler üzerinde desenleme, önce fotokütle itici bir proteinle kaplanarak, ardından derin UV aydınlatması kullanılarak maskesiz bölgelerin yakılmasıyla elde edilebilir. Derin UV ozon ürettiğinden ve yüzeyi protein bağlama için reaktif hale getirdiğinden, maskesiz bölgeler ECM proteinleri ile kaplanır ve son olarak jel doğrudan maskesiz bölgelerin üzerine polimerize edilir9,10.
Desenli hidrojeller, hücre malzemesi arabilme noktasındaki hücre kuvvetlerini ölçen bir teknik olan TFM'yi gerçekleştirmek için kullanılabilir11. 2D-TFM'de, biri deformasyonları izlemek için işaret boncuklarının gömülmüş olduğu kalın bir polimer filmin düz yüzeyini kullanır12,13,14,15. Yer değiştirme vektörlerini ayıklamak için, biri deforme olmuş durumdan ve biri referans görüntü olmak üzere iki görüntüyü deformasyon olmadan birleştirmek önemlidir. İki görüntü daha sonra görüntü işleme ile birbirlerinin üzerine eşlenir. Yüksek işaret yoğunluğunda, bu genellikle hidrodinamik akışı yeniden oluşturmak için iyi kurulmuş bir yöntem olan Parçacık Görüntü Velosimetrisi (PIV) ile yapılır. Düşük işaret yoğunluğunda ve 3D-TFM'de, bu genellikle deneysel veri kümesinin belirli özelliklerini içeren Parçacık İzleme Velosimetrisi (PTV) ile yapılır. Hesaplama açısından daha ucuz bir alternatife örnek olarak Kanade-Lucas-Tomasi (KLT) algoritması16 gibi optik akış verilebilir. Hidrojel substratlar söz konusu olduğunda, floresan boncuklar genellikle malzeme polimerizasyonu sırasında yüksek yoğunlukta gömülür ve enzimatik deklarasyon üzerine hücre salınımı öncesi ve sonrası görüntüler kaydedilir. Yapışan hücrelerin enzimatik olarak biremesi, örneğin trypsinization ile, hidrojellerdeki tüm hücrelerden hücresel çekişlerin aynı anda salınmasına yol açar ve bu da yüksek sayıda hücreden ayrıntılı bir analiz elde etmeyi zorlaştırır.
Burada, hücre şeklini ve lokalizasyonunu kontrol etmek için mikropatterned hidrojeller hazırlamak için bir protokol ve tek tek hücreleri substrattan ayırmak için UV kullanarak çekiş kuvvetlerini sırayla verimli bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Çekiş kuvveti ölçümleri için, floresan boncukların sadece üst katmana gömüldüğü, yoğunluklarını artıran ve dikey yayılmalarını azaltan çift katmanlı PA hidrojelleri üretmek için bir teknik sunuyoruz. Hücresel çekiş kuvvetlerinin UV aracılı salınımının mikropatterning ile birleştirilmesi, desenli hücreler arasında yeterli bir mesafe olması koşuluyla, hücre deklamenti (örneğin, ilgi çekici bölgedeki diğer hücrelerin yapışmasını etkilemeden tek hücrelerin) üzerinde uzamsal kontrol elde etmeyi mümkün kılar. Hücresel çekiş daha sonra 2D-TFM için en verimli ve güvenilir yöntem kullanılarak yeniden oluşturulur, yani Fourier Transform Traction Sitometri (FTTC) düzenlileştirme ile17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>#440159</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>#33209</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %</td>
			<td>#1610140</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>#CP-CONT-BSG-A-G</td>
			<td>NanoAndMore</td>
			<td>5 &#956;m spherical tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system</td>
			<td>#NanoWizard3</td>
			<td>JPK</td>
			<td>Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>#A3678</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2 %</td>
			<td>#1610142</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CAUTION : toxic, work under a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#C11440-42U30</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sCMOS</td>
			<td>#ANDORZYLA4.2</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRox</td>
			<td>#C10422</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom incubator chamber</td>
			<td></td>
			<td>EMBLEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>#1300 100</td>
			<td>Picodent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>#41965</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Eclipse Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>#Axiovert200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>#9065.3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>#S181T</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>#F13191</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Alexa488 conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>#F1141</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8805</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (365/415)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8848</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (505/515)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8810</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (580/605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads 200 nm</td>
