Name: isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro
Uploaded: 2022-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

Wir danken Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, dem PAREL-AAA-Team und allen Gefäßchirurgen der Amsterdamer UMC, des Zaans Medisch Centrums und des Dijklander-Krankenhauses für die Bereitstellung von Materialien und Unterstützung für diese Studie.

HINWEIS: Aortenbiopsien wurden während der offenen Aneurysmareparatur in Amsterdam University Medical Centers, VU University Medical Center, Amsterdam, Zaans Medisch Centrum, Zaandam und Dijklander Hospital, Hoorn, Niederlande, gewonnen. Kontrollaortengewebe wurde aus dem Stück der Aorta gewonnen, das an der Nierenarterie befestigt ist, die für Nierentransplantationen entnommen wurde. Nur Patienten über 18 Jahre wurden eingeschlossen, und alle Patienten gaben ihre informierte Zustimmung zur Teilnahme an der Studie. D...

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	<li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections:+focus+on+smooth+muscle+cell+contractile+dysfunction.">Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).</li><li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+smooth+muscle+cell+force+generation+as+a+driver+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections.">Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).</li><li>Groeneveld, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2.">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+(nucleotide+oligomerization+domain-like+receptor+family,+pyrin+domain+containing+3)-caspase-1+inflammasome+degrades+contractile+proteins:+implications+for+aortic+biomechanical+dysfunction+and+aneurysm+and+dissection+formation.">NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).</li><li>Bogunovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+smooth+muscle+cell+contractility+as+a+novel+concept+of+abdominal+aortic+aneurysm+pathophysiology.">Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).</li><li>Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangement+of+adherens+junctions+by+transforming+growth+factor-&#946;1:+role+of+contraction.">Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-&#946;1: role of contraction.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).</li><li>Hu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+ECIS+and+LAPS+for+establishing+a+cardiomyocyte-based+biosensor.">Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).</li><li>Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-stimulated+cyclic+guanosine+monophosphate+inhibits+vascular+smooth+muscle+cell+migration+by+inhibiting+Ca/calmodulin-dependent+protein+kinase+II.">Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).</li><li>Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor+of+activated+T+cells+5+regulates+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation.">Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).</li><li>Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin+induces+a+quiescent+phenotype+and+inhibits+migration+in+vascular+smooth+muscle+cells+in+vitro.">Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro.</a> Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).</li><li>Burger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+and+functional+assessment+of+smooth+muscle+like-cells+with+pathogenic+variants+in+aneurysm+genes+ACTA2,+MYH11,+SMAD3+and+FBN1.">Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1.</a> Human Molecular Genetics. , (2021).</li><li>Yeung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+human+dermal+fibroblasts+to+smooth+muscle-like+cells+to+study+the+effect+of+MYH11+and+ACTA2+mutations+in+aortic+aneurysms.">Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms.</a> Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).</li></ol>

Dieses Papier stellt eine Methode zur Messung der SMC-Kontraktion in vitro vor, basierend auf den Änderungen der Impedanz und der Oberflächenbesetzung. Zunächst wird die Isolierung, Kultivierung und Expansion von patientenspezifischen primären menschlichen SMCs und Hautfibroblasten beschrieben, gefolgt von deren Verwendung für Kontraktionsmessungen. 
Eine Einschränkung der Studie hängt mit der Gewinnung der Zellen durch ein Explantationsprotokoll zusammen. Die Zellen, die sich ...

