Name: isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro
Uploaded: 2022-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

Мы хотели бы с благодарностью поблагодарить Тару ван Мерриенбоер, Альберта ван Вейка, Йоланду ван дер Фельден, Яна Д. Бланкенштейна, Лана Трана, Питера Л. Хордейка, команду PAREL-AAA и всех сосудистых хирургов Амстердамского UMC, Zaans Medisch Centrum и больницы Dijklander за предоставление материалов и поддержку для этого исследования.

ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия аорты была получена во время открытого восстановления аневризмы в медицинских центрах Амстердамского университета, Университетском медицинском центре VU, Амстердаме, Zaans Medisch Centrum, больнице Zaandam and Dijklander, Хорн, Нидерланды. Контрольная ткань аорты была получена из куск...

<ol>
	<li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections:+focus+on+smooth+muscle+cell+contractile+dysfunction.">Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).</li><li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+smooth+muscle+cell+force+generation+as+a+driver+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections.">Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).</li><li>Groeneveld, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaglycan+(TGFBR3)+up-regulation+correlates+with+increased+TGF-&#946;+signaling+in+Marfan+patient+fibroblasts+in+vitro.">Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-&#946; signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).</li><li>Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-smooth+muscle+actin+expression+enhances+cell+traction+force.">Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).</li><li>Peyton, S. R., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+governs+smooth+muscle+cell+motility+in+a+biphasic+fashion.">Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion.</a> Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).</li><li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2.">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+(nucleotide+oligomerization+domain-like+receptor+family,+pyrin+domain+containing+3)-caspase-1+inflammasome+degrades+contractile+proteins:+implications+for+aortic+biomechanical+dysfunction+and+aneurysm+and+dissection+formation.">NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).</li><li>Bogunovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+smooth+muscle+cell+contractility+as+a+novel+concept+of+abdominal+aortic+aneurysm+pathophysiology.">Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).</li><li>Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangement+of+adherens+junctions+by+transforming+growth+factor-&#946;1:+role+of+contraction.">Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-&#946;1: role of contraction.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).</li><li>Hu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+ECIS+and+LAPS+for+establishing+a+cardiomyocyte-based+biosensor.">Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).</li><li>Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+cellular+impedance+assays:+bringing+cardiotoxicity+screening+to+the+front+line.">Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line.</a> Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).</li><li>Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-stimulated+cyclic+guanosine+monophosphate+inhibits+vascular+smooth+muscle+cell+migration+by+inhibiting+Ca/calmodulin-dependent+protein+kinase+II.">Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).</li><li>Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor+of+activated+T+cells+5+regulates+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation.">Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).</li><li>Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin+induces+a+quiescent+phenotype+and+inhibits+migration+in+vascular+smooth+muscle+cells+in+vitro.">Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro.</a> Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).</li><li>Burger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+and+functional+assessment+of+smooth+muscle+like-cells+with+pathogenic+variants+in+aneurysm+genes+ACTA2,+MYH11,+SMAD3+and+FBN1.">Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1.</a> Human Molecular Genetics. , (2021).</li><li>Yeung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+human+dermal+fibroblasts+to+smooth+muscle-like+cells+to+study+the+effect+of+MYH11+and+ACTA2+mutations+in+aortic+aneurysms.">Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms.</a> Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).</li></ol>

В данной работе представлен метод измерения сокращения SMC in vitro, основанный на изменениях импеданса и занятия поверхности. Во-первых, описывается выделение, культивирование и расширение специфических для пациента первичных человеческих SMC и фибробластов кожи, а затем то, как испол?...