			<td>#F8807</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Carboxylated (660/680)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 15 mm round</td>
			<td>#41001115</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip 24 mm round</td>
			<td>#41001124</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>#MRH08230</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>20x air NA 0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td>#CRL-2991</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>#MPEG-SVA-5000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxyethyl acrylamide</td>
			<td>#697931</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>#100-E</td>
			<td>TePla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>#PLPPgel</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>#P4823</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)</td>
			<td>#PLL(20-g[3.5]-PEG(2)</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium(meta) periodate</td>
			<td>#S1878</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>#17919</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Pattening module</td>
			<td>#PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVO cleaner</td>
			<td>#342-220</td>
			<td>Jelight</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy

Kanalizma kuvveti mikroskopisi (TFM), mekanobiyolojide hücre kuvvetlerini ölçmek için kullanılan başlıca yöntemdir. Genellikle bu, hücre çekişi (2D-TFM) altında deforme olan düz yumuşak substratlara bağlı kalan hücreler için kullanılmaktadır. TFM, polidimetilsiloksina (PDMS) veya poliakrilamid (PA) gibi doğrusal elastik malzemelerin kullanımına dayanır. PA'da 2D-TFM için, yüksek verim elde etmedeki zorluk esas olarak hücre şekillerinin ve çekişlerinin büyük değişkenliğinden kaynaklanır ve standardizasyon çağrısında bulunur. 2D-TFM çalışmaları için mikropatterned PA hidrojellerini hızlı ve verimli bir şekilde imal etmek için bir protokol sunuyoruz. Mikropatternler ilk olarak, hücre dışı matris proteinlerinin sadece mikropatterned bölgelere bağlandığı, yüzeyin geri kalanının hücreler için yapışkansız kaldığı UV'ye yakın ışık kullanılarak maskesiz fotolithografi ile oluşturulur. Hücre dışı matris proteinlerinin mikropatterning aktif aldehit gruplarının varlığından kaynaklanır, bu da tek hücreleri veya hücre gruplarını barındırmak için farklı şekillerde yapışkan bölgelere neden olandır. TFM ölçümleri için, akrilamid ve bis-akrilamid miktarlarını değiştirerek ve düzenli Fourier Transform Traction Sitometri (FTTC) ile hücre çekiş alanlarını yeniden oluşturmak için gömülü floresan boncukların yer değiştirmesini izleyerek farklı esneklikteki PA hidrojellerini kullanıyoruz.
Hücre kuvvetlerinin kesin kaydını daha da sağlamak için, tek hücreler veya hücre grupları için tanımlanmış bölgelerde hücre çekişlerini serbest bırakmak için kontrollü bir desenli ışık dozunun kullanımını açıklıyoruz. Bu yönteme lokal UV aydınlatma çekiş kuvveti mikroskopisi (LUVI-TFM) diyoruz. Enzimyasal tedavi ile tüm hücreler aynı anda numuneden ayrılırken, numunenin farklı bölgelerindeki hücrelerin LUVI-TFM çekiş kuvvetleri sırayla kaydedilebilir. Bu protokolün uygulanabilirliğini gösteriyoruz (i) hücre çekiş kuvvetlerini alt tabakaya kontrollü yapıştırmanın bir işlevi olarak incelemek ve (ii) aynı örnekten daha fazla sayıda deneysel gözlem elde etmek.

PA hidrojelleri, PA'nın kovalent bağlantısı için reaktif gruplar sunan methacrylated cam kapaklar üzerinde polimerize edildi. Bu şekilde, hidrojelleri sulu bir çözeltiye yerleştirirken, alt tabakadan kopması önlenmiştir (Şekil 1A-D). Hidrojel yüzeyinin yakınında yüksek yoğunluklu fidüsyal belirteçler elde etmek için çift katmanlı bir PA hidrojel hazırlanmasını geliştirdik. Alt tabaka, herhangi bir floresan boncuk olmadan, methacrylated kapaklı üzerinde polimerize edildi. Daha sonra, boncuk içeren başka bir katman alt tabakanın üzerine polimerize edildi (Şekil 1E-H), genellikle tek bir odak düzleminde boncuk dağılımı elde etmek ve boncuk yoğunluğunu artırmak için kullanılan tortulaşma ihtiyacının yerini aldı. TFM ölçümleri sırasında hücre şekli üzerinde kontrol sağlamak için, fibronektin desenli mikroyapıların cam kapaklıktan polimerize pa'ya doğrudan aktarılması yoluyla mikropatterned PA hidrojelleri ürettik (Şekil 1F-F'). Üst hidrojel tabaka çözeltisine% 1 geleneksel olmayan çapraz bağlayıcı (oksitlenmiş HEA) eklenmesi, fibronektin amin gruplarına yaygın olarak bağlanan aldehit grupları sağlar.
