Name: isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro
Uploaded: 2022-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

نود أن نعرب عن امتناننا لتارا فان ميرينبوير ، وألبرت فان ويك ، ويولاندا فان دير فيلدن ، وجان د. بلانكنشتيجن ، ولان تران ، وبيتر ل. هورديك ، وفريق PAREL-AAA ، وجميع جراحي الأوعية الدموية في أمستردام UMC ، و Zaans Medisch Centrum ، ومستشفى Dijklander لتوفير المواد والدعم لهذه الدراسة.

ملاحظة: تم الحصول على خزعات الأبهر أثناء إصلاح تمدد الأوعية الدموية المفتوح في المراكز الطبية بجامعة أمستردام ، المركز الطبي بجامعة VU ، أمستردام ، Zaans Medisch Centrum ، مستشفى Zaandam و Dijklander ، Hoorn ، هولندا. تم الحصول على أنسجة الأبهر الضابطة من قطعة الشريان الأورطي المرتبطة بالشريان الكلوي الذي تم ح?...

<ol>
	<li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections:+focus+on+smooth+muscle+cell+contractile+dysfunction.">Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).</li><li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+smooth+muscle+cell+force+generation+as+a+driver+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections.">Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).</li><li>Groeneveld, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaglycan+(TGFBR3)+up-regulation+correlates+with+increased+TGF-&#946;+signaling+in+Marfan+patient+fibroblasts+in+vitro.">Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-&#946; signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).</li><li>Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-smooth+muscle+actin+expression+enhances+cell+traction+force.">Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).</li><li>Peyton, S. R., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+governs+smooth+muscle+cell+motility+in+a+biphasic+fashion.">Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion.</a> Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).</li><li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2.">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+(nucleotide+oligomerization+domain-like+receptor+family,+pyrin+domain+containing+3)-caspase-1+inflammasome+degrades+contractile+proteins:+implications+for+aortic+biomechanical+dysfunction+and+aneurysm+and+dissection+formation.">NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).</li><li>Bogunovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+smooth+muscle+cell+contractility+as+a+novel+concept+of+abdominal+aortic+aneurysm+pathophysiology.">Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).</li><li>Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangement+of+adherens+junctions+by+transforming+growth+factor-&#946;1:+role+of+contraction.">Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-&#946;1: role of contraction.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).</li><li>Hu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+ECIS+and+LAPS+for+establishing+a+cardiomyocyte-based+biosensor.">Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).</li><li>Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+cellular+impedance+assays:+bringing+cardiotoxicity+screening+to+the+front+line.">Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line.</a> Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).</li><li>Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-stimulated+cyclic+guanosine+monophosphate+inhibits+vascular+smooth+muscle+cell+migration+by+inhibiting+Ca/calmodulin-dependent+protein+kinase+II.">Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).</li><li>Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor+of+activated+T+cells+5+regulates+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation.">Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).</li><li>Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin+induces+a+quiescent+phenotype+and+inhibits+migration+in+vascular+smooth+muscle+cells+in+vitro.">Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro.</a> Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).</li><li>Burger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+and+functional+assessment+of+smooth+muscle+like-cells+with+pathogenic+variants+in+aneurysm+genes+ACTA2,+MYH11,+SMAD3+and+FBN1.">Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1.</a> Human Molecular Genetics. , (2021).</li><li>Yeung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+human+dermal+fibroblasts+to+smooth+muscle-like+cells+to+study+the+effect+of+MYH11+and+ACTA2+mutations+in+aortic+aneurysms.">Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms.</a> Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).</li></ol>

تقدم هذه الورقة طريقة لقياس انكماش SMC في المختبر ، بناء على التغيرات في المعاوقة واحتلال السطح. أولا ، يتم وصف عزل وزراعة وتوسيع SMCs البشرية الأولية الخاصة بالمريض والخلايا الليفية الجلدية ، تليها كيفية استخدامها لقياسات الانقباض. 
يرتبط أحد قيود الدراسة بالحصول على ال?...

