Name: isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro
Uploaded: 2022-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, il team PAREL-AAA e tutti i chirurghi vascolari dell'ospedale UMC di Amsterdam, Zaans Medisch Centrum e Dijklander per aver fornito materiali e supporto per questo studio.

NOTA: Le biopsie aortiche sono state ottenute durante la riparazione dell'aneurisma aperto nei centri medici dell'Università di Amsterdam, nel centro medico dell'Università VU, Amsterdam, Zaans Medisch Centrum, Zaandam e l'ospedale Dijklander, Hoorn, Paesi Bassi. Il tessuto aortico di controllo è stato ottenuto dal pezzo dell'aorta attaccato all'arteria renale raccolta per i trapianti di rene. Sono stati inclusi solo i pazienti di età superiore ai 18 anni e tutti i pazienti hanno dato il loro consenso informato a par...

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	<li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections:+focus+on+smooth+muscle+cell+contractile+dysfunction.">Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).</li><li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+smooth+muscle+cell+force+generation+as+a+driver+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections.">Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).</li><li>Groeneveld, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2.">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+(nucleotide+oligomerization+domain-like+receptor+family,+pyrin+domain+containing+3)-caspase-1+inflammasome+degrades+contractile+proteins:+implications+for+aortic+biomechanical+dysfunction+and+aneurysm+and+dissection+formation.">NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).</li><li>Bogunovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+smooth+muscle+cell+contractility+as+a+novel+concept+of+abdominal+aortic+aneurysm+pathophysiology.">Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).</li><li>Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangement+of+adherens+junctions+by+transforming+growth+factor-&#946;1:+role+of+contraction.">Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-&#946;1: role of contraction.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).</li><li>Hu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+ECIS+and+LAPS+for+establishing+a+cardiomyocyte-based+biosensor.">Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).</li><li>Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-stimulated+cyclic+guanosine+monophosphate+inhibits+vascular+smooth+muscle+cell+migration+by+inhibiting+Ca/calmodulin-dependent+protein+kinase+II.">Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).</li><li>Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor+of+activated+T+cells+5+regulates+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation.">Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).</li><li>Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin+induces+a+quiescent+phenotype+and+inhibits+migration+in+vascular+smooth+muscle+cells+in+vitro.">Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro.</a> Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).</li><li>Burger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+and+functional+assessment+of+smooth+muscle+like-cells+with+pathogenic+variants+in+aneurysm+genes+ACTA2,+MYH11,+SMAD3+and+FBN1.">Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1.</a> Human Molecular Genetics. , (2021).</li><li>Yeung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+human+dermal+fibroblasts+to+smooth+muscle-like+cells+to+study+the+effect+of+MYH11+and+ACTA2+mutations+in+aortic+aneurysms.">Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms.</a> Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).</li></ol>

Questo documento presenta un metodo per misurare la contrazione SMC in vitro, basato sui cambiamenti nell'impedenza e nell'occupazione della superficie. In primo luogo, viene descritto l'isolamento, la coltura e l'espansione delle SMC umane primarie specifiche del paziente e dei fibroblasti cutanei, seguite da come usarle per le misurazioni della contrazione. 
Una limitazione dello studio è legata all'ottenimento delle cellule attraverso un protocollo di espianto. Le cellule che prol...

