Name: isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro
Uploaded: 2022-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

Vi vil gerne med taknemmelighed anerkende Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, PAREL-AAA-teamet og alle vaskulære kirurger fra Amsterdam UMC, Zaans Medisch Centrum og Dijklander hospital for at levere materialer og støtte til denne undersøgelse.

BEMÆRK: Aortabiopsier blev opnået under reparation af åben aneurisme i Amsterdam University Medical Centers, VU University Medical Center, Amsterdam, Zaans Medisch Centrum, Zaandam og Dijklander hospital, Hoorn, Holland. Kontrol aortavæv blev opnået fra det stykke af aorta, der var fastgjort til nyrearterien høstet til nyretransplantationer. Kun patienter over 18 år blev inkluderet, og alle patienter gav deres informerede samtykke til at deltage i undersøgelsen. Alt materiale blev indsamlet i overensstemmelse med...

<ol>
	<li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections:+focus+on+smooth+muscle+cell+contractile+dysfunction.">Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).</li><li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+smooth+muscle+cell+force+generation+as+a+driver+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections.">Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).</li><li>Groeneveld, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaglycan+(TGFBR3)+up-regulation+correlates+with+increased+TGF-&#946;+signaling+in+Marfan+patient+fibroblasts+in+vitro.">Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-&#946; signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).</li><li>Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-smooth+muscle+actin+expression+enhances+cell+traction+force.">Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).</li><li>Peyton, S. R., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+governs+smooth+muscle+cell+motility+in+a+biphasic+fashion.">Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion.</a> Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).</li><li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2.">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+(nucleotide+oligomerization+domain-like+receptor+family,+pyrin+domain+containing+3)-caspase-1+inflammasome+degrades+contractile+proteins:+implications+for+aortic+biomechanical+dysfunction+and+aneurysm+and+dissection+formation.">NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).</li><li>Bogunovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+smooth+muscle+cell+contractility+as+a+novel+concept+of+abdominal+aortic+aneurysm+pathophysiology.">Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).</li><li>Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangement+of+adherens+junctions+by+transforming+growth+factor-&#946;1:+role+of+contraction.">Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-&#946;1: role of contraction.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).</li><li>Hu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+ECIS+and+LAPS+for+establishing+a+cardiomyocyte-based+biosensor.">Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).</li><li>Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+cellular+impedance+assays:+bringing+cardiotoxicity+screening+to+the+front+line.">Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line.</a> Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).</li><li>Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-stimulated+cyclic+guanosine+monophosphate+inhibits+vascular+smooth+muscle+cell+migration+by+inhibiting+Ca/calmodulin-dependent+protein+kinase+II.">Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).</li><li>Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor+of+activated+T+cells+5+regulates+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation.">Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).</li><li>Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin+induces+a+quiescent+phenotype+and+inhibits+migration+in+vascular+smooth+muscle+cells+in+vitro.">Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro.</a> Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).</li><li>Burger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+and+functional+assessment+of+smooth+muscle+like-cells+with+pathogenic+variants+in+aneurysm+genes+ACTA2,+MYH11,+SMAD3+and+FBN1.">Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1.</a> Human Molecular Genetics. , (2021).</li><li>Yeung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+human+dermal+fibroblasts+to+smooth+muscle-like+cells+to+study+the+effect+of+MYH11+and+ACTA2+mutations+in+aortic+aneurysms.">Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms.</a> Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).</li></ol>

Dette papir præsenterer en metode til måling af SMC-sammentrækning in vitro, baseret på ændringerne i impedans og overfladebesættelse. For det første beskrives isolering, dyrkning og udvidelse af patientspecifikke primære humane SMC'er og hudfibroblaster, efterfulgt af hvordan man bruger dem til sammentrækningsmålinger. 
En begrænsning af undersøgelsen er relateret til opnåelse af cellerne gennem en eksplantprotokol. De celler, der formerer sig fra biopsien, kan have andr...

