Name: isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro
Uploaded: 2022-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

Vi vil takknemlig anerkjenne Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, PAREL-AAA-teamet og alle vaskulære kirurger fra Amsterdam UMC, Zaans Medisch Centrum og Dijklander sykehus for å gi materialer og støtte til denne studien.

MERK: Aortabiopsier ble oppnådd under åpen aneurismereparasjon i Amsterdam University Medical Centers, VU University Medical Center, Amsterdam, Zaans Medisch Centrum, Zaandam og Dijklander hospital, Hoorn, Nederland. Kontroll aortavev ble hentet fra aortastykket festet til nyrearterien høstet for nyretransplantasjoner. Kun pasienter over 18 år ble inkludert, og alle pasientene ga sitt informerte samtykke til å delta i studien. Alt materiale ble samlet inn i samsvar med regelverket i WMA-erklæringen fra Helsinki og ...

<ol>
	<li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections:+focus+on+smooth+muscle+cell+contractile+dysfunction.">Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).</li><li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+smooth+muscle+cell+force+generation+as+a+driver+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections.">Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).</li><li>Groeneveld, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaglycan+(TGFBR3)+up-regulation+correlates+with+increased+TGF-&#946;+signaling+in+Marfan+patient+fibroblasts+in+vitro.">Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-&#946; signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).</li><li>Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-smooth+muscle+actin+expression+enhances+cell+traction+force.">Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).</li><li>Peyton, S. R., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+governs+smooth+muscle+cell+motility+in+a+biphasic+fashion.">Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion.</a> Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).</li><li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2.">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+(nucleotide+oligomerization+domain-like+receptor+family,+pyrin+domain+containing+3)-caspase-1+inflammasome+degrades+contractile+proteins:+implications+for+aortic+biomechanical+dysfunction+and+aneurysm+and+dissection+formation.">NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).</li><li>Bogunovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+smooth+muscle+cell+contractility+as+a+novel+concept+of+abdominal+aortic+aneurysm+pathophysiology.">Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).</li><li>Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangement+of+adherens+junctions+by+transforming+growth+factor-&#946;1:+role+of+contraction.">Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-&#946;1: role of contraction.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).</li><li>Hu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+ECIS+and+LAPS+for+establishing+a+cardiomyocyte-based+biosensor.">Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).</li><li>Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+cellular+impedance+assays:+bringing+cardiotoxicity+screening+to+the+front+line.">Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line.</a> Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).</li><li>Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-stimulated+cyclic+guanosine+monophosphate+inhibits+vascular+smooth+muscle+cell+migration+by+inhibiting+Ca/calmodulin-dependent+protein+kinase+II.">Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).</li><li>Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor+of+activated+T+cells+5+regulates+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation.">Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).</li><li>Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin+induces+a+quiescent+phenotype+and+inhibits+migration+in+vascular+smooth+muscle+cells+in+vitro.">Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro.</a> Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).</li><li>Burger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+and+functional+assessment+of+smooth+muscle+like-cells+with+pathogenic+variants+in+aneurysm+genes+ACTA2,+MYH11,+SMAD3+and+FBN1.">Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1.</a> Human Molecular Genetics. , (2021).</li><li>Yeung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+human+dermal+fibroblasts+to+smooth+muscle-like+cells+to+study+the+effect+of+MYH11+and+ACTA2+mutations+in+aortic+aneurysms.">Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms.</a> Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).</li></ol>

Dette dokumentet presenterer en metode for å måle SMC-sammentrekning in vitro, basert på endringene i impedans og overflate okkupasjon. For det første beskrives isolasjon, dyrking og utvidelse av pasientspesifikke primære menneskelige SMB-er og hudfibroblaster, etterfulgt av hvordan du bruker dem til sammentrekningsmålinger. 
En begrensning i studien er knyttet til å skaffe cellene gjennom en explant-protokoll. Cellene som sprer seg fra biopsien kan ha andre egenskaper enn det ...

