Name: isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro
Uploaded: 2022-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

אנו רוצים להודות תודה לטארה ואן מריינבואר, אלברט ואן ויק, יולנדה ואן דר ולדן, יאן ד. בלנקנשטיין, לאן טראן, פיטר ל. הורדייק, צוות PAREL-AAA, וכל מנתחי כלי הדם של UMC באמסטרדם, Zaans Medisch Centrum ובית החולים Dijklander על אספקת חומרים ותמיכה למחקר זה.

הערה: ביופסיות אבי העורקים התקבלו במהלך תיקון מפרצת פתוחה במרכזים הרפואיים של אוניברסיטת אמסטרדם, המרכז הרפואי של אוניברסיטת VU, אמסטרדם, זאנס מדיש צנטרום, בית החולים זאנדאם ודייקלנדר, הורן, הולנד. רקמת אבי העורקים של הבקרה התקבלה מחתיכת אבי העורקים המחוברת לעורק הכליה שנקטפה להשתלת כליה. ?...

<ol>
	<li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections:+focus+on+smooth+muscle+cell+contractile+dysfunction.">Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).</li><li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+smooth+muscle+cell+force+generation+as+a+driver+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections.">Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).</li><li>Groeneveld, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaglycan+(TGFBR3)+up-regulation+correlates+with+increased+TGF-&#946;+signaling+in+Marfan+patient+fibroblasts+in+vitro.">Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-&#946; signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).</li><li>Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-smooth+muscle+actin+expression+enhances+cell+traction+force.">Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).</li><li>Peyton, S. R., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+governs+smooth+muscle+cell+motility+in+a+biphasic+fashion.">Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion.</a> Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).</li><li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2.">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+(nucleotide+oligomerization+domain-like+receptor+family,+pyrin+domain+containing+3)-caspase-1+inflammasome+degrades+contractile+proteins:+implications+for+aortic+biomechanical+dysfunction+and+aneurysm+and+dissection+formation.">NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).</li><li>Bogunovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+smooth+muscle+cell+contractility+as+a+novel+concept+of+abdominal+aortic+aneurysm+pathophysiology.">Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).</li><li>Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangement+of+adherens+junctions+by+transforming+growth+factor-&#946;1:+role+of+contraction.">Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-&#946;1: role of contraction.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).</li><li>Hu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+ECIS+and+LAPS+for+establishing+a+cardiomyocyte-based+biosensor.">Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).</li><li>Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+cellular+impedance+assays:+bringing+cardiotoxicity+screening+to+the+front+line.">Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line.</a> Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).</li><li>Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-stimulated+cyclic+guanosine+monophosphate+inhibits+vascular+smooth+muscle+cell+migration+by+inhibiting+Ca/calmodulin-dependent+protein+kinase+II.">Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).</li><li>Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor+of+activated+T+cells+5+regulates+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation.">Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).</li><li>Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin+induces+a+quiescent+phenotype+and+inhibits+migration+in+vascular+smooth+muscle+cells+in+vitro.">Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro.</a> Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).</li><li>Burger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+and+functional+assessment+of+smooth+muscle+like-cells+with+pathogenic+variants+in+aneurysm+genes+ACTA2,+MYH11,+SMAD3+and+FBN1.">Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1.</a> Human Molecular Genetics. , (2021).</li><li>Yeung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+human+dermal+fibroblasts+to+smooth+muscle-like+cells+to+study+the+effect+of+MYH11+and+ACTA2+mutations+in+aortic+aneurysms.">Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms.</a> Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).</li></ol>

מאמר זה מציג שיטה למדידת התכווצות SMC במבחנה, בהתבסס על השינויים בעכבה ובעיסוק פני השטח. ראשית, מתואר הבידוד, התרבות וההתרחבות של עסקים קטנים ובינוניים אנושיים ראשוניים ספציפיים למטופל ופיברובלסטים של העור, ולאחר מכן כיצד להשתמש בהם למדידות התכווצות. 
מגבלה של המחקר קשו...