Glatte Muskelzellen (SMCs) sind der vorherrschende Zelltyp in der Aortenmedialschicht, der dicksten Schicht der Aorta. Innerhalb der Wand sind sie radial orientiert und unter anderem an Vasokonstriktion und Vasodilatation beteiligt1. Die kontraktile SMC-Maschinerie ist an der Kraftübertragung in der Aorta durch die funktionelle Verbindung mit der extrazellulären Matrix2 beteiligt. Mutationen in Genen, die für die Proteine des SMC-kontraktilen Apparates kodieren, wie die schwere Kette der glatten Muskulatur Myosin (MYH11) und das glatte Muskelaktin (ACTA2), wurden mit Fällen von familiären thorakalen Aortenaneurysmen in Verbindung gebracht, was die Relevanz der SMC-Kontraktion für die Aufrechterhaltung der strukturellen und funktionellen Integrität der Aortaunterstreicht 1,2 . Darüber hinaus sind Mutationen im TGFβ-Signalweg auch mit Aortenaneurysmen assoziiert, und ihre Auswirkungen in der Pathophysiologie des Aortenaneurysmas können auch in Hautfibroblasten3 untersucht werden.
Die Hochdurchsatzmessung der SMC-Kontraktion in vitro ist eine Herausforderung. Da die SMC-Kontraktilität beim Menschen nicht in vivo gemessen werden kann, stellen In-vitro-Assays an menschlichen Zellen eine praktikable Alternative dar. Darüber hinaus wird die Entwicklung eines abdominalen Aortenaneurysmas (AAA) in Tiermodellen entweder chemisch induziert, beispielsweise durch Elastaseperfusion, oder durch eine spezifische Mutation verursacht. Daher sind Tierdaten nicht mit der AAA-Entwicklung beim Menschen vergleichbar, die meist eine multifaktorielle Ursache hat, wie Rauchen, Alter und/oder Atherosklerose. In vitro Die SMC-Kontraktilität wurde bisher hauptsächlich durch Zugkraftmikroskopie 4,5, Quantifizierung der intrazellulären Fura-2-Calciumflüsse6 und Kollagenfalten-Assays7 gemessen. Während die Zugkraftmikroskopie einen unschätzbaren numerischen Einblick in die von einer einzelnen Zelle erzeugten Kräfte bietet, ist sie aufgrund der komplexen mathematischen Datenverarbeitung und der Analyse einer Zelle nach der anderen nicht für ein Hochdurchsatz-Screening geeignet, was bedeutet, dass es sehr zeitaufwendig ist, eine repräsentative Anzahl von Zellen pro Spender zu messen. Fura-2-Farbstoff- und Kollagenfalten-Assays ermöglichen die oberflächliche Bestimmung der Kontraktion und liefern keine präzise numerische Ausgabe, wodurch sie weniger geeignet sind, patientenspezifische Unterschiede zu unterscheiden. Eine gestörte SMC-Kontraktion in Zellen, die aus der Aorta von Patienten mit Bauchaortenaneurysmen stammen, wurde erstmals durch die Optimierung einer neuartigen Methode zur Messung der SMC-Kontraktion in vitro8 nachgewiesen. Dies geschah durch die Wiederverwendung der ECIS-Methode (Electric Cell-Substrat Impedance Sensing). ECIS ist ein Echtzeit-Assay mit mittlerem Durchsatz zur Quantifizierung des adhärenten Zellverhaltens und der Kontraktion 9,10,11 wie SMC-Wachstum und -Verhalten in Wundheilungs- und Migrationsassays12,13,14. Die genaue Methode ist im Protokollabschnitt beschrieben. Auf diese optimierte Weise kann das ECIS aufgrund ihrer ähnlichen Größe und Morphologie auch zur Untersuchung der Fibroblastenkontraktion verwendet werden.
Ziel dieses Papiers ist es, eine schrittweise Beschreibung der Methode zur Messung der SMC-Kontraktion in vitro unter Verwendung von ECIS8 und zum Vergleich der Kontraktion zwischen Kontroll- und Patienten-SMCs zu liefern. Zunächst wird die Isolierung und Kultivierung von primären SMCs aus Kontroll- und Patientenaortenbiopsien erläutert, die zur Kontraktionsmessung genutzt werden können. Zweitens werden Kontraktionsmessungen und -analysen sowie die Überprüfung der SMC-Markerexpression beschrieben. Darüber hinaus beschreibt dieser Beitrag die Methode zur Isolierung patientenspezifischer dermaler Fibroblasten, deren Kontraktion mit der gleichen Methodik gemessen werden kann. Diese Zellen können für patientenspezifische Studien verwendet werden, die sich auf Aortenaneurysmen oder andere kardiovaskuläre Pathologien15 konzentrieren, oder für prognostische Studien unter Verwendung eines Transdifferenzierungsprotokolls, das eine Kontraktionsmessung vor einer Aneurysmaoperationermöglicht 16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Array</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>96W10idf PET</td>
			<td>Array used to measure contraction in the ECIS setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol</td>
			<td>Dr. Franz H&#246;hler Chemie GmbH</td>
			<td>RVG 12801</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solution used to dilute ionomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Addition to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Medium used to culture skin fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly &#39;&#39;Medium 231&#39;&#39;)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>M231500</td>
			<td>Medium used to culture smooth muscle cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen countess II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>Compound used for contraction stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>B230561</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics used for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospathe buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td>Kit used for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S00725</td>
			<td>Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11754250</td>
			<td>Kit used for cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td>Reagent for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZTheta</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>ZTheta</td>
			<td>ECIS instrument used for contraction measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro

Glatte Muskelzellen (SMCs) sind der vorherrschende Zelltyp in den Aortenmedien. Ihre kontraktile Maschinerie ist wichtig für die Kraftübertragung in der Aorta und reguliert die Vasokonstriktion und Vasodilatation. Mutationen in Genen, die für die SMC-kontraktilen Apparatusproteine kodieren, sind mit Aortenerkrankungen wie thorakalen Aortenaneurysmen assoziiert. Die Messung der SMC-Kontraktion in vitro ist eine Herausforderung, insbesondere im Hochdurchsatz, was für das Screening von Patientenmaterial unerlässlich ist. Derzeit verfügbare Methoden sind für diesen Zweck nicht geeignet. Dieser Beitrag stellt eine neuartige Methode vor, die auf der Impedanzmessung von elektrischen Zellen und Substraten (ECIS) basiert. Zunächst wird ein Explantationsprotokoll beschrieben, um patientenspezifische humane primäre SMCs aus Aortenbiopsien und patientenspezifischen humanen primären dermalen Fibroblasten zur Untersuchung von Aortenaneurysmen zu isolieren. Als nächstes wird eine detaillierte Beschreibung einer neuen Kontraktionsmethode gegeben, um die kontraktile Reaktion dieser Zellen zu messen, einschließlich der anschließenden Analyse und des Vorschlags zum Vergleich verschiedener Gruppen. Mit dieser Methode kann die Kontraktion adhärenter Zellen im Rahmen von translationalen (kardiovaskulären) Studien sowie Patienten- und Medikamenten-Screening-Studien untersucht werden.

Um die Reproduzierbarkeit dieser Methode zu testen, wurde die Methode zunächst nur mit Kontroll-SMCs validiert. Um die Reproduzierbarkeit interexperimenteller Messungen zu bestimmen, wurden zwei unabhängige Messungen aller eingeschlossenen Kontroll- und Patientenzelllinien als Bland-Altman-Diagramm dargestellt (Abbildung 3B). Das Diagramm zeigte, dass diese Methode keine Variabilität außerhalb des Konfidenzintervalls zeigt, mit Ausnahme einer Ausreißerzelllinie. Darüber hinaus zeigten ...

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Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Dieser Beitrag beschreibt eine explantationskulturbasierte Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer, patientenspezifischer humaner Aortenglattmuskelzellen und dermaler Fibroblasten. Weiterhin wird eine neuartige Methode zur Messung der Zellkontraktion und anschließenden Analyse vorgestellt, mit der patientenspezifische Unterschiede in diesen Zellen untersucht werden können.

Isolierung primärer patientenspezifischer glatter Aortenmuskelzellen und semiquantitative Echtzeit-Kontraktionsmessungen in vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