Гладкомышечные клетки (SMC) являются преобладающим типом клеток в медиальном слое аорты, самом толстом слое аорты. Внутри стенки они радиально ориентированы и участвуют, среди прочих функций, в сужении сосудов и вазодилатации1. Сократительный механизм SMC участвует в передаче силы в аорте через функциональную связь с внеклеточным матриксом2. Мутации в генах, кодирующих белки сократительного аппарата SMC, такие как тяжелая цепь гладкого миозина (MYH11) и актин гладких мышц (ACTA2), были связаны со случаями семейных аневризм грудной аорты, подчеркивая актуальность сокращения SMC в поддержании структурной и функциональной целостности аорты 1,2 . Кроме того, мутации в сигнальном пути TGFβ также связаны с аневризмами аорты, и их влияние в патофизиологии аневризмы аорты также может быть изучено в фибробластах кожи3.
Высокопроизводительное измерение сокращения SMC in vitro является сложной задачей. Поскольку сократимость SMC не может быть измерена in vivo у людей, анализы in vitro на клетках человека представляют собой возможную альтернативу. Более того, развитие аневризмы брюшной аорты (ААА) на животных моделях либо химически индуцируется, например, перфузией эластазы, либо вызвано специфической мутацией. Таким образом, данные животных не сопоставимы с развитием ААА у людей, которое в основном имеет многофакторную причину, такую как курение, возраст и / или атеросклероз. In vitro Сократимость SMC до сих пор в основном измерялась с помощью микроскопии силы тяги 4,5, количественной оценки флуоресцентных внутриклеточных потоков кальцияFura-2 6 и анализов сморщивания коллагена7. В то время как тракционная микроскопия дает бесценное числовое представление о силах, генерируемых одной клеткой, она не подходит для высокопроизводительного скрининга из-за сложной математической обработки данных и анализа одной клетки за раз, что означает, что измерение репрезентативного количества клеток на одного донора занимает очень много времени. Анализы красителя Fura-2 и сморщивания коллагена позволяют поверхностно определять сокращение и не дают точного численного результата, что делает их менее подходящими для распознавания специфических для пациента различий. Нарушение сокращения SMC в клетках, полученных из аорты пациентов с аневризмой брюшной аорты, было впервые продемонстрировано путем оптимизации нового метода измерения сокращения SMC in vitro8. Это было сделано путем перепрофилирования метода измерения импеданса электрической ячейки-подложки (ECIS). ECIS - это анализ средней пропускной способности в режиме реального времени для количественной оценки поведения и сокращения клеток адгезивныхклеток 9,10,11, таких как рост и поведение SMC в анализах заживления ран и миграции 12,13,14. Точный метод описан в разделе протокола. Таким оптимизированным способом ECIS также может быть использован для изучения сокращения фибробластов из-за их одинакового размера и морфологии.
Целью данной работы является пошаговое описание метода измерения сокращения SMC in vitro с использованием ECIS8 и сравнение сокращения между контролем и SMC пациента. Во-первых, объясняется выделение и культивирование первичных SMC от контрольных и пациентских биопсий аорты, которые могут быть использованы для измерения сокращения. Во-вторых, описаны измерения и анализ сокращения, наряду с проверкой экспрессии маркера SMC. Кроме того, в данной работе описан метод выделения специфических для пациента дермальных фибробластов, сокращение которых может быть измерено с использованием той же методологии. Эти клетки могут быть использованы для специфических для пациента исследований, ориентированных на аневризму аорты или другие сердечно-сосудистые патологии15 или прогностических исследований с использованием протокола трансдифференциации, который позволяет измерять сокращение до операции аневризмы16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Array</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>96W10idf PET</td>
			<td>Array used to measure contraction in the ECIS setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol</td>
			<td>Dr. Franz H&#246;hler Chemie GmbH</td>
			<td>RVG 12801</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solution used to dilute ionomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Addition to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Medium used to culture skin fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly &#39;&#39;Medium 231&#39;&#39;)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>M231500</td>
			<td>Medium used to culture smooth muscle cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen countess II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>Compound used for contraction stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>B230561</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics used for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospathe buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td>Kit used for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S00725</td>
			<td>Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11754250</td>
			<td>Kit used for cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td>Reagent for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZTheta</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>ZTheta</td>
			<td>ECIS instrument used for contraction measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro

Гладкомышечные клетки (SMC) являются преобладающим типом клеток в аортальных средах. Их сократительный механизм важен для передачи силы в аорте и регулирует сужение сосудов и расширение сосудов. Мутации в генах, кодирующих белки сократительного аппарата SMC, связаны с заболеваниями аорты, такими как аневризмы грудной аорты. Измерение сокращения SMC in vitro является сложной задачей, особенно с высокой пропускной способностью, которая необходима для скрининга материала пациента. Доступные в настоящее время методы не подходят для этой цели. В данной работе представлен новый метод, основанный на электрическом датчике импеданса ячейки-подложки (ECIS). Во-первых, описан протокол эксплантата для выделения специфических для пациента первичных SMC человека из биопсии аорты и специфических для пациента первичных дермальных фибробластов человека для изучения аневризм аорты. Далее дается подробное описание нового метода сокращения для измерения сократительного ответа этих клеток, включая последующий анализ и предложение для сравнения различных групп. Этот метод может быть использован для изучения сокращения адгезивных клеток в контексте трансляционных (сердечно-сосудистых) исследований и исследований скрининга пациентов и лекарств.

Чтобы проверить воспроизводимость этого метода, метод был сначала проверен с использованием только контрольных SMC. Для определения воспроизводимости межэкспериментальных измерений два независимых измерения всех включенных контрольных и пациентских клеточных линий были построены в...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

В данной работе описывается метод выделения и культивирования первичных, специфичных для пациента гладкомышечных клеток аорты человека и дермальных фибробластов. Кроме того, представлен новый метод измерения сокращения клеток и последующего анализа, который может быть использован для изучения специфических для пациента различий в этих клетках.

Выделение первичных клеток гладкой мускулатуры аорты, специфичных для пациента, и полуколичественные измерения сокращения в режиме реального времени in vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