Le cellule muscolari lisce (SMC) sono il tipo di cellula predominante nello strato mediale aortico, lo strato più spesso dell'aorta. All'interno della parete, sono orientati radialmente e sono coinvolti, tra le altre funzioni, nella vasocostrizione e nella vasodilatazione1. Il macchinario contrattile SMC è coinvolto nella trasmissione della forza nell'aorta attraverso il collegamento funzionale con la matrice extracellulare2. Mutazioni in geni che codificano per le proteine dell'apparato contrattile SMC, come la catena pesante della miosina muscolare liscia (MYH11) e l'actina della muscolatura liscia (ACTA2), sono state correlate a casi di aneurismi dell'aorta toracica familiare, sottolineando la rilevanza della contrazione della SMC nel mantenimento dell'integrità strutturale e funzionale dell'aorta 1,2 . Inoltre, le mutazioni nella via di segnalazione del TGFβ sono anche associate agli aneurismi aortici e i loro effetti nella fisiopatologia dell'aneurisma aortico possono essere studiati anche nei fibroblasti cutanei3.
La misurazione ad alto rendimento della contrazione SMC in vitro è impegnativa. Poiché la contrattilità SMC non può essere misurata in vivo nell'uomo, i saggi in vitro su cellule umane presentano un'alternativa fattibile. Inoltre, lo sviluppo dell'aneurisma dell'aorta addominale (AAA) in modelli animali è indotto chimicamente, ad esempio, dalla perfusione di elastasi o causato da una mutazione specifica. Pertanto, i dati sugli animali non sono paragonabili allo sviluppo di AAA nell'uomo, che per lo più ha una causa multifattoriale, come il fumo, l'età e / o l'aterosclerosi. In vitro La contrattilità SMC è stata finora misurata principalmente mediante microscopia a forzadi trazione 4,5, quantificazione dei flussi di calcio intracellulare a fluorescenza Fura-26 e saggi di rughe di collagene7. Mentre la microscopia con forza di trazione fornisce preziose informazioni numeriche sulle forze generate da una singola cellula, non è adatta per lo screening ad alto rendimento a causa della complessa elaborazione dei dati matematici e dell'analisi di una cellula alla volta, il che significa che è molto dispendioso in termini di tempo misurare un numero rappresentativo di cellule per donatore. I saggi di tintura fura-2 e di rughe di collagene consentono la determinazione superficiale della contrazione e non danno un risultato numerico preciso, rendendoli meno adatti a discriminare le differenze specifiche del paziente. La compromissione della contrazione della SMC nelle cellule derivate dall'aorta dei pazienti con aneurisma dell'aorta addominale è stata dimostrata per la prima volta ottimizzando un nuovo metodo per misurare la contrazione della SMC in vitro8. Ciò è stato fatto riutilizzando il metodo di rilevamento dell'impedenza del substrato elettrico della cella (ECIS). ECIS è un test in tempo reale a medio rendimento per la quantificazione del comportamento e della contrazione delle cellule aderenti 9,10,11 come la crescita e il comportamento SMC nei saggi di guarigione e migrazione delle ferite 12,13,14. Il metodo esatto è descritto nella sezione del protocollo. In questo modo ottimizzato, l'ECIS può anche essere utilizzato per studiare la contrazione dei fibroblasti a causa delle loro dimensioni e morfologia simili.
Lo scopo di questo documento è quello di fornire una descrizione graduale del metodo per misurare la contrazione SMC in vitro utilizzando ECIS8 e confrontando la contrazione tra controllo e SMC paziente. In primo luogo, viene spiegato l'isolamento e la coltura delle SMC primarie dalle biopsie aortiche di controllo e del paziente, che possono essere utilizzate per la misurazione della contrazione. In secondo luogo, vengono descritte le misurazioni e l'analisi della contrazione, insieme alla verifica dell'espressione del marcatore SMC. Inoltre, questo documento descrive il metodo per l'isolamento dei fibroblasti dermici specifici del paziente la cui contrazione può essere misurata utilizzando la stessa metodologia. Queste cellule possono essere utilizzate per studi specifici del paziente incentrati sull'aneurisma aortico o altre patologie cardiovascolari15 o studi prognostici utilizzando un protocollo di transdifferenziazione che consente la misurazione della contrazione prima dell'intervento chirurgico all'aneurisma16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Array</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>96W10idf PET</td>
			<td>Array used to measure contraction in the ECIS setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol</td>
			<td>Dr. Franz H&#246;hler Chemie GmbH</td>
			<td>RVG 12801</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solution used to dilute ionomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Addition to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Medium used to culture skin fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly &#39;&#39;Medium 231&#39;&#39;)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>M231500</td>
			<td>Medium used to culture smooth muscle cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen countess II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>Compound used for contraction stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>B230561</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics used for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospathe buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td>Kit used for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S00725</td>
			<td>Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11754250</td>
			<td>Kit used for cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td>Reagent for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZTheta</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>ZTheta</td>
			<td>ECIS instrument used for contraction measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro

Le cellule muscolari lisce (SMC) sono il tipo di cellula predominante nel mezzo aortico. Il loro meccanismo contrattile è importante per la trasmissione della forza nell'aorta e regola la vasocostrizione e la vasodilatazione. Le mutazioni nei geni che codificano per le proteine dell'apparato contrattile SMC sono associate a malattie aortiche, come gli aneurismi dell'aorta toracica. Misurare la contrazione SMC in vitro è impegnativo, specialmente in modo ad alta produttività, che è essenziale per lo screening del materiale del paziente. I metodi attualmente disponibili non sono adatti a questo scopo. Questo documento presenta un nuovo metodo basato sul rilevamento dell'impedenza del substrato elettrico della cellula (ECIS). In primo luogo, viene descritto un protocollo di espianto per isolare le SMC primarie umane specifiche del paziente dalle biopsie aortiche e dai fibroblasti dermici primari umani specifici del paziente per lo studio degli aneurismi aortici. Successivamente, viene fornita una descrizione dettagliata di un nuovo metodo di contrazione per misurare la risposta contrattile di queste cellule, compresa la successiva analisi e il suggerimento per confrontare diversi gruppi. Questo metodo può essere utilizzato per studiare la contrazione delle cellule aderenti nel contesto di studi traslazionali (cardiovascolari) e studi di screening di pazienti e farmaci.

Per testare la riproducibilità di questo metodo, il metodo è stato prima convalidato utilizzando solo SMC di controllo. Per determinare la riproducibilità della misurazione interesperimentale, due misurazioni indipendenti di tutte le linee cellulari di controllo e paziente incluse sono state tracciate come un grafico Bland-Altman (Figura 3B). Il grafico ha dimostrato che questo metodo non mostra variabilità al di fuori dell'intervallo di confidenza, ad eccezione di una linea cellulare an...

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Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Questo documento descrive un metodo basato su colture di espianto per l'isolamento e la coltura di cellule muscolari lisce aortiche umane primarie e specifiche per il paziente e fibroblasti dermici. Inoltre, viene presentato un nuovo metodo per misurare la contrazione cellulare e la successiva analisi, che può essere utilizzato per studiare le differenze specifiche del paziente in queste cellule.

Isolamento delle cellule muscolari lisce aortiche primarie specifiche del paziente e misurazioni semiquantitative di contrazione in tempo reale in vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