Diese Methode ermöglicht es den Forschern, die Zellkontraktion mehrerer Patientenzelllinien gleichzeitig zu untersuchen. Es ermöglicht uns, Krankheiten schneller und effizienter zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht es uns, die Zellkontraktion in Echtzeit zu quantifizieren.Innerhalb einer Stunde können wir die Kontraktionswerte von Dutzenden von Zellen erhalten. Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass die Muskelzellkontraktion bei einer Gruppe von Patienten mit Aortenaneurysmen verringert ist. Dies kann ein neuer Biomarker oder ein Ziel für die medizinische Therapie sein.Beginnen Sie mit der Sterilisation von zwei Paar chirurgischer Pinzetten und eines Skalpells, indem Sie sie in 70% Ethanol tauchen und anschließend trocken wischen. Dann pipettieren Sie zwei Milliliter SMC-Medium in einer Petrischale, in der die Gewebedissektion durchgeführt wird. Als nächstes pipettieren Sie 2,5 Milliliter SMC-Medium in zwei T-25-Kolben.Wirbeln Sie die Kolben herum, so dass das kleine Volumen des Mediums die gesamte Oberfläche bedeckt. Untersuchen Sie die Biopsie visuell und identifizieren Sie die drei Aortenschichten durch das Vorhandensein von atherosklerotischen Plaques auf der intimen Seite und schleimigem Bindegewebe auf der Adventitialseite, um die Schichten zu unterscheiden. Um SMCs von den Medien zu isolieren, entfernen Sie die anderen beiden Schichten, indem Sie das Gewebe zuerst mit der Intima-Plaque-Seite nach oben legen, dann entfernen Sie die feste Plaque, indem Sie sie mit einer Pinzette vom Gewebe wegziehen, während Sie das Gewebe mit dem zweiten Paar Pinzetten nach unten drücken, bis die rosa einheitliche mediale Schicht sichtbar ist.Drehen Sie nun das Gewebe um und wiederholen Sie den gleichen Vorgang, indem Sie die zufällige Schicht abziehen, wobei Sie sicherstellen müssen, dass alle sichtbaren Teile in so vielen Versuchen wie nötig entfernt werden, da sich diese Schicht nicht leicht vom Medium löst. Sobald die Medienschicht isoliert ist, schneiden Sie das Gewebe in Würfel, indem Sie das Medium mit einer Pinzette nach unten drücken und das Gewebe mit dem Skalpell in eine Richtung schneiden, um saubere unidirektionale Schnitte zu machen, um Schäden zu minimieren. Legen Sie 10 bis 20 dieser Gewebestücke mit einer Pinzette in das obere Viertel der T-25-Flak.Nach der Sterilisation von zwei Paar chirurgischer Pinzetten und eines Skalpells, wie zuvor beschrieben, pipettieren Sie zwei Milliliter Fibroblastenmedium in einer Petrischale, in der die Gewebedissektion durchgeführt wird. Dann pipettieren Sie 2,5 Milliliter Fibroblastenmedium in zwei T-25-Kolben und wirbeln Sie die Kolben herum, so dass das kleine Volumen des Mediums die gesamte Oberfläche bedeckt. Untersuchen Sie die Biopsie visuell, um die Epidermis mit einer erkennbaren Hautoberfläche, manchmal mit sichtbaren Haaren, zu identifizieren, und suchen Sie dann auf der gegenüberliegenden Seite nach gelbem und schleimigem Unterhautfett.Die Schicht zwischen der Epidermis und dem subkutanen Fett ist die Dermis, die Quelle lebensfähiger Fibroblasten. Um Fibroblasten von der Dermis zu isolieren, entfernen Sie die anderen beiden Schichten, indem Sie das Gewebe auf die Dermisseite legen, um alle drei Schichten sichtbar zu machen. Halten Sie dann das Gewebe mit einer Pinzette fest und schneiden Sie die gesamte Epidermis in einer sauberen Linie ab, ohne das Gewebe zu beschädigen.Drehen Sie nun das Gewebe um und wiederholen Sie den gleichen Vorgang, indem Sie in die Dermis parallel zur Grenze mit dem subkutanen Fett schneiden. Sobald die Dermis isoliert ist, schneiden Sie das Gewebe in Würfel, drücken Sie das Gewebe mit einer Pinzette nach unten und schneiden Sie das Gewebe mit dem Skalpell in eine Richtung. Legen Sie dann 10 bis 20 dieser Gewebestücke mit der Pinzette in das obere Viertel des T-25-Kolbens.Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler und säen Sie die SMCs dreifach mit einer Aussaatdichte von 30.000 Zellen pro Well in 200 Mikrolitern SMC-Medium in der gelatinebeschichteten ECIS-Platte. Legen Sie die Platte mit den SMCs in den 96-Well-Halter des ECIS im Zellkultur-Inkubator. Doppelklicken Sie auf die ECIS Applied BioPhysics Software, um das Programm zu öffnen, und drücken Sie die Setup-Taste.