خلايا العضلات الملساء (SMCs) هي نوع الخلايا السائد في الطبقة الإنسية الأبهرية، وهي الطبقة الأكثر سمكا في الشريان الأورطي. داخل الجدار ، يتم توجيهها شعاعيا وتشارك ، من بين وظائف أخرى ، في تضيق الأوعية وتوسيع الأوعية1. تشارك آلية الانقباض SMC في نقل القوة في الشريان الأورطي من خلال الرابط الوظيفي مع المصفوفة خارج الخلية2. ترتبط الطفرات في الجينات المشفرة لبروتينات جهاز انقباض SMC ، مثل سلسلة الميوسين الثقيلة للعضلات الملساء (MYH11) والأكتين العضلي الأملس (ACTA2) ، بحالات تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري العائلي ، مما يؤكد أهمية تقلص SMC في الحفاظ على السلامة الهيكلية والوظيفية للشريان الأورطي 1,2 . علاوة على ذلك ، ترتبط الطفرات في مسار إشارات TGFβ أيضا بتمدد الأوعية الدموية الأبهري ، ويمكن أيضا دراسة آثارها في الفيزيولوجيا المرضية لتمدد الأوعية الدموية الأبهري في الخلايا الليفية الجلدية3.
يعد قياس الإنتاجية العالية لانكماش SMC في المختبر تحديا. نظرا لأنه لا يمكن قياس انقباض SMC في الجسم الحي لدى البشر ، فإن الفحوصات المخبرية على الخلايا البشرية تقدم بديلا ممكنا. علاوة على ذلك ، فإن تطور تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني (AAA) في النماذج الحيوانية إما مستحث كيميائيا عن طريق ، على سبيل المثال ، تروية الإيلاستاز ، أو ناجم عن طفرة محددة. لذلك ، لا يمكن مقارنة البيانات الحيوانية بتطور AAA في البشر ، والذي له في الغالب سبب متعدد العوامل ، مثل التدخين والعمر و / أو تصلب الشرايين. في المختبر تم قياس انقباض SMC حتى الآن بشكل رئيسي بواسطة الفحص المجهري لقوة الجر 4,5 ، وتحديد كمية تدفقات الكالسيوم داخل الخلايا Fura-2 الفلورية6 ، ومقايسات تجاعيد الكولاجين7. في حين أن الفحص المجهري لقوة الجر يوفر رؤية رقمية لا تقدر بثمن للقوى الناتجة عن خلية واحدة ، إلا أنه غير مناسب للفحص عالي الإنتاجية بسبب معالجة البيانات الرياضية المعقدة وتحليل خلية واحدة في كل مرة ، مما يعني أنه يستغرق وقتا طويلا جدا لقياس عدد تمثيلي من الخلايا لكل متبرع. تسمح اختبارات تجاعيد صبغة Fura-2 والكولاجين بالتحديد السطحي للانكماش ولا تعطي مخرجات رقمية دقيقة ، مما يجعلها أقل ملاءمة للتمييز بين الاختلافات الخاصة بالمريض. تم إثبات ضعف تقلص SMC في الخلايا المشتقة من الشريان الأورطي لمرضى تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني لأول مرة من خلال تحسين طريقة جديدة لقياس تقلص SMC في المختبر8. وقد تم ذلك عن طريق إعادة استخدام طريقة استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية (ECIS). ECIS هو اختبار متوسط الإنتاجية في الوقت الفعلي لتحديد حجم سلوك الخلايا الملتصقة وانكماشها9،10،11 مثل نمو SMC والسلوك في فحوصات التئام الجروح والهجرة 12،13،14. يتم وصف الطريقة الدقيقة في قسم البروتوكول. بهذه الطريقة المحسنة ، يمكن أيضا استخدام ECIS لدراسة تقلص الخلايا الليفية بسبب حجمها ومورفولوجيتها المتشابهة.
الهدف من هذه الورقة هو تقديم وصف تدريجي لطريقة قياس انكماش SMC في المختبر باستخدام ECIS8 ومقارنة الانكماش بين SMCs الضابطة والمريضة. أولا ، يتم شرح عزل وزراعة SMCs الأولية من خزعات الأبهر الضابطة والمريض ، والتي يمكن استخدامها لقياس الانقباض. ثانيا ، يتم وصف قياسات وتحليل الانكماش ، إلى جانب التحقق من تعبير علامة SMC. علاوة على ذلك ، تصف هذه الورقة طريقة عزل الخلايا الليفية الجلدية الخاصة بالمريض والتي يمكن قياس تقلصها باستخدام نفس المنهجية. يمكن استخدام هذه الخلايا للدراسات الخاصة بالمريض التي تركز على تمدد الأوعية الدموية الأبهري أو أمراض القلب والأوعية الدموية الأخرى15 أو الدراسات التنبؤية باستخدام بروتوكول التمايز الذي يسمح بقياس الانقباض قبل جراحة تمدد الأوعية الدموية16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Array</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>96W10idf PET</td>
			<td>Array used to measure contraction in the ECIS setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol</td>
			<td>Dr. Franz H&#246;hler Chemie GmbH</td>
			<td>RVG 12801</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solution used to dilute ionomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Addition to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Medium used to culture skin fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly &#39;&#39;Medium 231&#39;&#39;)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>M231500</td>
			<td>Medium used to culture smooth muscle cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen countess II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>Compound used for contraction stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>B230561</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics used for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospathe buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td>Kit used for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S00725</td>
			<td>Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11754250</td>
			<td>Kit used for cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td>Reagent for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZTheta</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>ZTheta</td>
			<td>ECIS instrument used for contraction measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro

خلايا العضلات الملساء (SMCs) هي نوع الخلايا السائد في الوسط الأبهري. آلياتهم الانقباضية مهمة لنقل القوة في الشريان الأورطي وتنظم تضيق الأوعية وتوسع الأوعية. ترتبط الطفرات في الجينات المشفرة لبروتينات جهاز الانقباض SMC بأمراض الأبهر ، مثل تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري. يعد قياس انكماش SMC في المختبر أمرا صعبا ، خاصة بطريقة عالية الإنتاجية ، وهو أمر ضروري لفحص مواد المرضى. الطرق المتاحة حاليا ليست مناسبة لهذا الغرض. تقدم هذه الورقة طريقة جديدة تعتمد على استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية والركيزة (ECIS). أولا ، يتم وصف بروتوكول explant لعزل SMCs البشرية الأولية الخاصة بالمريض من خزعات الأبهر والخلايا الليفية الجلدية الأولية البشرية الخاصة بالمريض لدراسة تمدد الأوعية الدموية الأبهري. بعد ذلك ، يتم تقديم وصف مفصل لطريقة انكماش جديدة لقياس الاستجابة الانقباضية لهذه الخلايا ، بما في ذلك التحليل اللاحق والاقتراح لمقارنة المجموعات المختلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة تقلص الخلايا الملتصقة في سياق الدراسات الانتقالية (القلبية الوعائية) ودراسات فحص المرضى والأدوية.

لاختبار قابلية تكرار هذه الطريقة ، تم التحقق من صحة الطريقة أولا باستخدام SMCs التحكم فقط. لتحديد قابلية تكرار القياس بين التجارب، تم رسم قياسين مستقلين لجميع خطوط خلايا التحكم والمريض المضمنة كمخطط Bland-Altman (الشكل 3B). أظهرت المؤامرة أن هذه الطريقة لا تظهر التباين خارج فترة ال...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

تصف هذه الورقة طريقة قائمة على زراعة الإكسبولوجيا لعزل وزراعة خلايا العضلات الملساء الأبهرية البشرية الأولية الخاصة بالمريض والخلايا الليفية الجلدية. علاوة على ذلك ، يتم تقديم طريقة جديدة لقياس تقلص الخلايا والتحليل اللاحق ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الاختلافات الخاصة بالمريض في هذه الخلايا.

عزل خلايا العضلات الملساء الأبهرية الأولية الخاصة بالمريض وقياسات الانقباض شبه الكمية في الوقت الفعلي في المختبر