Yaklaşık 60 μm kalınlığında pa hidrojeller ve hidrojel yüzeyine yakın üst tabakada kapalı floresan boncuklar hazırladık. Bu tip hidrojel, ters mikroskoplarla hücresel çekişleri görüntülemek için uygun bir substrattır ve yeterince kalındır (TFM'yi gerçekleştirmek için minimum kalınlığın 20-30 μm olduğu bildirilmiştir)18 cam substratın herhangi bir etkisini önlemek için. Floresan boncukların lokalizasyonu konfokal mikroskopi ile görüntülendi (Şekil 1I). Hidrojel üzerinde protein transferini görselleştirmek için floresan etiketli ECM proteinleri kullandık ve epiflooresans mikroskopisi ile görüntüledik (Şekil 1J). Yapışkan hücrelerin parlak alan görüntülerinin yer paylaşımında gösterildiği gibi, hücre gruplarının veya tek hücre gruplarının yapışmasını sağlamak için 100 μm (sol taraf) ve 50 μm (sağ taraf) çapında mikropatterned fibronektin daireleri hazırladık ve floresan olarak etiketlenmiş fiducial boncuklar ve fibronektin mikropatternleri. Farklı bir örnekte, tek hücrelerin mikropatterned fibronektinlere yapışkan tepkisi, paxillin gibi fokal yapıştırma proteinlerinin lokalizasyonunu görüntülemek için dolaylı immünofluoresans mikroskopisi ile doğrulandı (Şekil 1K).
Hem ECM protein kaplaması hem de hidrojel sertliği hücre yapışıklığı için çok önemli parametrelerdir26. PA hidrojellerimizin mekanik özelliklerini karakterize etmek için AFM27 tarafından epiflororesans mikroskobu ile birlikte nanoindentasyon deneyleri gerçekleştirdik. Üç farklı sertliğin hidrojel substratları kurulumuzla hazırlandı ve test edildi (Şekil 2 ve Tablo 1). Küre şeklindeki AFM dokunsallarına döngüsel olarak yaklaşıldı ve kırılmamış PA hidrojellerinden geri çekildi ve kuvvet mesafesi eğrileri kayıt altına alırken Alexa488-mikropatterned alanlara eşlenen fibrinojen. Daha sonra, Temas noktası değerlendirmesi ve Hertz modelinin uygulanması, her numunenin Young modülü (E) tahmin etmemizi sağladı. ECM mikropatterning, Genç'in modülünde değişiklik yapmadı, bu da her bir pa hidrojel ile karşılaştırılabilir kaldı.