Glatte muskelceller (SMCer) er den dominerende celletypen i aortamediallaget, det tykkeste laget av aorta. Innenfor veggen er de radialt orientert og er involvert i blant annet vasokonstriksjon og vasodilasjon1. SMC-kontraktilmaskineriet er involvert i overføring av kraft i aorta gjennom den funksjonelle koblingen med den ekstracellulære matrisen2. Mutasjoner i genkoding for proteinene i SMC-kontraktilapparatet, som glatt muskel myosin tung kjede (MYH11) og glatt muskel aktin (ACTA2), har vært relatert til tilfeller av familiær thoracic aorta aneurisme, understreke relevansen av SMC sammentrekning i opprettholde strukturell og funksjonell integritet av aorta 1,2 . Videre er mutasjoner i TGFβ-signalveien også forbundet med aortaaneurisme, og deres effekter i aortaaneurisme patofysiologi kan også studeres i huden fibroblaster3.
Høy gjennomstrømningsmåling av SMC-sammentrekning in vitro er utfordrende. Siden SMC-kontraktilitet ikke kan måles in vivo hos mennesker, presenterer in vitro-analyser på menneskelige celler et mulig alternativ. Videre er abdominal aortaaneurisme (AAA) utvikling i dyremodeller enten kjemisk indusert av for eksempel elastase perfusjon, eller forårsaket av en bestemt mutasjon. Derfor er dyredata ikke sammenlignbare med AAA-utvikling hos mennesker, som for det meste har en multifaktoriell årsak, for eksempel røyking, alder og / eller aterosklerose. Introduksjon SMC kontraktilitet har så langt hovedsakelig blitt målt ved trekkraft mikroskopi 4,5, kvantifisering av Fura-2 fluorescens intracellulær kalsiumflukser6, og kollagen rynke analyser7. Mens trekkraftmikroskopi gir uvurderlig numerisk innsikt i kreftene som genereres av en enkelt celle, er den ikke egnet for screening av høy gjennomstrømning på grunn av den komplekse matematiske databehandlingen og analysen av en celle om gangen, noe som betyr at det er svært tidkrevende å måle et representativt antall celler per donor. Fura-2 fargestoff og kollagen rynker analyser tillater overfladisk bestemmelse av sammentrekning og gir ikke en presis numerisk utgang, noe som gjør dem mindre egnet for å diskriminere pasientspesifikke forskjeller. Svekket SMC-sammentrekning i celler avledet fra aorta hos abdominale aortaaneurismepasienter ble demonstrert for første gang ved å optimalisere en ny metode for måling av SMC-sammentrekning in vitro8. Dette ble gjort ved å gjenbruke den elektriske celle-substrat impedans sensing (ECIS) metoden. ECIS er en sanntids, middels gjennomstrømningsanalyse for kvantifisering av tilhengercelleadferd og sammentrekning 9,10,11 som SMC-vekst og oppførsel i sårheling og migrasjonsanalyser 12,13,14. Den nøyaktige metoden er beskrevet i protokolldelen. På denne optimaliserte måten kan ECIS også brukes til å studere fibroblastkontraksjon på grunn av deres lignende størrelse og morfologi.
Målet med dette dokumentet er å gi en trinnvis beskrivelse av metoden for måling av SMC-sammentrekningsin vitro ved hjelp av ECIS8 og sammenligning av sammentrekningen mellom kontroll og pasient-SMCer. For det første forklares isolasjon og dyrking av primære SMB-er fra kontroll og pasientaortabiopsier, som kan brukes til sammentrekningsmåling. For det andre beskrives sammentrekningsmålinger og analyse, sammen med verifiseringen av SMC-markøruttrykk. Videre beskriver dette dokumentet metoden for isolering av pasientspesifikke dermale fibroblaster hvis sammentrekning kan måles ved hjelp av samme metodikk. Disse cellene kan brukes til pasientspesifikke studier fokusert på aortaaneurisme eller andre kardiovaskulære patologier15 eller prognostiske studier ved hjelp av en transdifferensiasjonsprotokoll som tillater sammentrekningsmåling før aneurismekirurgi16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Array</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>96W10idf PET</td>
			<td>Array used to measure contraction in the ECIS setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol</td>
			<td>Dr. Franz H&#246;hler Chemie GmbH</td>
			<td>RVG 12801</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solution used to dilute ionomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Addition to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Medium used to culture skin fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly &#39;&#39;Medium 231&#39;&#39;)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>M231500</td>
			<td>Medium used to culture smooth muscle cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen countess II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>Compound used for contraction stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>B230561</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics used for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospathe buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td>Kit used for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S00725</td>
			<td>Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11754250</td>
			<td>Kit used for cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td>Reagent for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZTheta</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>ZTheta</td>
			<td>ECIS instrument used for contraction measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro

Glatte muskelceller (SMB-er) er den dominerende celletypen i aortamediet. Deres kontraktile maskineri er viktig for overføring av kraft i aorta og regulerer vasokonstriksjon og vasodilatasjon. Mutasjoner i genkoding for SMC-kontraktile apparatproteiner er forbundet med aortasykdommer, for eksempel thorax aortaaneurisme. Måling av SMC-sammentrekning in vitro er utfordrende, spesielt på en høy gjennomstrømningsmåte, noe som er viktig for screening av pasientmateriale. Tilgjengelige metoder er for øyeblikket ikke egnet for dette formålet. Dette dokumentet presenterer en ny metode basert på elektrisk celle-substrat impedans sensing (ECIS). For det første beskrives en explantprotokoll for å isolere pasientspesifikke humane primær-SMCer fra aortabiopsier og pasientspesifikke humane primære dermale fibroblaster for studiet av aortaaneurisme. Deretter gis en detaljert beskrivelse av en ny sammentrekningsmetode for å måle kontraktilresponsen til disse cellene, inkludert den påfølgende analysen og forslaget til sammenligning av forskjellige grupper. Denne metoden kan brukes til å studere sammentrekning av tilhengerceller i sammenheng med translasjonelle (kardiovaskulære) studier og pasient- og legemiddelscreeningsstudier.

For å teste reproduserbarheten til denne metoden ble metoden først validert bare ved hjelp av kontroll-SMB-er. For å fastslå reproduserbarhet for intereksperimental måling ble to uavhengige målinger av alle inkluderte kontroll- og pasientcellelinjer plottet inn som en Bland-Altman-tomt (figur 3B). Plottet viste at denne metoden ikke viser variasjon utenfor konfidensintervallet, bortsett fra en ytre cellelinje. Videre viste disse resultatene at to brønner som ble sådd i samme eksperim...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Denne artikkelen beskriver en utvisningskulturbasert metode for isolering og dyrking av primære, pasientspesifikke humane aorta glatte muskelceller og dermale fibroblaster. Videre presenteres en ny metode for måling av cellesammentrekning og påfølgende analyse, som kan brukes til å studere pasientspesifikke forskjeller i disse cellene.

Isolering av primære pasientspesifikke aorta glatte muskelceller og semikantative sanntidskontraksjonsmålinger i Vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