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

تسمح هذه الطريقة للباحثين بدراسة تقلص الخلايا لخط خلايا مريض متعدد في وقت واحد. يسمح لنا بدراسة الأمراض بشكل أسرع وأكثر كفاءة. تسمح لنا هذه التقنية بقياس تقلص الخلايا في الوقت الفعلي.في غضون ساعة ، يمكننا الحصول على قيم الانكماش لعشرات الخلايا. أثبتنا لأول مرة أن تقلص الخلايا العضلية ينخفض في مجموعة من المرضى الذين يعانون من تمدد الأوعية الدموية الأبهري. يمكن أن يكون هذا مؤشرا حيويا جديدا أو هدفا للعلاج الطبي.ابدأ بتعقيم زوجين من الملقط الجراحي والمشرط عن طريق غمرهما في 70٪ من الإيثانول ثم مسحهما جافين. ثم ماصة اثنين من ملليلتر من SMC المتوسطة في طبق بتري حيث سيتم إجراء تشريح الأنسجة. ماصة التالية 2.5 ملليلتر من SMC المتوسطة في قارورتين T-25.قم بتدوير القوارير بحيث يغطي الحجم الصغير من الوسط السطح بأكمله. فحص الخزعة بصريا ، وتحديد الطبقات الأبهرية الثلاث من خلال وجود لويحات تصلب الشرايين على الجانب الداخلي والنسيج الضام الغروي على الجانب العرضي لتمييز الطبقات. لعزل SMCs عن الوسائط ، قم بإزالة الطبقتين الأخريين عن طريق وضع الأنسجة ذات لوحة intima الجانبية لأعلى أولا ، ثم قم بإزالة اللوحة الصلبة عن طريق سحبها بعيدا عن الأنسجة باستخدام ملقط أثناء دفع الأنسجة لأسفل باستخدام الزوج الثاني من الملقط حتى تكون الطبقة الإنسية الموحدة الوردية مرئية.الآن اقلب الأنسجة وكرر نفس الإجراء عن طريق سحب الطبقة المغامرة ، مع التأكد من إزالة جميع الأجزاء المرئية في أكبر عدد ممكن من المحاولات حسب الحاجة لأن هذه الطبقة لن تنفصل عن الوسائط بسهولة. بمجرد عزل طبقة الوسائط ، قم بقطع الأنسجة إلى مكعبات عن طريق الضغط على الوسائط لأسفل باستخدام الملقط وقطع الأنسجة في اتجاه واحد باستخدام المشرط مما يؤدي إلى إجراء تخفيضات نظيفة أحادية الاتجاه لتقليل الضرر. ضع 10 إلى 20 من قطع الأنسجة هذه في الربع العلوي من قشور T-25 باستخدام الملقط.بعد تعقيم زوجين من الملقط الجراحي والمشرط كما هو موضح سابقا ، ماصة ملليلتر من وسط الخلايا الليفية في طبق بتري حيث سيتم إجراء تشريح الأنسجة. ثم ماصة 2.5 ملليلتر من وسط الخلايا الليفية في قارورتين T-25 وتدور القوارير حولها بحيث يغطي الحجم الصغير للوسط السطح بأكمله. افحص الخزعة بصريا لتحديد البشرة ذات سطح الجلد الذي يمكن التعرف عليه ، وأحيانا بشعر مرئي ، ثم ابحث عن الدهون الصفراء واللزجة تحت الجلد على الجانب الآخر.الطبقة بين البشرة والدهون تحت الجلد هي الأدمة ، مصدر الخلايا الليفية القابلة للحياة. لعزل الخلايا الليفية عن الأدمة، قم بإزالة الطبقتين الأخريين عن طريق وضع الأنسجة على جانب الأدمة لجعل جميع الطبقات الثلاث مرئية. ثم امسك الأنسجة لأسفل باستخدام الملقط واقطع البشرة بأكملها في خط نظيف واحد دون الإضرار بالأنسجة.الآن اقلب الأنسجة وكرر نفس الإجراء عن طريق القطع داخل الأدمة بالتوازي مع الحدود مع الدهون تحت الجلد. بمجرد عزل الأدمة ، قم بقطع الأنسجة إلى مكعبات تضغط على الأنسجة لأسفل باستخدام ملقط وتقطع الأنسجة في اتجاه واحد باستخدام المشرط. ثم ضع 10 إلى 20 من قطع الأنسجة هذه في الربع العلوي من قارورة T-25 باستخدام الملقط.عد الخلايا باستخدام عداد خلية آلي وزرع SMCs في ثلاثة أضعاف بكثافة بذر تبلغ 30،000 خلية لكل بئر في 200 ميكرولتر من وسط SMC في لوحة ECIS المغلفة بالجيلاتين. ضع اللوحة مع SMCs في حامل ECIS المكون من 96 بئرا في حاضنة زراعة الخلايا. انقر نقرا مزدوجا فوق برنامج ECIS Applied BioPhysics لفتح البرنامج واضغط على زر الإعداد.