Alt tabakadaki yapışık hücreler tarafından uygulanan çekiş kuvvetlerini ölçmek için, hücre çekişlerini serbest bırakmak için yakın UV lazer modülü (UV-A 6000 mJ/mm2) ile donatılmış geniş alan epifluoresans mikroskobu üzerinde gerçekleştirilen referans tabanlı TFM için deneysel bir kurulum geliştirdik (Şekil 3A). Lazer ışını aydınlatması mekansal olarak zamansal olarak kontrol edilebildiğinden, sadece yüksek lazer dozu ile tek bir hücreyi veya hücre kümesini seçici olarak açığa çıkarmak mümkün değildir, aynı zamanda ve daha da önemlisi, tripsin gibi bir sindirim enzimi kullanarak tüm numuneden hücre çıkarmanın yıkıcı ara adımı artık gerekli değildir. Bu kadar yüksek lazer dozu ile hücreleri aydınlatmak, hücre ölümüne yol açan yüksek bir oksidatif strese neden oldu (Şekil 3B). Hücre ölümü, boncuk yer değiştirmesi ile belirtildiği gibi substrattan çekiş salınımını sağladı (Şekil 3A'da gösterilmiştir). PA hidrojellerinin mikron büyüklüğündeki bölgelerini seçici olarak aydınlatmak için UV-A aydınlatmasını bir ışık desen modülü ile birleştirdik (Şekil 3B-C). Bu şekilde mikropatterned hücre kümelerinin (Şekil 3C, F) veya tek hücrelerin (Şekil 3B) çekişlerini serbest bırakmak mümkündür. Daha da önemlisi, zamanımızda ECM desenli hidrojellerin mekanik özellikleri UV maruziyeti tarafından önemli ölçüde etkilenmedi (Şekil 2C). Oksidatif stresteki artış Şekil 3D,E'de gösterilmiştir. Çekiş kuvvetleri, Genelleştirilmiş Çapraz Doğrulama (Şekil 3B, F) tarafından seçilen bir düzenlileştirme parametresi ile düzenli fttc kullanılarak yeniden inşa edilmiştir. Tek hücreler için kuvvetlerin salınımı 15 dakikalık bir süre içinde meydana geldi ve LUVI-TFM'nin sonucu tripsin bazlı TFM ile karşılaştırılabilir (Şekil 3G-H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig01.jpg"> Şekil 1: TFM için desenli fibronektin-substrat preparat şeması. (A) Alt tabaka için çözelti methacrylated yüzey üzerine pipetlenmiştir. (B) Damlacığın üzerine daha küçük bir temiz kapak kılıfı dikkatlice yerleştirilir. (C) Jelleşme süresi 45 dk'dır. (D) Üst kapakçık ayrılmıştır. Alt katman hazır. (E) Üst tabaka için çözelti hidrojel üzerine pipetlenmiştir. (F) Desenli kapak kapağı damlacık üzerine dikkatlice yerleştirilir. (F') Yapışkan proteinlerin cam üzerine mikropatterningi, UV-litografiye yakın maskesiz olarak üretilir ve daha sonra camdan PA hidrojel'e aktarılır. Yapışkan proteinlerin serbest amin grupları, örneğin fibronektin, PA yüzeyindeki aldehit gruplarına kovalent olarak bağlanır. (G) Jelleşme süresi 45 dk'dır. (H) Üst kapakçık ayrılmıştır. Desenli PA hidrojel hazır. (I) Yüzeye yakın yüksek yoğunluklu fidüsyal boncukları gösteren konfokal ksyz mikrografinin 3D gösterimi. (J) PA yüzeyinde floresan etiketli fibronektin (macenta) gömülü floresan boncuklu (yeşil) bir mikrografi, hücrelerin parlak bir alan görüntüsü ile kaplanmış. (K) Daire şeklindeki fibronektin mikropatterine (100 μm) bağlı tek bir hücrenin dolaylı immünofluoresans mikroskopisi. Çekirdek (mavi), paxillin (kırmızı). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig02.jpg"> Şekil 2: Numune mekanik özelliklerinin AFM tarafından karakterizasyonu. (A) AFM nanoindentasyon deneysel kurulumu. Küre şeklindeki bir kantilever, UV tedavisinden önce veya sonra ECM mikropatternlerini ve çift katmanlı PA (%5 Akrilamid, %0,3 Bis-akrilamid) alanlarının desensiz bölgelerini araştırmak için kullanılır. (B) ECM mikropattern (siyah) için girinti eğrisi ile temsili kuvvet. Hertz fit (kırmızı), Young'ın numunenin modülünü (E) hesaplamak için kullanılır. (C) UV-A maruziyeti sonrası desensiz