Name: isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro
Uploaded: 2022-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

Wij danken Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, het PAREL-AAA team en alle vaatchirurgen van het Amsterdam UMC, Zaans Medisch Centrum en Dijklander ziekenhuis voor het leveren van materialen en ondersteuning voor dit onderzoek.

OPMERKING: Aortabiopten werden verkregen tijdens open aneurysmaherstel in Amsterdam Universitair Medische Centra, VU Medisch Centrum, Amsterdam, Zaans Medisch Centrum, Zaandam en Dijklander ziekenhuis, Hoorn, Nederland. Controle-aortaweefsel werd verkregen uit het stuk van de aorta dat aan de nierslagader was bevestigd en dat was geoogst voor niertransplantaties. Alleen patiënten ouder dan 18 jaar werden geïncludeerd en alle patiënten gaven hun geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan het onderzoek. Al het mate...

<ol>
	<li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections:+focus+on+smooth+muscle+cell+contractile+dysfunction.">Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).</li><li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+smooth+muscle+cell+force+generation+as+a+driver+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections.">Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).</li><li>Groeneveld, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaglycan+(TGFBR3)+up-regulation+correlates+with+increased+TGF-&#946;+signaling+in+Marfan+patient+fibroblasts+in+vitro.">Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-&#946; signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).</li><li>Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-smooth+muscle+actin+expression+enhances+cell+traction+force.">Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).</li><li>Peyton, S. R., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+governs+smooth+muscle+cell+motility+in+a+biphasic+fashion.">Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion.</a> Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).</li><li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2.">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+(nucleotide+oligomerization+domain-like+receptor+family,+pyrin+domain+containing+3)-caspase-1+inflammasome+degrades+contractile+proteins:+implications+for+aortic+biomechanical+dysfunction+and+aneurysm+and+dissection+formation.">NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).</li><li>Bogunovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+smooth+muscle+cell+contractility+as+a+novel+concept+of+abdominal+aortic+aneurysm+pathophysiology.">Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).</li><li>Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangement+of+adherens+junctions+by+transforming+growth+factor-&#946;1:+role+of+contraction.">Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-&#946;1: role of contraction.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).</li><li>Hu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+ECIS+and+LAPS+for+establishing+a+cardiomyocyte-based+biosensor.">Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).</li><li>Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+cellular+impedance+assays:+bringing+cardiotoxicity+screening+to+the+front+line.">Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line.</a> Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).</li><li>Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-stimulated+cyclic+guanosine+monophosphate+inhibits+vascular+smooth+muscle+cell+migration+by+inhibiting+Ca/calmodulin-dependent+protein+kinase+II.">Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).</li><li>Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor+of+activated+T+cells+5+regulates+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation.">Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).</li><li>Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin+induces+a+quiescent+phenotype+and+inhibits+migration+in+vascular+smooth+muscle+cells+in+vitro.">Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro.</a> Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).</li><li>Burger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+and+functional+assessment+of+smooth+muscle+like-cells+with+pathogenic+variants+in+aneurysm+genes+ACTA2,+MYH11,+SMAD3+and+FBN1.">Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1.</a> Human Molecular Genetics. , (2021).</li><li>Yeung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+human+dermal+fibroblasts+to+smooth+muscle-like+cells+to+study+the+effect+of+MYH11+and+ACTA2+mutations+in+aortic+aneurysms.">Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms.</a> Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).</li></ol>

Dit artikel presenteert een methode om SMC-contractie in vitro te meten, gebaseerd op de veranderingen in impedantie en oppervlaktebezetting. Eerst wordt de isolatie, kweek en uitbreiding van patiëntspecifieke primaire menselijke SMC's en huidfibroblasten beschreven, gevolgd door hoe ze te gebruiken voor contractiemetingen. 
Een beperking van het onderzoek houdt verband met het verkrijgen van de cellen via een explantprotocol. De cellen die zich vermenigvuldigen uit de biopsie kunnen...