Denne metoden gjør det mulig for forskere å studere cellesammentrekningen av flere pasientcellelinjer samtidig. Det gjør at vi kan studere sykdommer raskere og mer effektivt. Denne teknikken lar oss kvantifisere cellesammentrekning i sanntid.Innen en time kan vi få sammentrekningsverdiene til dusinvis av celler. Vi demonstrerte for første gang at muskelcellekontraksjonen reduseres hos en gruppe pasienter med aortaaneurisme. Dette kan være en ny biomarkør eller mål for medisinsk terapi.Begynn med å sterilisere to par kirurgiske tang og en skalpell ved å nedsenke dem i 70% etanol og deretter tørke dem tørre. Deretter pipette to milliliter SMC medium i en Petri tallerken der vev disseksjonen vil bli utført. Neste pipette 2,5 milliliter SMC medium i to T-25 kolber.Virvle kolbeene rundt slik at det lille volumet av medium dekker hele overflaten. Visuelt inspisere biopsien, identifisere de tre aortalagene ved tilstedeværelse av aterosklerotiske plakk på intima-siden og slimete bindevev på adventitial side for å skille lagene. For å isolere SMB-er fra mediet, fjern de to andre lagene ved å plassere vevet med intima plakksiden opp først, fjern deretter den faste plakk ved å trekke den bort fra vevet med tang mens du skyver vevet ned med det andre par tang til det rosa ensartede mediallaget er synlig.Vend nå vevet og gjenta den samme prosedyren ved å trekke av det eventyrlige laget, og sørg for å fjerne alle synlige deler i så mange forsøk som nødvendig, da dette laget ikke vil løsne fra mediet lett. Når medielaget er isolert, kutt vevet i terninger ved å trykke mediet ned med tang og kutte vevet i en retning ved hjelp av skalpellen og lage rene enveiskutt for å minimere skade. Plasser 10 til 20 av disse vevstykkene i øvre del av T-25 flak ved hjelp av tang.Etter sterilisering av to par kirurgiske tang og en skalpell som beskrevet tidligere, pipette to milliliter fibroblast medium i en Petri-tallerken der vevspredningen skal utføres. Deretter pipette 2,5 milliliter fibroblast medium i to T-25 kolber og virvle kolber rundt slik at det lille volumet av medium dekker hele overflaten. Inspiser biopsien visuelt for å identifisere epidermis med en gjenkjennelig hudoverflate, noen ganger med synlig hår, og se deretter etter gult og slimete subkutant fett på motsatt side.Laget mellom epidermis og subkutant fett er dermis, kilden til levedyktige fibroblaster. For å isolere fibroblaster fra dermis, fjern de to andre lagene ved å plassere vevet på dermis-siden for å gjøre alle tre lagene synlige. Hold deretter vevet ned med tang og kutt bort hele epidermis i en ren linje uten å skade vevet.Vend nå vevet og gjenta den samme prosedyren ved å kutte innenfor dermis parallelt med grensen med det subkutane fettet. Når dermis er isolert, kutt vevet i terninger som presser vevet ned med tang og kutter vevet i en retning ved hjelp av skalpellen. Plasser deretter 10 til 20 av disse vevsstykkene i øvre del av T-25-kolben ved hjelp av tangene.Tell cellene ved hjelp av en automatisert celleteller og frø SMB-ene i triplikat med en såddtetthet på 30 000 celler per brønn i 200 mikroliter SMC-medium i den gelatinbelagte ECIS-platen. Plasser platen med SMB-ene i ECIS's 96-brønnsholder i cellekulturinkubatoren. Dobbeltklikk på ECIS Applied BioPhysics-programvaren for å åpne programmet og trykke på Setup-knappen.Kontroller om alle elektrodene har kontakt med holderen i det venstre nedre panelet merket Brønnkonfigurasjon. Hvis elektrodene ikke er riktig tilkoblet, justerer du platen i holderen før du starter målingen. Velg nå platetypen i samme panel ved å klikke matrisetype.Deretter forbereder du to pipetter satt til to mikroliter og 150 mikrolitervolum. Før du starter stimuleringen, trykker du på i programvaren og legger inn en kommentar. For å stimulere cellene, fjern lokket og legg det på en steril overflate inne i inkubatoren.Induser deretter SMC-sammentrekning ved å pipettere to mikroliter av ionomycinarbeidsløsningen inn i hver enkelt brønn så raskt som mulig. Når alle cellene er stimulert, bland mediet i brønnene ved hjelp av den andre pipetten. For å bestemme reproduserbarhet for intereksperimental måling ble to uavhengige målinger av alle inkluderte kontroll- og pasientcellelinjer plottet inn som et Bland-Altman-plott, noe som viste at denne metoden ikke viste variasjon utenfor konfidensintervallet, bortsett fra en ytre cellelinje.To brønner sådd med samme eksperiment og stimulert samtidig viste praktisk talt samme kontraktsmessige responskurve. For å validere om den viste responsen var en sammentrekning og ikke osmotisk stress på grunn av ionomycinstimulering, ble mediet erstattet etter stimulering og oppførselen til cellene ble registrert, noe som viste at de stimulerte cellene begynte å spre seg over elektroden igjen. Den kontraktile responsen i SMB-er avledet fra sunne, ikke-utvidede aortas viste en median respons på 61%sammenlignet med median respons på 52% fra abdominale aortaaneurismepasienter.Kontrollgruppens gjennomsnittlige kontraktile respons ble brukt til å identifisere fire pasienter som hadde lavere sammentrekningsverdier enn de normale verdiene. Den vestlige blotanalysen og påfølgende kvantifisering bekreftet at cellene uttrykker SMC-markører. For å bestemme den proliferative kapasiteten til SMC, ble qPCR utført for Ki67.Ki67-uttrykket var detekterbart i alle celler, men korrelerte ikke med kontraktilutgangen. Når du stimulerer cellene til sammentrekning, husk å ikke røre for mange brønner samtidig og prøvde å pipet så fort som mulig. Denne prosedyren kan trenge litt øvelse.Ved hjelp av denne metoden har vi delt pasientene basert på deres sammentrekning og for å senke normal kontrakt som tillot oss å undersøke disse pasientene og koblingene til deres kliniske egenskaper som røyking.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rat Nedsatt Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolering av lungearterien glatte muskelceller fra Neonatal Mus

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Real Time Målinger av Membrane Protein: Receptor Interaksjoner Bruke Surface plasmonresonans (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering av Murine Coronary vaskulære glatte muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Skade: En Effektiv<em&gt; In vivo</em&gt; Modell av jevn spredning av muskelceller og endotelfunksjon

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolering og kultur av primær aorta endothelial celler fra miniatyr griser

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

Måle spredning av vaskulær glatte muskelceller ved hjelp av Klikk kjemi

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolering av mus interstitial ventilceller for å studere forkalkning av aortaventilen in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...