çift katmanlı PA alanları (ECM yok), ECM mikropattern ve ECM mikropattern için mekanik ölçümler. Barlar ± S.E.M. (Brown-Forsythe ve Welch ANOVA testi) anlamına gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig03.jpg"> Şekil 3. Yerel UV-A aydınlatma TFM (LUVI-TFM), geniş bir görüş alanında yerel çekiş kuvveti ölçümleri sağlar. (A) Yerel UV-A aydınlatma TFM şeması. Hücreler, biçimsiz (referans) görüntüyü elde etmek için yüksek dozda UV-A lazer ile tedavi edilir. (B) UV-A lazer aydınlatmadan önce tek bir hücrenin parlak alan görüntüsü. Orta: UV-A lazer aydınlatmadan sonra tek bir hücrenin parlak alan görüntüsü. Sağ: 50 μm çapında UV ışık huzmesi (kırmızı kesikli çizgi) ile aydınlatılmış fibronektin kaplı PA hidrojeline (E = 5,74 kPa) bağlı kalan tek bir MEF'in çekiş kuvveti. (C) Sol: Mikropatterned fibronektin (daire, 100 μm çapında) bağlı bir fare embriyonik fibroblast kümesinin (MEF) çekiş kuvvetlerinin kaydı. Küme 200 μm çapında UV ışık huzmesi (kırmızı kesikli çizgi) ile aydınlatıldı. Sağ: Mikropatterned fibronektin (daire, 300 μm çap) bağlı bir fare embriyonik fibroblast kümesinin (MEF) çekiş kuvvetlerinin kaydı. Küme 300 μm çapında UV ışık huzmesi (kırmızı kesikli çizgi) ile aydınlatıldı. Ölçek çubuğu = 200 μm. (D,E) Floresan mikroskopi ile yüksek UV-A lazer dozu tespit edildikten sonra artan Cy5 sinyal yoğunluğu ile belirtilen hücrelerde oksidatif streste bir artış. Oksidatif stres hücre ölümüne yol açar. Ölçek çubuğu = 200 μm. (F) Sol: Mikropatterned fibronektin (daire, 100 μm çapında) bağlı bir fare embriyonik fibroblast kümesinden (MEF) stres ısı haritası. Sağ: Mikropatterned fibronektin (daire, 300 μm çapında) bağlı bir fare embriyonik fibroblastlar (MEF) kümesinden stres ısı haritası. (G) 100 μm fibronektin mikropatternlerine yapışmış MEF hücreleri UV-A maruziyeti sonrasında çekişlerini yavaşça serbest bırakır. Tam sürüm 15 dakika sonra elde edilir (referans görüntü daha sonra 15 dakika pozlama sonrası çekildi). (H) 300 μm çapında desenli fibronektin'e bağlı kalan MEF hücreleri için geleneksel tripsin bazlı TFM ile karşılaştırma. UV-A aydınlatmasının (6.000 mJ/mm2) ve ardından 15 dakikalık beklemenin sonucu, geleneksel tripsin tedavisinden önemli ölçüde farklı değildir (yani, 20 dakika için% 0.05). Çubuklar S.E.M. anlamına gelir (iki kuyruklu Öğrenci t testi, ****P < 0.0001, * P < 0.05, ns P ≤0.5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Akrilamid (%)</td>
			<td>Bis-akrilamid (%)</td>
			<td>% 40 stok çözeltisinden akrilamid (ml)</td>
			<td>%2 stok çözeltisinden bis-akrilamid (ml)</td>
			<td>Su (ml)</td>
			<td>Genç modülü (kPa)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>8.5</td>
			<td>5,74 ± 0,53</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.15</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.75</td>
			<td>8</td>
			<td>9,69 ± 0,68</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.3</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>7.25</td>
			<td>11,33 ± 1,06</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Hidrojel stok çözeltisi karışımları ve eldeki esneklik
Tüm veriler Max Planck Society'nin (Edmond) Açık Erişim Veri Deposu'na yatırılır ve aşağıdaki adresten erişilebilir: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy at JoVE.com

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

UV'ye yakın litografi ve çekiş kuvveti mikroskopisi, mikropatterned hidrojeller üzerindeki hücresel kuvvetleri ölçmek için birleştirilir. Tek hücrelerin hedeflenen ışık kaynaklı salınımı, aynı numune üzerinde yüksek sayıda ölçüm sağlar.