تحقق مما إذا كانت جميع الأقطاب الكهربائية على اتصال بالحامل في اللوحة السفلية اليسرى المسماة "تكوين جيد". إذا لم تكن الأقطاب الكهربائية متصلة بشكل صحيح ، فاضبط اللوحة في الحامل قبل بدء القياس. الآن حدد نوع اللوحة في نفس اللوحة بالنقر فوق نوع الصفيف.بعد ذلك ، قم بإعداد ماصتين محددتين بحجم ميكرولتر و 150 ميكرولتر. قبل البدء في التحفيز ، اضغط على Mark في البرنامج ووضع تعليق. لتحفيز الخلايا ، قم بإزالة الغطاء ووضعه على سطح معقم داخل الحاضنة.ثم حث انكماش SMC عن طريق سحب ميكرولترين من محلول عمل الأيونومايسين في كل بئر في أسرع وقت ممكن. بمجرد تحفيز جميع الخلايا ، اخلط الوسط في الآبار باستخدام الماصة الثانية. لتحديد قابلية تكرار القياس بين التجارب، تم رسم قياسين مستقلين لجميع خطوط خلايا التحكم والمريض المضمنة كمخطط Bland-Altman، مما يدل على أن هذه الطريقة لم تظهر التباين خارج فترة الثقة، باستثناء خط خلية شاذ واحد.أظهر بئران تم زرعهما بنفس التجربة وتم تحفيزهما في وقت واحد نفس منحنى الاستجابة التعاقدية عمليا. للتحقق مما إذا كانت الاستجابة المعروضة هي انكماش وليس إجهادا تناضحيا بسبب تحفيز الأيونومايسين ، تم استبدال الوسط بعد التحفيز وتم تسجيل سلوك الخلايا ، مما أظهر أن الخلايا المحفزة بدأت تنتشر فوق القطب مرة أخرى. أظهرت الاستجابة الانقباضية في SMCs المستمدة من الأبهر السليم غير الموسع استجابة متوسطة بنسبة 61٪ مقارنة بمتوسط الاستجابة بنسبة 52٪ من مرضى تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني.تم استخدام متوسط الاستجابة الانقباضية للمجموعة الضابطة لتحديد أربعة مرضى لديهم قيم انكماش أقل من القيم العادية. أكد تحليل اللطخة الغربية والقياس الكمي اللاحق أن الخلايا تعبر عن علامات SMC. لتحديد القدرة التكاثرية ل SMC ، تم إجراء qPCR ل Ki67.كان تعبير Ki67 قابلا للاكتشاف في جميع الخلايا ، لكنه لم يرتبط بالإخراج المقلص. عند تحفيز الخلايا للانكماش ، تذكر عدم سحب الكثير من الآبار في نفس الوقت وحاول ماصة في أسرع وقت ممكن. قد يحتاج هذا الإجراء إلى بعض الممارسة.باستخدام هذه الطريقة ، قمنا بتقسيم المرضى بناء على انكماشهم وتقليل التعاقد الطبيعي مما سمح لنا بالتحقيق في هؤلاء المرضى والروابط بخصائصهم السريرية مثل التدخين.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

عزل الشريان السري الإنسان خلايا العضلات الملساء (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

عزل الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء من الفئران حديثي الولادة

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

قياسات الوقت الحقيقي من البروتين غشاء: مستقبلات التفاعلات عن طريق مأكل السطح الرنين (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

الفئران الأرواح سحق إصابة: كفاءة<em&gt; في فيفو</em&gt; نموذج من انتشار الخلايا العضلية السلس والوظيفة البطانية

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

عزل وثقافة الخلايا البطانية الأبهرية الأولية من الخنازير المصغرة

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

قياس انتشار خلايا العضلات الملساء الوعائية باستخدام الكيمياء فوق

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

عزل خلايا الصمام الخلالي الماوس لدراسة تكلس الصمام الأبهري في المختبر

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...