Этот метод позволяет исследователям изучать клеточное сокращение нескольких клеточных линий пациента одновременно. Это позволяет нам изучать болезни быстрее и эффективнее. Этот метод позволяет нам количественно оценивать сокращение клеток в режиме реального времени.В течение часа мы можем получить значения сокращения десятков клеток. Мы впервые продемонстрировали, что сокращение мышечных клеток уменьшается в группе пациентов с аневризмами аорты. Это может быть новый биомаркер или мишень для медикаментозной терапии.Начните со стерилизации двух пар хирургических щипцов и скальпеля, погружая их в 70% этанол и впоследствии вытирая их насухо. Затем пипетку двумя миллилитрами среды SMC в чашку Петри, в которой будет выполнено рассечение тканей. Далее пипетка 2,5 миллилитра среды SMC в две колбы Т-25.Закрутите колбы вокруг так, чтобы небольшой объем среды покрывал всю поверхность. Визуально осмотрите биопсию, выявив три слоя аорты по наличию атеросклеротических бляшек на стороне интимы и слизистой соединительной ткани на адвентициальной стороне, чтобы различить слои. Чтобы изолировать SMC от среды, удалите два других слоя, сначала поместив ткань с интимной бляшкой вверх, затем удалите твердую бляшку, оттягивая ее от ткани щипцами, одновременно толкая ткань вниз второй парой щипцов, пока не будет виден розовый однородный медиальный слой.Теперь переверните ткань и повторите ту же процедуру, стянув адвентивный слой, обязательно удалив все видимые части за столько попыток, сколько необходимо, так как этот слой не будет легко отделяться от среды. После того, как слой среды изолирован, разрежьте ткань на кубики, прижав среду щипцами и разрезав ткань в одном направлении с помощью скальпеля, делая чистые однонаправленные разрезы, чтобы свести к минимуму повреждение. Поместите от 10 до 20 из этих кусочков ткани в верхнюю четверть зенитки Т-25 с помощью щипцов.После стерилизации двух пар хирургических щипцов и скальпеля, как описано ранее, пипетка двумя миллилитрами фибробластной среды в чашку Петри, в которой будет выполнено рассечение тканей. Затем пипетку 2,5 миллилитра фибробластной среды в две колбы Т-25 и закрутите колбы вокруг так, чтобы небольшой объем среды покрыл всю поверхность. Визуально осмотрите биопсию на предмет выявления эпидермиса с узнаваемой поверхностью кожи, иногда с видимыми волосами, затем ищите желтый и слизистый подкожный жир на противоположной стороне.Слоем между эпидермисом и подкожно-жировой клетчаткой является дерма, источник жизнеспособных фибробластов. Чтобы изолировать фибробласты из дермы, удалите два других слоя, поместив ткань на сторону дермы, чтобы сделать все три слоя видимыми. Затем зажмите ткань щипцами и отрежьте весь эпидермис одной чистой линией, не повредив ткань.Теперь переверните ткань и повторите ту же процедуру, разрезав внутри дермы параллельную границе с подкожно-жировой клетчаткой. После того, как дерма выделена, разрежьте ткань на кубики, прижимая ткань щипцами и разрезая ткань в одном направлении с помощью скальпеля. Затем поместите от 10 до 20 таких кусочков ткани в верхнюю четверть колбы Т-25 с помощью щипцов.Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика клеток и засейте SMC в трипликат при плотности посева 30 000 клеток на лунку в 200 микролитрах среды SMC в желатиновой пластине ECIS. Поместите пластину с SMC в 96-луночный держатель ECIS в инкубаторе клеточных культур. Дважды щелкните программное обеспечение ECIS Applied BioPhysics, чтобы открыть программу, и нажмите кнопку Setup.Проверьте, все ли электроды имеют контакт с держателем в левой нижней панели с маркировкой Well Configuration. Если электроды не подключены должным образом, отрегулируйте пластину в держателе перед началом измерения. Теперь выберите тип пластины на той же панели, щелкнув Тип массива.Далее подготовьте две пипетки, установленные на два микролитра и объем 150 микролитров. Перед началом стимуляции нажмите Mark в программном обеспечении и поместите комментарий. Чтобы стимулировать клетки, снимите крышку и поместите ее на стерильную поверхность внутри инкубатора.Затем индуцируют сокращение SMC путем пипетирования двух микролитров рабочего раствора иономицина в каждую лунку как можно быстрее. После того, как все клетки будут стимулированы, смешайте среду в лунках, используя вторую пипетку. Для определения воспроизводимости межэкспериментальных измерений два независимых измерения всех включенных контрольных и пациентских клеточных линий были построены в виде графика Блэнда-Альтмана, демонстрируя, что этот метод не показал изменчивости за пределами доверительного интервала, за исключением одной выделяющейся клеточной линии.Две скважины, засеянные одним и тем же экспериментом и стимулируемые одновременно, показали практически одинаковую контрактную кривую отклика. Для проверки того, был ли показанный ответ сокращением, а не осмотическим стрессом из-за стимуляции иономицином, среда была заменена после стимуляции и было записано поведение клеток, что показало, что стимулированные клетки снова начали распространяться по электроду. Сократительный ответ в SMC, полученный из здоровой, недилатационной аорты, показал медианный ответ 61% по сравнению со средним ответом 52% у пациентов с аневризмой брюшной аорты.Средний сократительный ответ контрольной группы был использован для выявления четырех пациентов, которые имели более низкие значения сокращения, чем нормальные значения. Анализ вестерн-блоттинга и последующая количественная оценка подтвердили, что клетки экспрессируют маркеры SMC. Для определения пролиферативной способности SMC для Ki67 была выполнена qPCR.Экспрессия Ki67 обнаруживалась во всех клетках, но не коррелировала с сократительным выходом. Стимулируя клетки к сокращению, помните, чтобы не пипетировать слишком много лунок одновременно и старались пипетировать как можно быстрее. Эта процедура может потребовать некоторой практики.Используя этот метод, мы разделили пациентов на основе их сокращения и снижения нормального сокращения, что позволило нам исследовать этих пациентов и связи с их клиническими характеристиками, такими как курение.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Изоляция по правам артерии пуповины гладкомышечных клеток (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Выделение легочной артерии гладкомышечных клеток у новорожденных мышей

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

В режиме реального времени измерения мембранного белка: рецептор взаимодействий с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Выделение мышиной коронарных сосудов клетках гладкой мускулатуры

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Повреждение дрожь в аритмии: эффективный<em&gt; В Виво</em&gt; Модель гладкой мышечной клеточной пролиферации и эндотелиальной функции

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Изоляция и культура первичных аортальных эндотелиальных клеток от миниатюрных свиней

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

Измерение распространения сосудистых гладких мышечных клеток с помощью нажмите химии

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Выделение клеток интерстициального клапана мыши для изучения кальцификации аортального клапана in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...