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Bu prosedürün genel amacı, 2D çekiş kuvveti mikroskopi çalışmaları için mikro desenli hidrojeller imal etmektir. Bu, önce methacrylated cam kapak kayması yaparak ve üzerinde bir poliakrilamid hidrojelinin ilk tabakasını oluşturarak gerçekleştirilir. İkinci adım, çekiş kuvveti mikroskopisi için floresan boncuklar içeren başka bir hidrojel tabaka oluşturmaktır.Hidrojel, üzerine mikro desenli bir kapak kayması ile sandviç yapılır ve bu da mikro desenli matris proteinlerinin hidrojel yüzeyine aktarılmasına neden olur. Daha sonra, poliakrilamid hidrojel oda sıcaklığında 45 dakika polimerize etmek için bırakılır. Üst kapak kayması daha sonra dikkatlice çıkarılır.Floresan mikroskopi görüntüleme, boncukların varlığını ve mikro desenli hücre dışı matris proteinlerinin başarılı transferini göstermek için kullanılır. Bu yöntem, hücrelerin ışığını ve salınımını kullanarak çeşitli çekiş kuvvetlerini verimli ve hassas bir şekilde ölçmeye yardımcı olur. Aynı örnekten daha fazla sayıda deneysel gözlem elde etmek mümkün.Prosedürü gösteren joel Christian olacak, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi. Bir kabın içine 10 mililitre çift damıtılmış su ekleyin. Daha sonra çözeltiye 18,75 mililitre asetik asit, 18,75 mililitre 3 propil methakrilit ve 252,5 mililitre etanol ekleyin.Çözelti tamamlandığında, kristalize bir tabağa aktarın. 24 milimetre yuvarlak kapak slipleri alın, hassas bir silme ile temizleyin ve özel yapılmış bir teflon rafa koyun. Daha sonra çözeltiye daldırın ve 15 dakika kuluçkaya yatırın.Rafı alın ve etanol ile durulayın. Kapak kaymalarını hava akımı altında kurutun. Methacrylated kapak kaymaları oda sıcaklığında bir aya kadar saklanabilir.15 milimetrelik yuvarlak bir kapak kayması alın ve bir Petri kabına yerleştirin. Kapak fişinin üst tarafını işaretlemek için elmas bir kalem kullanın. Daha sonra oksijen plazması tedavisi ile temizliğe devam edin.Kapak fişi iki dakika boyunca 0,4 milibar ve 200 Watt'ta temizdir. Kapak kaymasının yüzeyine Poli-L-Lizin çözeltisinin% 0.01'inin 100 mikrolitresini pipetleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kapak fişini 8,5 pH'da 10 milimolar ile yıkayın.Fazla sıvıyı çıkar, ancak yüzeyi ıslak tutun. Pipet 10 milimolar pH 8.5 çözeltisinde mililitre başına 50 miligram pipet kapak kaymasının yüzeyine 100 miligram ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kapak kaymalarını 10 milimolar pH 8.5 ile durulayın.Daha sonra yüzeye iki mikrolitre PLPP jel ve ardından 40 mikrolitre etanol ekleyin. Çözeltiyi homojenize etmek için Petri kabını hafifçe eğin. Çözeltinin polarize olmasını beş dakika bekleyin.Kapak fişini 35 milimetrelik bir alt delik Petri kabının içine yerleştirin. Kapak fişini içeren Petri kabını mikroskop aşamasına yerleştirin. Odağı camın yüzeyine ayarlayın.Önceden çizilmiş deseni yükleyin ve kilitleyin. Milimetre kare başına 30 milijoule UV dozu ile desenleme başlayın. Desenleme adımını tamamladıktan sonra desen kapağı fişini çıkar ve yüzeyi PBS ile durulayın.Numuneyi, oda sıcaklığında bir saat boyunca PBS'de çözünmüş Alexa 488 ile eşleştirilmiş mililitre fibronektin başına 25 mikrogram ve mililitre fibrinojen başına 25 mikrogramlık 100 mikrolitre karışımı ile kuluçkaya yatırın. Hidrojel substratını hazırlamak için, methacrylated kapak fişini bir Petri kabına koymakla başlayın. Başlamak için, 15 mililitrelik Falcon tüpüne 9,55 mililitre çift damıtılmış su ekleyerek taze oksitlenmiş AgA çözeltisi hazırlayın.Ardından 0,5 mililitre AgA ekleyin. Daha sonra çözeltiye 42 miligram sodyum meta piruvat ekleyin. Çözeltiyi çalkalayıcıda dört saat ayarlayın.Daha sonra tablo 1'e göre akrilamid, bis-akrilamid ve çift damıtılmış suyu karıştırarak stok çözeltisini hazırlayın. Stok çözeltisi dört santigrat derecede bir yıla kadar saklanabilir. 