Glatte muskelceller (SMC'er) er den fremherskende celletype i det aorta mediale lag, det tykkeste lag af aorta. Inden for væggen er de radialt orienterede og er involveret i blandt andet vasokonstriktion og vasodilatation1. SMC-kontraktilmaskineriet er involveret i transmissionen af kraft i aorta gennem den funktionelle forbindelse med den ekstracellulære matrix2. Mutationer i gener, der koder for proteinerne i SMC-kontraktile apparater, såsom glat muskel myosin tung kæde (MYH11) og glat muskel actin (ACTA2), har været relateret til tilfælde af familiære thoracaortaaneurismer, hvilket understreger relevansen af SMC-sammentrækning med hensyn til at opretholde den strukturelle og funktionelle integritet af aorta 1,2 . Desuden er mutationer i TGFβ-signalvejen også forbundet med aortaaneurismer, og deres virkninger i aortaaneurismepatofysiologi kan også undersøges i hudfibroblaster3.
Måling af høj gennemstrømning af SMC-sammentrækning in vitro er udfordrende. Da SMC-kontraktilitet ikke kan måles in vivo hos mennesker, udgør in vitro-assays på humane celler et gennemførligt alternativ. Desuden er abdominal aortaaneurisme (AAA) udvikling i dyremodeller enten kemisk induceret af for eksempel elastaseperfusion eller forårsaget af en specifik mutation. Derfor er dyredata ikke sammenlignelige med AAA-udvikling hos mennesker, som for det meste har en multifaktoriel årsag, såsom rygning, alder og / eller aterosklerose. In vitro SMC-kontraktilitet er hidtil hovedsageligt blevet målt ved trækkraftmikroskopi 4,5, kvantificering af Fura-2-fluorescens intracellulære calciumfluxer6 og kollagenrynkendeassays7. Mens trækkraftmikroskopi giver uvurderlig numerisk indsigt i de kræfter, der genereres af en enkelt celle, er den ikke egnet til screening med høj gennemstrømning på grund af den komplekse matematiske databehandling og analysen af en celle ad gangen, hvilket betyder, at det er meget tidskrævende at måle et repræsentativt antal celler pr. Donor. Fura-2 farvestof- og kollagenrynkende assays tillader overfladisk bestemmelse af sammentrækning og giver ikke et præcist numerisk output, hvilket gør dem mindre egnede til at diskriminere patientspecifikke forskelle. Nedsat SMC-sammentrækning i celler afledt af aorta hos abdominale aortaaneurismepatienter blev demonstreret for første gang ved at optimere en ny metode til måling af SMC-sammentrækning in vitro8. Dette blev gjort ved at genbruge den elektriske celle-substrat impedansføling (ECIS) metode. ECIS er et realtids, medium-throughput assay til kvantificering af klæbende celleadfærd og sammentrækning 9,10,11 såsom SMC vækst og adfærd i sårheling og migration assays 12,13,14. Den nøjagtige metode er beskrevet i protokolafsnittet. På denne optimerede måde kan ECIS også bruges til at studere fibroblastkontraktion på grund af deres lignende størrelse og morfologi.
Formålet med dette papir er at give en trinvis beskrivelse af metoden til måling af SMC-sammentrækning in vitro ved hjælp af ECIS8 og sammenligning af sammentrækningen mellem kontrol og patient-SMC'er. For det første forklares isolering og dyrkning af primære SMC'er fra kontrol- og patientaortabiopsier, som kan bruges til sammentrækningsmåling. For det andet beskrives sammentrækningsmålinger og -analyser sammen med verifikationen af SMC-markørekspression. Desuden beskriver dette papir metoden til isolering af patientspecifikke dermale fibroblaster, hvis sammentrækning kan måles ved hjælp af den samme metode. Disse celler kan anvendes til patientspecifikke undersøgelser med fokus på aortaaneurisme eller andre kardiovaskulære patologier15 eller prognostiske undersøgelser ved hjælp af en transdifferentieringsprotokol, der muliggør sammentrækningsmåling før aneurismekirurgi16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Array</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>96W10idf PET</td>
			<td>Array used to measure contraction in the ECIS setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol</td>
			<td>Dr. Franz H&#246;hler Chemie GmbH</td>
			<td>RVG 12801</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solution used to dilute ionomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Addition to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Medium used to culture skin fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly &#39;&#39;Medium 231&#39;&#39;)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>M231500</td>
			<td>Medium used to culture smooth muscle cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen countess II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>Compound used for contraction stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>B230561</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics used for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospathe buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td>Kit used for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S00725</td>
			<td>Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11754250</td>
			<td>Kit used for cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td>Reagent for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZTheta</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>ZTheta</td>
			<td>ECIS instrument used for contraction measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro

Glatte muskelceller (SMC'er) er den fremherskende celletype i aortamediet. Deres kontraktile maskiner er vigtige for overførsel af kraft i aorta og regulerer vasokonstriktion og vasodilatation. Mutationer i gener, der koder for SMC-kontraktile apparatproteiner, er forbundet med aortasygdomme, såsom thoraxaortaaneurismer. Måling af SMC-sammentrækning in vitro er udfordrende, især på en måde med høj gennemstrømning, hvilket er afgørende for screening af patientmateriale. Aktuelt tilgængelige metoder er ikke egnede til dette formål. Dette papir præsenterer en ny metode baseret på elektrisk celle-substratimpedansføling (ECIS). For det første beskrives en eksplantatorprotokol for at isolere patientspecifikke humane primære SMC'er fra aortabiopsier og patientspecifikke humane primære dermale fibroblaster til undersøgelse af aortaaneurismer. Dernæst gives en detaljeret beskrivelse af en ny sammentrækningsmetode til måling af disse cellers kontraktile respons, herunder den efterfølgende analyse og forslag til sammenligning af forskellige grupper. Denne metode kan bruges til at studere sammentrækningen af klæbende celler i forbindelse med translationelle (kardiovaskulære) undersøgelser og patient- og lægemiddelscreeningsundersøgelser.

For at teste reproducerbarheden af denne metode blev metoden først valideret udelukkende ved hjælp af SMC'er til kontrol. For at bestemme reproducerbarheden af intereksperimental måling blev to uafhængige målinger af alle inkluderede kontrol- og patientcellelinjer afbildet som et Bland-Altman-plot (figur 3B). Plottet viste, at denne metode ikke viser variabilitet uden for konfidensintervallet, bortset fra en afvigende cellelinje. Desuden viste disse resultater, at to brønde, der er pod...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Dette papir beskriver en eksplantationskulturbaseret metode til isolering og dyrkning af primære, patientspecifikke humane aorta glatte muskelceller og dermale fibroblaster. Desuden præsenteres en ny metode til måling af cellekontraktion og efterfølgende analyse, som kan bruges til at studere patientspecifikke forskelle i disse celler.

Isolering af primære patientspecifikke aorta-glatte muskelceller og semikvantemittende realtidskontraktionsmålinger in vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