Gladde spiercellen (SMC's) zijn het overheersende celtype in de aortamediale laag, de dikste laag van de aorta. Binnen de muur zijn ze radiaal georiënteerd en zijn ze betrokken bij onder andere vasoconstrictie en vaatverwijding1. De SMC contractiele machinerie is betrokken bij de overdracht van kracht in de aorta via de functionele link met de extracellulaire matrix2. Mutaties in genen die coderen voor de eiwitten van het SMC-contractiele apparaat, zoals gladde spier myosine zware keten (MYH11) en gladde spier actine (ACTA2), zijn gerelateerd aan gevallen van familiale thoracale aorta-aneurysmata, wat de relevantie van SMC-contractie voor het behoud van de structurele en functionele integriteit van de aortaonderstreept 1,2 . Bovendien zijn mutaties in de TGFβ-signaleringsroute ook geassocieerd met aorta-aneurysma's en hun effecten in de pathofysiologie van aorta-aneurysma kunnen ook worden bestudeerd in huidfibroblasten3.
High-throughput meting van SMC-contractie in vitro is een uitdaging. Aangezien SMC-contractiliteit niet in vivo bij mensen kan worden gemeten, vormen in vitro testen op menselijke cellen een haalbaar alternatief. Bovendien wordt de ontwikkeling van abdominaal aorta-aneurysma (AAA) in diermodellen chemisch geïnduceerd door bijvoorbeeld elastaseperfusie, of veroorzaakt door een specifieke mutatie. Daarom zijn diergegevens niet vergelijkbaar met AAA-ontwikkeling bij mensen, die meestal een multifactoriële oorzaak heeft, zoals roken, leeftijd en / of atherosclerose. In vitro SMC-contractiliteit is tot nu toe voornamelijk gemeten door tractiekrachtmicroscopie 4,5, kwantificering van Fura-2 fluorescentie intracellulaire calciumfluxen6 en collageenrimpelingstests7. Hoewel tractiekrachtmicroscopie onschatbare numerieke inzichten biedt in de krachten die door een enkele cel worden gegenereerd, is het niet geschikt voor screening met hoge doorvoer vanwege de complexe wiskundige gegevensverwerking en de analyse van één cel tegelijk, wat betekent dat het zeer tijdrovend is om een representatief aantal cellen per donor te meten. Fura-2 kleurstof en collageen rimpeling assays maken de oppervlakkige bepaling van contractie mogelijk en geven geen precieze numerieke output, waardoor ze minder geschikt zijn voor het onderscheiden van patiëntspecifieke verschillen. Verminderde SMC-contractie in cellen afgeleid van de aorta van abdominale aorta-aneurysmapatiënten werd voor het eerst aangetoond door een nieuwe methode voor het meten van SMC-contractie in vitrote optimaliseren 8. Dit werd gedaan door de elektrische cel-substraat impedantie sensing (ECIS) methode opnieuw te gebruiken. ECIS is een real-time, medium-throughput assay voor de kwantificering van aanhangende celgedrag en contractie 9,10,11 zoals SMC-groei en -gedrag in wondgenezings- en migratietests 12,13,14. De exacte methode wordt beschreven in de protocolsectie. Op deze geoptimaliseerde manier kan het ECIS ook worden gebruikt om fibroblastcontractie te bestuderen vanwege hun vergelijkbare grootte en morfologie.
Het doel van dit artikel is om een stapsgewijze beschrijving te geven van de methode voor het meten van SMC-contractie in vitro met ecis8 en het vergelijken van de contractie tussen controle en patiënt SMC's. Eerst wordt de isolatie en kweek van primaire SMC's van controle- en patiëntaortabiopten uitgelegd, die kunnen worden gebruikt voor contractiemeting. Ten tweede worden contractiemetingen en -analyses, naast de verificatie van SMC-markerexpressie, beschreven. Verder beschrijft dit artikel de methode voor de isolatie van patiëntspecifieke dermale fibroblasten waarvan de contractie met dezelfde methodologie kan worden gemeten. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor patiëntspecifieke studies gericht op aorta-aneurysma of andere cardiovasculaire pathologieën15 of prognostische studies met behulp van een transdifferentiatieprotocol dat contractiemeting voorafgaand aan aneurysmachirurgiemogelijk maakt 16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Array</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>96W10idf PET</td>
			<td>Array used to measure contraction in the ECIS setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol</td>
			<td>Dr. Franz H&#246;hler Chemie GmbH</td>
			<td>RVG 12801</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solution used to dilute ionomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Addition to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Medium used to culture skin fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly &#39;&#39;Medium 231&#39;&#39;)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>M231500</td>
			<td>Medium used to culture smooth muscle cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen countess II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>Compound used for contraction stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>B230561</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics used for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospathe buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td>Kit used for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S00725</td>
			<td>Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11754250</td>
			<td>Kit used for cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td>Reagent for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZTheta</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>ZTheta</td>
			<td>ECIS instrument used for contraction measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro

Gladde spiercellen (SMC's) zijn het overheersende celtype in de aortamedia. Hun contractiele machinerie is belangrijk voor de overdracht van kracht in de aorta en reguleert vasoconstrictie en vaatverwijding. Mutaties in genen die coderen voor de SMC contractiele apparaateiwitten zijn geassocieerd met aortaziekten, zoals thoracale aorta-aneurysma's. Het meten van SMC-contractie in vitro is een uitdaging, vooral op een high-throughput manier, wat essentieel is voor het screenen van patiëntmateriaal. De momenteel beschikbare methoden zijn niet geschikt voor dit doel. Dit artikel presenteert een nieuwe methode op basis van elektrische cel-substraat impedantie sensing (ECIS). Ten eerste wordt een explantprotocol beschreven om patiëntspecifieke menselijke primaire SMC's te isoleren van aortabiopten en patiëntspecifieke menselijke primaire dermale fibroblasten voor de studie van aorta-aneurysma's. Vervolgens wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van een nieuwe contractiemethode om de contractiele respons van deze cellen te meten, inclusief de daaropvolgende analyse en suggestie voor het vergelijken van verschillende groepen. Deze methode kan worden gebruikt om de samentrekking van adherente cellen te bestuderen in het kader van translationele (cardiovasculaire) studies en patiënt- en medicijnscreeningstudies.

Om de reproduceerbaarheid van deze methode te testen, werd de methode eerst gevalideerd met alleen controle-SMC's. Om de reproduceerbaarheid van interexperimentele metingen te bepalen, werden twee onafhankelijke metingen van alle geïncludeerde controle- en patiëntcellijnen uitgezet als een Bland-Altman-plot (figuur 3B). De plot toonde aan dat deze methode geen variabiliteit vertoont buiten het betrouwbaarheidsinterval, behalve voor één uitschieter cellijn. Bovendien toonden deze resultat...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Dit artikel beschrijft een op explantcultuur gebaseerde methode voor de isolatie en kweek van primaire, patiëntspecifieke menselijke aorta gladde spiercellen en dermale fibroblasten. Verder wordt een nieuwe methode gepresenteerd voor het meten van celcontractie en daaropvolgende analyse, die kan worden gebruikt om patiëntspecifieke verschillen in deze cellen te bestuderen.

Isolatie van primaire patiëntspecifieke gladde spiercellen van aorta en semikwantitatieve real-time contractiemetingen in vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