Questo metodo consente ai ricercatori di studiare la contrazione cellulare di più linee cellulari di pazienti contemporaneamente. Ci permette di studiare le malattie in modo più rapido ed efficiente. Questa tecnica ci permette di quantificare la contrazione cellulare in tempo reale.Entro un'ora, possiamo ottenere i valori di contrazione di dozzine di cellule. Abbiamo dimostrato per la prima volta che la contrazione delle cellule muscolari è diminuita in un gruppo di pazienti con aneurismi aortici. Questo può essere un nuovo biomarcatore o un bersaglio per la terapia medica.Inizia sterilizzando due paia di pinze chirurgiche e un bisturi immergendole nel 70% di etanolo e successivamente asciugandole. Quindi pipettare due millilitri di mezzo SMC in una capsula di Petri in cui verrà eseguita la dissezione del tessuto. Successiva pipetta 2,5 millilitri di SMC medium in due fiaschi T-25.Ruotare i palloni in modo che il piccolo volume di medio copra l'intera superficie. Ispezionare visivamente la biopsia, identificando i tre strati aortici dalla presenza di placche aterosclerotiche sul lato intima e tessuto connettivo viscido sul lato avventiziale per distinguere gli strati. Per isolare gli SMC dal mezzo, rimuovere gli altri due strati posizionando prima il tessuto con la placca intima rivolta verso l'alto, quindi rimuovere la placca solida allontanandola dal tessuto con una pinza mentre si spinge il tessuto verso il basso con il secondo paio di pinze fino a quando lo strato mediale uniforme rosa è visibile.Ora capovolgi il tessuto e ripeti la stessa procedura estraendo lo strato avventiziale, assicurandoti di rimuovere tutte le parti visibili in tutti i tentativi necessari poiché questo strato non si staccherà facilmente dal supporto. Una volta isolato lo strato di supporto, tagliare il tessuto a cubetti premendo il supporto verso il basso con una pinza e tagliando il tessuto in una direzione usando il bisturi facendo tagli unidirezionali puliti per ridurre al minimo i danni. Posizionare da 10 a 20 di questi pezzi di tessuto nel quarto superiore del fiocco T-25 usando una pinza.Dopo aver sterilizzato due paia di pinze chirurgiche e un bisturi come descritto in precedenza, pipettare due millilitri di mezzo fibroblasto in una capsula di Petri in cui verrà eseguita la dissezione del tessuto. Quindi pipettare 2,5 millilitri di fibroblasto medio in due palloni T-25 e ruotare i palloni intorno in modo che il piccolo volume di medio copra l'intera superficie. Ispezionare visivamente la biopsia per identificare l'epidermide con una superficie cutanea riconoscibile, a volte con capelli visibili, quindi cercare il grasso sottocutaneo giallo e viscido sul lato opposto.Lo strato tra l'epidermide e il grasso sottocutaneo è il derma, la fonte di fibroblasti vitali. Per isolare i fibroblasti dal derma, rimuovere gli altri due strati posizionando il tessuto sul lato del derma per rendere visibili tutti e tre gli strati. Quindi tenere il tessuto verso il basso con una pinza e tagliare via l'intera epidermide in una linea pulita senza danneggiare il tessuto.Ora capovolgi il tessuto e ripeti la stessa procedura tagliando all'interno del derma parallelamente al bordo con il grasso sottocutaneo. Una volta isolato il derma, tagliare il tessuto a cubetti premendo il tessuto verso il basso con una pinza e tagliando il tessuto in una direzione usando il bisturi. Quindi posizionare da 10 a 20 di questi pezzi di tessuto nel quarto superiore del pallone T-25 usando la pinza.Contare le cellule utilizzando un contatore cellulare automatizzato e seminare gli SMC in triplice copia a una densità di semina di 30.000 cellule per pozzetto in 200 microlitri di mezzo SMC nella piastra ECIS rivestita di gelatina. Posizionare la piastra con gli SMC nel supporto a 96 pozzetti dell'ECIS nell'incubatore di colture cellulari. Fare doppio clic sul software ECIS Applied BioPhysics per aprire il programma e premere il pulsante Setup.Controllare se tutti gli elettrodi hanno contatto con il supporto nel pannello inferiore sinistro etichettato Well Configuration. Se gli elettrodi non sono collegati correttamente, regolare la piastra nel supporto prima di iniziare la misurazione. Ora selezionate il tipo di piastra nello stesso pannello facendo clic su Tipo matrice ( Array type ).Quindi, preparare due pipette impostate a due microlitri e un volume di 150 microlitri. Prima di iniziare la stimolazione, premere Mark nel software e inserire un commento. Per stimolare le cellule, rimuovere il coperchio e posizionarlo su una superficie sterile all'interno dell'incubatore.Quindi indurre la contrazione SMC pipettando due microlitri della soluzione di lavoro della ionomicina in ciascun pozzo il più rapidamente possibile. Una volta che tutte le cellule sono state stimolate, mescolare il mezzo nei pozzetti usando la seconda pipetta. Per determinare la riproducibilità della misurazione interesperimentale, due misurazioni indipendenti di tutte le linee cellulari di controllo e paziente incluse sono state tracciate come un grafico di Bland-Altman, dimostrando che questo metodo non mostrava variabilità al di fuori dell'intervallo di confidenza, ad eccezione di una linea cellulare anomala.Due pozzi seminati con lo stesso esperimento e stimolati contemporaneamente hanno mostrato praticamente la stessa curva di risposta contrattuale. Per convalidare se la risposta mostrata fosse una contrazione e non uno stress osmotico a causa della stimolazione della ionomicina, il mezzo è stato sostituito dopo la stimolazione ed è stato registrato il comportamento delle cellule, il che ha dimostrato che le cellule stimolate hanno iniziato a diffondersi nuovamente sull'elettrodo. La risposta contrattile nelle SMC derivate da aorte sane e non dilatate ha mostrato una risposta mediana del 61% rispetto alla risposta mediana del 52% dei pazienti con aneurisma dell'aorta addominale.La risposta contrattile media del gruppo di controllo è stata utilizzata per identificare quattro pazienti che avevano valori di contrazione inferiori rispetto ai valori normali. L'analisi Western blot e la successiva quantificazione hanno confermato che le cellule esprimono marcatori SMC. Per determinare la capacità proliferativa dell'SMC, è stata eseguita la qPCR per Ki67.L'espressione di Ki67 era rilevabile in tutte le cellule, ma non era correlata con l'output contrattile. Quando si stimolano le cellule per la contrazione, ricordarsi di non pipettare troppi pozzetti contemporaneamente e cercare di pipettare il più velocemente possibile. Questa procedura potrebbe richiedere un po 'di pratica.Utilizzando questo metodo, abbiamo diviso i pazienti in base alla loro contrazione e alla contrazione normale inferiore che ci ha permesso di indagare questi pazienti e i collegamenti con le loro caratteristiche cliniche come il fumo.

Research

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