תאי שריר חלקים (SMCs) הם סוג התא השולט בשכבה המדיאלית של אבי העורקים, השכבה העבה ביותר של אבי העורקים. בתוך הקיר, הם מכוונים רדיאלית ומעורבים, בין שאר הפונקציות, vasoconstriction ו vasodlitation1. מנגנון התכווצות SMC מעורב בהעברת כוח באבי העורקים באמצעות הקשר הפונקציונלי עם המטריצה החוץ-תאית2. מוטציות בגנים המקודדים לחלבונים של מנגנון התכווצות SMC, כגון שרשרת כבדה של מיוזין שרירי חלק (MYH11) ואקטין שריר חלק (ACTA2), היו קשורות למקרים של מפרצות אבי העורקים החזי המשפחתי, מה שמדגיש את הרלוונטיות של התכווצות SMC בשמירה על השלמות המבנית והתפקודית של אבי העורקים 1,2 . יתר על כן, מוטציות במסלול האיתות TGFβ קשורות גם למפרצת אבי העורקים, וניתן לחקור את השפעותיהן בפתופיזיולוגיה של מפרצת אבי העורקים גם בפיברובלסטים בעור3.
מדידת תפוקה גבוהה של התכווצות SMC במבחנה היא מאתגרת. מכיוון שלא ניתן למדוד את התכווצות ה-SMC in vivo בבני אדם, בדיקות במבחנה על תאים אנושיים מהוות חלופה אפשרית. יתר על כן, התפתחות מפרצת אבי העורקים הבטני (AAA) במודלים של בעלי חיים מושרית כימית על ידי, למשל, זלוף אלסטאז, או נגרמת על ידי מוטציה ספציפית. לכן, נתוני בעלי חיים אינם דומים להתפתחות AAA בבני אדם, שלרוב יש לה גורם רב-גורמי, כגון עישון, גיל ו/או טרשת עורקים. במבחנה התכווצות SMC נמדדה עד כה בעיקר על ידי מיקרוסקופיית כוח מתיחה 4,5, כימות של שטפי סידן תוך תאיים פלואורסצנטיים של Fura-26, ומבחני קולגן מתקתקים7. בעוד שמיקרוסקופיית כוח המתיחה מספקת תובנה מספרית שלא תסולא בפז לגבי הכוחות הנוצרים על ידי תא יחיד, היא אינה מתאימה לסינון בתפוקה גבוהה בשל עיבוד הנתונים המתמטי המורכבים וניתוח של תא אחד בכל פעם, כלומר לוקח זמן רב למדוד מספר מייצג של תאים לכל תורם. מבחני צבע Fura-2 וקירור קולגן מאפשרים קביעה שטחית של התכווצות ואינם נותנים תפוקה מספרית מדויקת, מה שהופך אותם לפחות מתאימים להבחנה בהבדלים ספציפיים למטופל. פגיעה בהתכווצות SMC בתאים שמקורם באבי העורקים של חולי מפרצת באבי העורקים הבטני הודגמה לראשונה על ידי אופטימיזציה של שיטה חדשנית למדידת התכווצות SMC במבחנה8. זה נעשה על ידי ייעוד מחדש של שיטת חישת העכבה של המצע התא החשמלי (ECIS). ECIS הוא מבחן בתפוקה בינונית בזמן אמת לכימות התנהגות התאים הדבקים והתכווצות 9,10,11 כגון גדילה והתנהגות של SMC במבחני ריפוי ונדידה של פצעים 12,13,14. השיטה המדויקת מתוארת בסעיף הפרוטוקול. בדרך אופטימלית זו, ניתן להשתמש ב- ECIS גם כדי לחקור התכווצות פיברובלסטים בשל גודלם ומורפולוגיה דומים.
מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מעמיק של השיטה למדידת התכווצות SMC במבחנה באמצעות ECIS8 והשוואת ההתכווצות בין בקרת עסקים קטנים ובינוניים למטופלים. ראשית, מוסבר הבידוד והתרבות של עסקים קטנים ובינוניים ראשוניים מביופסיות בקרה ואבי העורקים של המטופל, אשר יכולות לשמש למדידת התכווצות. שנית, מתוארים מדידות וניתוחים של התכווצות, לצד אימות ביטוי סמן SMC. יתר על כן, מאמר זה מתאר את השיטה לבידוד של פיברובלסטים עוריים ספציפיים לחולה, אשר ניתן למדוד את התכווצותם באמצעות אותה מתודולוגיה. תאים אלה יכולים לשמש למחקרים ספציפיים לחולה המתמקדים במפרצת אבי העורקים או בפתולוגיות קרדיווסקולריות אחרות15 או למחקרים פרוגנוסטיים באמצעות פרוטוקול טרנסדיפרנטיזציה המאפשר מדידת התכווצות לפני ניתוח מפרצת16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Array</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>96W10idf PET</td>
			<td>Array used to measure contraction in the ECIS setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol</td>
			<td>Dr. Franz H&#246;hler Chemie GmbH</td>
			<td>RVG 12801</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solution used to dilute ionomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Addition to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Medium used to culture skin fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly &#39;&#39;Medium 231&#39;&#39;)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>M231500</td>
			<td>Medium used to culture smooth muscle cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen countess II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>Compound used for contraction stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>B230561</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics used for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospathe buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td>Kit used for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S00725</td>
			<td>Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11754250</td>
			<td>Kit used for cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td>Reagent for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZTheta</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>ZTheta</td>
			<td>ECIS instrument used for contraction measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro

תאי שריר חלקים (SMCs) הם סוג התא השולט במדיה אבי העורקים. המכונות החוזיות שלהם חשובות להעברת כוח באבי העורקים ומווסתות את כלי הדם ואת הרחבת כלי הדם. מוטציות בגנים המקודדים לחלבונים של מנגנון החוזה SMC קשורות למחלות אבי העורקים, כגון מפרצות אבי העורקים החזי. מדידת התכווצות SMC במבחנה היא מאתגרת, במיוחד באופן בעל תפוקה גבוהה, החיוני לסינון חומר המטופל. השיטות הזמינות כיום אינן מתאימות למטרה זו. מאמר זה מציג שיטה חדשנית המבוססת על חישת עכבה חשמלית של מצע התא (ECIS). ראשית, פרוטוקול אקספלנט מתואר כדי לבודד את ה-SMCs הראשוניים האנושיים הספציפיים למטופל מביופסיות אבי העורקים ופיברובלסטים עוריים ראשוניים אנושיים ספציפיים למטופל לצורך חקר מפרצות אבי העורקים. לאחר מכן, תיאור מפורט של שיטת כיווץ חדשה ניתן כדי למדוד את תגובת ההתכווצות של תאים אלה, כולל הניתוח הבא והצעה להשוואת קבוצות שונות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את התכווצות התאים הדבקים בהקשר של מחקרים תרגומיים (לב וכלי דם) ומחקרי סינון חולים ותרופות.

כדי לבדוק את יכולת השכפול של שיטה זו, השיטה אומתה לראשונה באמצעות SMCs בקרה בלבד. כדי לקבוע את יכולת השכפול של מדידה בין-ניסיונית, שתי מדידות בלתי תלויות של כל קווי השליטה ותאי המטופל הכלולים הותוו כעלילה של בלנד-אלטמן (איור 3B). העלילה הראתה כי שיטה זו אינה מראה שונות מחוץ למרו?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

מאמר זה מתאר שיטה מבוססת תרבית אקספלנט לבידוד וגידול של תאי שריר חלקים ראשוניים של אבי העורקים האנושיים הספציפיים לחולה ופיברובלסטים עוריים. יתר על כן, מוצגת שיטה חדשנית למדידת התכווצות תאים וניתוח לאחר מכן, אשר ניתן להשתמש בה כדי לחקור הבדלים ספציפיים לחולה בתאים אלה.