Met deze methode kunnen onderzoekers de celcontractie van meerdere patiëntencellijnen tegelijkertijd bestuderen. Het stelt ons in staat om ziekten sneller en efficiënter te bestuderen. Deze techniek stelt ons in staat om celcontractie in realtime te kwantificeren.Binnen een uur kunnen we de contractiewaarden van tientallen cellen verkrijgen. We toonden voor het eerst aan dat spiercelcontractie afneemt bij een groep patiënten met aorta-aneurysma's. Dit kan een nieuwe biomarker zijn of een doelwit voor medische therapie.Begin met het steriliseren van twee paar chirurgische tangen en een scalpel door ze onder te dompelen in 70% ethanol en ze vervolgens droog te vegen. Pipetteer vervolgens twee milliliter SMC-medium in een petrischaal waarin de weefseldissectie zal worden uitgevoerd. Pipetteer vervolgens 2,5 milliliter SMC medium in twee T-25 kolven.Draai de kolven rond zodat het kleine volume medium het hele oppervlak bedekt. Inspecteer de biopsie visueel en identificeer de drie aortalagen door de aanwezigheid van atherosclerotische plaques aan de intima-kant en slijmerig bindweefsel aan de avonitiale kant om de lagen te onderscheiden. Om SMC's van de media te isoleren, verwijdert u de andere twee lagen door het weefsel met intima-plaque eerst met de zijkant naar boven te plaatsen en vervolgens de vaste plaque te verwijderen door deze met een tang van het weefsel weg te trekken terwijl u het weefsel met de tweede tang naar beneden duwt totdat de roze uniforme mediale laag zichtbaar is.Draai nu het weefsel om en herhaal dezelfde procedure door de adventitiële laag af te trekken, waarbij u ervoor zorgt dat alle zichtbare delen in zoveel pogingen worden verwijderd als nodig is, omdat deze laag niet gemakkelijk van de media zal loskomen. Zodra de medialaag is geïsoleerd, snijdt u het weefsel in blokjes door de media met een tang naar beneden te drukken en het weefsel in één richting te snijden met behulp van het scalpel en schone unidirectionele sneden te maken om schade te minimaliseren. Plaats 10 tot 20 van deze weefselstukken in het bovenste kwart van de T-25 flak met behulp van een tang.Na het steriliseren van twee paar chirurgische tangen en een scalpel zoals eerder beschreven, pipetteer twee milliliter fibroblastmedium in een petrischaal waarin de weefseldissectie zal worden uitgevoerd. Pipetteer vervolgens 2,5 milliliter fibroblastmedium in twee T-25-kolven en draai de kolven rond zodat het kleine volume medium het hele oppervlak bedekt. Inspecteer de biopsie visueel voor het identificeren van de opperhuid met een herkenbaar huidoppervlak, soms met zichtbaar haar, en zoek dan naar geel en slijmerig onderhuids vet aan de andere kant.De laag tussen de epidermis en het onderhuidse vet is de dermis, de bron van levensvatbare fibroblasten. Om fibroblasten van de dermis te isoleren, verwijdert u de andere twee lagen door het weefsel aan de dermiszijde te plaatsen om alle drie de lagen zichtbaar te maken. Houd vervolgens het weefsel met een tang naar beneden en snijd de hele opperhuid in één strakke lijn weg zonder het weefsel te beschadigen.Draai nu het weefsel om en herhaal dezelfde procedure door in de dermis parallel aan de grens met het onderhuidse vet te snijden. Zodra de dermis is geïsoleerd, snijdt u het weefsel in blokjes die het weefsel met een tang naar beneden drukken en het weefsel in één richting snijden met behulp van het scalpel. Plaats vervolgens 10 tot 20 van deze weefselstukken in het bovenste kwart van de T-25 kolf met behulp van de tang.Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller en zaai de SMC's in drievoud met een zaaidichtheid van 30.000 cellen per put in 200 microliter SMC-medium in de met gelatine bedekte ECIS-plaat. Plaats de plaat met de SMC's in de 96-puthouder van de ECIS in de celkweekincubator. Dubbelklik op de ECIS Applied BioPhysics-software om het programma te openen en druk op de knop Setup ( Setup ).Controleer of alle elektroden contact hebben met de houder in het linker onderste paneel met het label Well Configuration. Als de elektroden niet goed zijn aangesloten, past u de plaat in de houder aan voordat u met de meting begint. Selecteer nu het plaattype in hetzelfde deelvenster door op Arraytype te klikken.Bereid vervolgens twee pipetten voor op twee microliter en 150 microliter volume. Voordat u de stimulatie start, drukt u op Markeren in de software en plaatst u een opmerking. Om de cellen te stimuleren, verwijdert u het deksel en plaatst u het op een steriel oppervlak in de incubator.Induceer vervolgens SMC-contractie door zo snel mogelijk twee microliter van de ionomycine-werkoplossing in elke put te pipetteren. Zodra alle cellen zijn gestimuleerd, mengt u het medium in de putjes met behulp van de tweede pipet. Om de reproduceerbaarheid van interexperimentele metingen te bepalen, werden twee onafhankelijke metingen van alle opgenomen controle- en patiëntcellijnen uitgezet als een Bland-Altman-plot, waaruit bleek dat deze methode geen variabiliteit vertoonde buiten het betrouwbaarheidsinterval, behalve één uitschieter cellijn.Twee putten die met hetzelfde experiment waren bezaaid en tegelijkertijd werden gestimuleerd, vertoonden praktisch dezelfde contractuele responscurve. Om te valideren of de getoonde respons een samentrekking was en geen osmotische stress vanwege ionomycinestimulatie, werd het medium na stimulatie vervangen en werd het gedrag van de cellen geregistreerd, waaruit bleek dat de gestimuleerde cellen zich weer over de elektrode begonnen te verspreiden. De contractiele respons bij SMC's afgeleid van gezonde, niet-verwijde aorta's vertoonde een mediane respons van 61% vergeleken met de mediane respons van 52% van abdominale aorta-aneurysmapatiënten.De gemiddelde contractiele respons van de controlegroep werd gebruikt om vier patiënten te identificeren die lagere contractiewaarden hadden dan de normale waarden. De Western blot-analyse en daaropvolgende kwantificering bevestigden dat de cellen SMC-markers tot expressie brengen. Voor het bepalen van de proliferatieve capaciteit van de SMC werd qPCR uitgevoerd voor Ki67.Ki67-expressie was detecteerbaar in alle cellen, maar correleerde niet met de contractiele output. Wanneer u de cellen stimuleert voor contractie, vergeet dan niet om niet te veel putten tegelijkertijd te pipetteren en probeer zo snel mogelijk te pipetteren. Deze procedure kan enige oefening vereisen.Met behulp van deze methode hebben we de patiënten verdeeld op basis van hun contractie en om de normale contractering te verlagen, waardoor we deze patiënten en de verbanden met hun klinische kenmerken zoals roken konden onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolatie van de Mens Umbilical arteriële gladde spiercellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolatie van longslagader gladde spiercel van Neonatale Muizen

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Real Time Metingen van membraaneiwit: Receptor Interacties gebruik Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolatie van muizen coronaire vasculaire gladde spiercellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: Een Efficiënt<em&gt; In Vivo</em&gt; Model van gladde spiercel proliferatie en endotheliale functie

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolatie en cultuur van primaire aorta-endotheel cellen van miniatuur varkens

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

Het meten van de proliferatie van vasculaire gladde spiercellen met behulp van klik chemie

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolatie van muis interstitiële klepcellen om de verkalking van de aortaklep in vitro te bestuderen

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...