Überprüfen Sie, ob alle Elektroden mit dem Halter im linken unteren Bereich mit der Aufschrift Well Configuration in Kontakt stehen. Wenn die Elektroden nicht richtig angeschlossen sind, stellen Sie die Platte in der Halterung ein, bevor Sie mit der Messung beginnen. Wählen Sie nun den Plattentyp im selben Bedienfeld aus, indem Sie auf Array-Typ klicken.Als nächstes bereiten Sie zwei Pipetten vor, die auf zwei Mikroliter und 150 Mikroliter Volumen eingestellt sind. Bevor Sie mit der Stimulation beginnen, drücken Sie in der Software auf Markieren und geben Sie einen Kommentar ab. Um die Zellen zu stimulieren, entfernen Sie den Deckel und legen Sie ihn auf eine sterile Oberfläche im Inkubator.Dann induzieren Sie die SMC-Kontraktion, indem Sie so schnell wie möglich zwei Mikroliter der Ionomycin-Arbeitslösung in jeden Brunnen pipettieren. Sobald alle Zellen stimuliert wurden, mischen Sie das Medium in den Vertiefungen mit der zweiten Pipette. Um die Reproduzierbarkeit interexperimenteller Messungen zu bestimmen, wurden zwei unabhängige Messungen aller eingeschlossenen Kontroll- und Patientenzelllinien als Bland-Altman-Diagramm dargestellt, was zeigt, dass diese Methode keine Variabilität außerhalb des Konfidenzintervalls zeigte, mit Ausnahme einer Ausreißerzelllinie.Zwei Wells, die mit demselben Experiment gesät und gleichzeitig stimuliert wurden, zeigten praktisch die gleiche vertragliche Reaktionskurve. Um zu validieren, ob es sich bei der gezeigten Reaktion um eine Kontraktion und nicht um osmotischen Stress aufgrund der Ionomycinstimulation handelte, wurde das Medium nach der Stimulation ersetzt und das Verhalten der Zellen aufgezeichnet, was zeigte, dass sich die stimulierten Zellen wieder über die Elektrode auszubreiten begannen. Die kontraktile Reaktion bei SMCs, die von gesunden, nicht erweiterten Aorten abgeleitet wurde, zeigte eine mediane Reaktion von 61% im Vergleich zur medianen Reaktion von 52% bei Patienten mit abdominaler Aortenaneurysma.Die mittlere kontraktile Reaktion der Kontrollgruppe wurde verwendet, um vier Patienten zu identifizieren, die niedrigere Kontraktionswerte als die Normalwerte aufwiesen. Die Western-Blot-Analyse und die anschließende Quantifizierung bestätigten, dass die Zellen SMC-Marker exprimieren. Zur Bestimmung der proliferativen Kapazität des SMC wurde für Ki67 eine qPCR durchgeführt.Die Ki67-Expression war in allen Zellen nachweisbar, korrelierte aber nicht mit der kontraktilen Ausgabe. Wenn Sie die Zellen zur Kontraktion anregen, denken Sie daran, nicht zu viele Brunnen gleichzeitig zu pipettieren und zu versuchen, so schnell wie möglich zu pipettieren. Dieses Verfahren erfordert möglicherweise etwas Übung.Mit dieser Methode haben wir die Patienten basierend auf ihrer Kontraktion und der Verringerung der normalen Kontraktion aufgeteilt, was es uns ermöglichte, diese Patienten und die Verbindungen zu ihren klinischen Merkmalen wie dem Rauchen zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolierung humaner Nabelschnur arteriellen glatten Muskelzellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Forschung

Biologie

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolation der Lungenarterie glatten Muskelzellen aus neugeborenen Mäusen

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: Eine effiziente<em&gt; In vivo</em&gt; Modell der glatten Muskelzellproliferation und Endothelfunktion

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolation und Kultur der primären Aorten-Endothelzellen von Miniaturschweinen

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

Messung der Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen mit Hilfe der Klickchemie

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolierung von interstitiellen Klappenzellen der Maus zur Untersuchung der Verkalkung der Aortenklappe in vitro

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