בידוד של תאי שריר חלק אבי העורקים העיקריים הספציפיים למטופל ומדידות כיווץ חצי-קוונטיטיביות בזמן אמת במבחנה

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את התכווצות התאים של מספר תאי מטופלים בו זמנית. זה מאפשר לנו לחקור מחלות מהר יותר וביעילות רבה יותר. טכניקה זו מאפשרת לנו לכמת את התכווצות התא בזמן אמת.תוך שעה אנו יכולים לקבל את ערכי ההתכווצות של עשרות תאים. הדגמנו לראשונה שהתכווצות תאי השריר פוחתת בקבוצת חולים עם מפרצת באבי העורקים. זה יכול להיות סמן ביולוגי חדש או יעד חדש לטיפול רפואי.התחילו בעיקור שני זוגות מלקחיים כירורגיים ואיזמל על ידי טבילתם ב-70% אתנול ולאחר מכן ניגובם יבש. לאחר מכן פיפטה שני מיליליטרים של מדיום SMC בצלחת פטרי שבה תבוצע כריתת הרקמה. הבא pipette 2.5 מיליליטרים של SMC בינוני לתוך שני צלוחיות T-25.סובבו את הצלוחיות כך שהנפח הקטן של המדיום יכסה את כל פני השטח. לבחון חזותית את הביופסיה, ולזהות את שלוש שכבות אבי העורקים על ידי נוכחות של פלאקים טרשת עורקים בצד האינטימה ורקמת חיבור דקה בצד ההרפתקני כדי להבחין בין השכבות. כדי לבודד SMCs מהתקשורת, הסר את שתי השכבות האחרות על ידי הצבת הרקמה עם רובד האינטימה בצד הראשון למעלה, ולאחר מכן הסר את הפלאק המוצק על ידי משיכתו מהרקמה עם מלקחיים תוך דחיפת הרקמה כלפי מטה עם זוג המלקחיים השני עד שהשכבה המדיאלית האחידה הוורודה נראית לעין.עכשיו להפוך את הרקמה ולחזור על אותו הליך על ידי משיכת השכבה הרפתקנית, הקפדה להסיר את כל החלקים הנראים לעין בכמה ניסיונות הדרושים ככל שיידרש כמו שכבה זו לא תתנתק מהתקשורת בקלות. לאחר בידוד שכבת המדיה, חותכים את הרקמה לקוביות על ידי לחיצה על המדיה כלפי מטה עם מלקחיים וחותכים את הרקמה בכיוון אחד באמצעות האזמל תוך ביצוע חתכים חד כיווניים נקיים כדי למזער את הנזק. מקם 10 עד 20 של חתיכות רקמה אלה ברבעון העליון של T-25 flak באמצעות מלקחיים.לאחר עיקור שני זוגות מלקחיים כירורגיים ואזמל כפי שתואר קודם לכן, פיפטה שני מיליליטרים של מדיום פיברובלסט בצלחת פטרי שבה תבוצע כריתת הרקמה. לאחר מכן פיפטה 2.5 מיליליטרים של מדיום פיברובלסט לשני צלוחיות T-25 ומסובבת את הצלוחיות כך שהנפח הקטן של המדיום מכסה את כל פני השטח. בדקו חזותית את הביופסיה לזיהוי האפידרמיס עם משטח עור מוכר, לפעמים עם שיער גלוי, ואז חפשו שומן תת עורי צהוב ורזה בצד הנגדי.השכבה בין האפידרמיס לשומן התת עורי היא הדרמיס, המקור לפיברובלסטים בני קיימא. כדי לבודד פיברובלסטים מהדרמיס, הסר את שתי השכבות האחרות על ידי הצבת הרקמה בצד הדרמיס כדי להפוך את כל שלוש השכבות לגלויות לעין. לאחר מכן החזיקו את הרקמה עם מלקחיים וחתכו את כל האפידרמיס בקו אחד נקי מבלי לפגוע ברקמה.עכשיו להפוך את הרקמה ולחזור על אותו הליך על ידי חיתוך בתוך דרמיס במקביל לגבול עם השומן התת עורי. לאחר בידוד הדרמיס, חותכים את הרקמה לקוביות הלוחצות על הרקמה עם מלקחיים וחותכים את הרקמה בכיוון אחד באמצעות האזמל. לאחר מכן הניחו 10 עד 20 מחתיכות הרקמה הללו ברבעון העליון של בקבוקון T-25 באמצעות המלקחיים.ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי וזרעו את ה-SMCs במשולש בצפיפות זריעה של 30, 000 תאים לבאר ב-200 מיקרוליטרים של מדיום SMC בצלחת ECIS המצופה בג'לטין. מניחים את הצלחת עם ה-SMCs לתוך מחזיק 96 הבארות של ECIS בחממת תרביות התאים. לחץ פעמיים על תוכנת ECIS Applied BioPhysics כדי לפתוח את התוכנית וללחוץ על כפתור ההתקנה.בדוק אם לכל האלקטרודות יש קשר עם המחזיק בלוח התחתון השמאלי המסומן Well Configuration. אם האלקטרודות אינן מחוברות כראוי, התאם את הלוחית במחזיק לפני תחילת המדידה. כעת בחר את סוג הלוח באותה חלונית על-ידי לחיצה על סוג מערך.לאחר מכן, הכינו שתי פיפטות בעלות נפח של שני מיקרוליטר ו-150 מיקרוליטר. לפני שתתחיל את הגירוי, לחץ על מארק בתוכנה והנח הערה. כדי לעורר את התאים, להסיר את המכסה ולהניח אותו על משטח סטרילי בתוך האינקובטור.לאחר מכן לגרום להתכווצות SMC על ידי צנרת שני מיקרוליטרים של תמיסת העבודה של היונומיצין לכל באר במהירות האפשרית. לאחר שכל התאים היו מגורה, ערבבו את המדיום בבארות באמצעות הפיפטה השנייה. כדי לקבוע את יכולת השחזור של מדידה בין-ניסיונית, שתי מדידות בלתי תלויות של כל קווי תאי הבקרה והחולה הכלולים הותוו כמתווה של בלנד-אלטמן, והוכיחו כי שיטה זו לא הראתה שונות מחוץ לרווח בר-סמך, למעט קו תא חריג אחד.שתי בארות שנזרעו באותו ניסוי ועוררו בו זמנית הראו כמעט את אותה עקומת תגובה חוזית. כדי לאמת אם התגובה המוצגת הייתה התכווצות ולא מתח אוסמוטי בגלל גירוי יונומיצין, המדיום הוחלף לאחר הגירוי וההתנהגות של התאים נרשמה, מה שהראה כי התאים המגורים החלו להתפשט שוב על האלקטרודה. התגובה החוזית ב-SMCs שמקורה באורטות בריאות ולא מורחבות הראתה תגובה חציונית של 61% לעומת התגובה החציונית של 52% ממטופלי מפרצת באבי העורקים הבטני.תגובת ההתכווצות הממוצעת של קבוצת הביקורת שימשה לזיהוי ארבעה מטופלים בעלי ערכי התכווצות נמוכים יותר מהערכים הרגילים. ניתוח הכתמים המערבי והכימות שלאחר מכן אישרו כי התאים מבטאים סמני SMC. לקביעת יכולת ההתפשטות של ה- SMC, qPCR בוצע עבור Ki67.ביטוי Ki67 היה ניתן לזיהוי בכל התאים, אך לא תאם את תפוקת ההתכווצות. כאשר מגרה את התאים להתכווצות, זכור לא לטפטף יותר מדי בארות בו זמנית וניסה לקטר מהר ככל האפשר. הליך זה עשוי להצריך תרגול מסוים.באמצעות שיטה זו, חילקנו את המטופלים על סמך התכווצותם ועל סמך התכווצות תקינה נמוכה יותר, מה שאיפשר לנו לחקור את המטופלים הללו ואת הקשרים למאפיינים הקליניים שלהם כגון עישון.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

בידוד של האדם עורקי טבורי תאים שרירים חלקים (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine אבי העורקים למחוץ פגיעה: יעיל<em&gt; בויבו</em&gt; מודל של תאים שרירים חלקה תפוצת ו אנדותל פונקציה

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

מדידת התפשטות של תאים שרירים וסקולריים חלקה באמצעות לחץ כימיה

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

בידוד של תאי שסתום ביניים עכבר ללמוד את הסתיידות של שסתום אבי העורקים במבחנה

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...