99,3 mikrolitre stok çözeltisini 0,5 mikrolitre amonyum persülfat %1 ve 0,2 mikrolitre TEMED ile karıştırarak alt tabaka için çalışma solüsyonunu hazırlayın.Çözeltiden 10 mikrolitre alın ve pipet damlası olarak methacrylated kapak kaymasına alın. Damlacık üzerine dikkatlice 15 milimetrelik yuvarlak bir kapak kayması yerleştirin ve polimerize olması için 45 dakika bekleyin. Ardından, üst kapak kaymasını neşterle ayırın.Daha sonra 93,3 mikrolitre stok çözeltisini bir mikrolitre oksitlenmiş HEA, beş mikrolitre floresan boncuk, 0,5 mikrolitre amonyum persülffat% 1 ve 0,2 mikrolitre TEMED ile karıştırarak üst tabaka için çalışma solüsyonunu hazırlayın. Çözeltiden beş mikrolitre alın ve alt katman hidrojel üzerine damla açısından pipetleyin. Damlacık üzerine dikkatlice bir mikro desenli kapak kayması yerleştirin.Polimerize olması için 45 dakika bekleyin. Kapak fişini neşterle yavaşça ayırın. Ve kapak fişini özel delinmiş altı kuyu plakasının altına yapıştırın.Kuyulara PBS ekleyin. Hücreleri görmek için PBS'yi altı kuyu plakasından aspire edin. Fibroblastlar için, L-glutamin içeren yüksek glikoz DMEM ekleyin ve% 10 FPS ve% 1 penisilin ve streptomisidin ile destekleyin.Hücreleri bir gecede 37 santigrat derece ve%5 CO2'de kuluçkaya yatırın. Mikroskopi aşaması için CO2'yi ve ısıtmayı açın. Ardından mikroskobu açın ve kuyu plakasını sahneye yerleştirin.Aydınlatma desenini ayarlayın ve ilgi çekici hücreleri işaretleyin. Hidrojel yüzeyine yeniden odaklanın. Brightfield kanalındaki hücrelerin görüntüsünü alın.Boncukların görüntüsünü deforme durumda çekmek için kanala geçin. Daha sonra lazer kanalına geçin ve hücreyi üç dakika boyunca desene göre aydınlatın. Bu, milimetre kare başına 6.000 milijoule'lik bir doza karşılık gelir.Daha sonra, kanalı değiştirin ve boncukların görüntüsünü biçimlendirilmemiş durumda alın. Çekiş kuvvetlerini hesaplamak için, yanal sürüklenme için zaten düzeltilmiş floresan boncuk görüntülerini açın. Çekiş kuvvetlerinin tam analizi ekli komut dosyasında ayrıntılı olarak yer almaktadır.Hücrelerin hidrojel yüzeyindeki mikro desenli bölgelere seçici yapışmasını doğrulamak için, örnekler önceden etiketlenmiş matris proteinleri kullanılarak floresan mikroskopi ve hücreleri görselleştirmek için brightfield mikroskopisi ile görüntülenmiştir. Poliakrilamid hidrojellerin mekanik özellikleri, farklı miktarlarda akrilamid ve bis-akrilamid karıştırılarak değişmektedir. Hidrojel sertliği atomik kuvvet mikroskopisi ile nanoindentasyon deneyleri ile değerlendirildi.Poliakrilamid hidrojelin mikron büyüklüğündeki bölgelerini seçici olarak aydınlatmak için mekansal, temporally kontrollü, ultraviyole lazer ışını aydınlatması uygulandıktan sonra çekiş kuvveti ölçümleri yapıldı. Çekiş kuvvetleri, genelleştirilmiş çapraz doğrulama ile seçilen bir düzenlileştirme parametresi ile düzenli fttc kullanılarak yeniden inşa edilmiştir. Işık ve mikro desen hücrelerinin kullanımı ile birlikte çekim kuvveti mikroskopisine dayanan model modüler yaklaşımımız çok yönlüdür ve çözünürlüğünü ve hassasiyetini artırmak için diğer mikroskopi ve görüntüleme kurulumu ile daha fazla kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

ASC farklılaşma kontrol için bir iki tabakalı Hidrojel mühendislik

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Eşzamanlı Dual Kamera Emisyon Yarma Sisteminin Kullanılması İki Emisyon Kanallarda Gerçek zamanlı yakalama Görüntüleri: Uygulamalar Yapışma Hücre

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Doku Seviyesi Mekaniğinin Kontrol Altına Almak İçin Uyumlu Yüzeylerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonilerinin Geometrisinin Desenlemi

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Referanssız Çekiş Kuvveti Mikroskopi Platformunun İmalatı ve Uygulanması

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...