Denne metode gør det muligt for forskere at studere cellekontraktionen af flere patientcellelinier samtidigt. Det giver os mulighed for at studere sygdomme hurtigere og mere effektivt. Denne teknik giver os mulighed for at kvantificere cellekontraktion i realtid.Inden for en time kan vi opnå sammentrækningsværdierne for snesevis af celler. Vi demonstrerede for første gang, at muskelcellekontraktion er nedsat hos en gruppe patienter med aortaaneurismer. Dette kan være en ny biomarkør eller mål for medicinsk terapi.Begynd med at sterilisere to par kirurgiske tang og en skalpel ved at nedsænke dem i 70% ethanol og derefter tørre dem tørre. Derefter pipetteres to milliliter SMC-medium i en petriskål, hvor vævsdissektionen udføres. Næste pipette 2,5 ml SMC-medium i to T-25-kolber.Kolberne hvirvles rundt, så det lille mediumvolumen dækker hele overfladen. Undersøg biopsien visuelt, identificer de tre aortalag ved tilstedeværelsen af aterosklerotiske plaques på intima-siden og slimet bindevæv på en adventitial side for at skelne lagene. For at isolere SMC'er fra medierne skal du fjerne de to andre lag ved først at placere vævet med intima plaque med siden op og derefter fjerne den faste plak ved at trække den væk fra vævet med tang, mens du skubber vævet ned med det andet par tang, indtil det lyserøde ensartede mediale lag er synligt.Vend nu vævet og gentag den samme procedure ved at trække det eventyrlige lag af, og sørg for at fjerne alle synlige dele i så mange forsøg som nødvendigt, da dette lag ikke let løsner sig fra medierne. Når medielaget er isoleret, skal du skære vævet i terninger ved at trykke mediet ned med tang og skære vævet i en retning ved hjælp af skalpellen, der gør rene ensrettede snit for at minimere skaden. Placer 10 til 20 af disse vævsstykker i den øverste fjerdedel af T-25-flakken ved hjælp af tang.Efter sterilisering af to par kirurgiske tang og en skalpel som beskrevet tidligere, pipette to milliliter fibroblast medium i en petriskål, hvor vævsdissektionen vil blive udført. Derefter pipetteres 2,5 ml fibroblastmedium i to T-25-kolber og hvirvles kolberne rundt, så det lille volumen medium dækker hele overfladen. Undersøg visuelt biopsien for at identificere epidermis med en genkendelig hudoverflade, nogle gange med synligt hår, og kig derefter efter gult og slimet subkutant fedt på den modsatte side.Laget mellem epidermis og det subkutane fedt er dermis, kilden til levedygtige fibroblaster. For at isolere fibroblaster fra dermis skal du fjerne de to andre lag ved at placere vævet på dermissiden for at gøre alle tre lag synlige. Hold derefter vævet nede med tang og skær hele epidermis væk i en ren linje uden at beskadige vævet.Vend nu vævet og gentag den samme procedure ved at skære i dermis parallelt med grænsen med det subkutane fedt. Når dermis er isoleret, skæres vævet i terninger, der presser vævet ned med tang og skærer vævet i en retning ved hjælp af skalpellen. Anbring derefter 10 til 20 af disse vævsstykker i den øverste fjerdedel af T-25-kolben ved hjælp af tangen.Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celletæller, og frø SMC'erne i tre eksemplarer med en såningstæthed på 30.000 celler pr. brønd i 200 mikroliter SMC-medium i den gelatinebelagte ECIS-plade. Anbring pladen sammen med SMC'erne i ECIS's 96-brøndsholder i cellekulturinkubatoren. Dobbeltklik på ECIS Applied BioPhysics-softwaren for at åbne programmet, og tryk på knappen Opsætning.Kontroller, om alle elektroderne har kontakt med holderen i venstre nederste panel mærket Brøndkonfiguration. Hvis elektroderne ikke er korrekt tilsluttet, skal du justere pladen i holderen, inden målingen påbegyndes. Vælg nu pladetypen i det samme panel ved at klikke på Matrixtype.Forbered derefter to pipetter sat til to mikroliter og 150 mikroliter volumen. Før du starter stimuleringen, skal du trykke på Mark i softwaren og placere en kommentar. For at stimulere cellerne skal du fjerne låget og placere det på en steril overflade inde i inkubatoren.Derefter induceres SMC-sammentrækning ved at pipettere to mikroliter af ionomycin-arbejdsløsningen i hver brønd så hurtigt som muligt. Når alle cellerne er blevet stimuleret, blandes mediet i brøndene ved hjælp af den anden pipette. For at bestemme reproducerbarheden af intereksperimental måling blev to uafhængige målinger af alle inkluderede kontrol- og patientcellelinjer afbildet som et Bland-Altman-plot, hvilket viste, at denne metode ikke viste variabilitet uden for konfidensintervallet, bortset fra en afvigende cellelinje.To brønde, der blev podet med det samme eksperiment og stimuleret samtidigt, viste praktisk talt den samme kontraktlige responskurve. For at validere, om det viste respons var en sammentrækning og ikke osmotisk stress på grund af ionomycinstimulering, blev mediet udskiftet efter stimulering, og cellernes opførsel blev registreret, hvilket viste, at de stimulerede celler begyndte at sprede sig over elektroden igen. Det kontraktile respons i SMC'er afledt af sunde, ikke-udvidede aortas viste et medianrespons på 61 % sammenlignet med medianresponsen på 52 % fra patienter med abdominal aortaaneurisme.Kontrolgruppens gennemsnitlige kontraktile respons blev brugt til at identificere fire patienter, der havde lavere sammentrækningsværdier end de normale værdier. Western blot-analysen og den efterfølgende kvantificering bekræftede, at cellerne udtrykker SMC-markører. Til bestemmelse af SMC's proliferative kapacitet blev qPCR udført for Ki67.Ki67-ekspression kunne påvises i alle celler, men korrelerede ikke med den kontraktile udgang. Når du stimulerer cellerne til sammentrækning, skal du huske ikke at pipette for mange brønde på samme tid og forsøge at pipet så hurtigt som muligt. Denne procedure kan have brug for en vis praksis.Ved hjælp af denne metode har vi opdelt patienterne baseret på deres sammentrækning og for at sænke normal kontraktindtrækning, hvilket gjorde det muligt for os at undersøge disse patienter og forbindelserne til deres kliniske egenskaber såsom rygning.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rotte levercellerne

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolering af pulmonal glatte muskelceller fra Neonatal Mus

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Realtidsmålinger membranprotein: Receptor Interactions Brug overfladeplasmonresonans (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering af murint koronar vaskulær glat muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Skade: En Effektiv<em&gt; In vivo</em&gt; Model af smidig muskelcelle proliferation og endotelfunktion

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolation og kultur af primære aorta endotelceller fra miniature grise

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

Måling af spredning af vaskulære glatte muskelceller ved hjælp af Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolering af mus interstitielle ventilceller til undersøgelse af forkalkning af aortaklappen In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...