Name: isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro
Uploaded: 2022-02-15T13:30:00
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Nos gustaría agradecer a Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, el equipo PAREL-AAA y todos los cirujanos vasculares de la UMC de Ámsterdam, Zaans Medisch Centrum y el hospital Dijklander por proporcionar materiales y apoyo para este estudio.

NOTA: Las biopsias aórticas se obtuvieron durante la reparación de aneurismas abiertos en los Centros Médicos de la Universidad de Ámsterdam, el Centro Médico de la Universidad VU, Ámsterdam, zaans Medisch Centrum, el hospital Zaandam y Dijklander, Hoorn, Países Bajos. El tejido aórtico de control se obtuvo a partir de la pieza de la aorta unida a la arteria renal cosechada para trasplantes renales. Solo se incluyeron pacientes mayores de 18 años, y todos los pacientes dieron su consentimiento informado para par...

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	<li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections:+focus+on+smooth+muscle+cell+contractile+dysfunction.">Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).</li><li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+smooth+muscle+cell+force+generation+as+a+driver+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections.">Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).</li><li>Groeneveld, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-stimulated+cyclic+guanosine+monophosphate+inhibits+vascular+smooth+muscle+cell+migration+by+inhibiting+Ca/calmodulin-dependent+protein+kinase+II.">Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).</li><li>Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor+of+activated+T+cells+5+regulates+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation.">Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).</li><li>Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin+induces+a+quiescent+phenotype+and+inhibits+migration+in+vascular+smooth+muscle+cells+in+vitro.">Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro.</a> Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).</li><li>Burger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+and+functional+assessment+of+smooth+muscle+like-cells+with+pathogenic+variants+in+aneurysm+genes+ACTA2,+MYH11,+SMAD3+and+FBN1.">Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1.</a> Human Molecular Genetics. , (2021).</li><li>Yeung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+human+dermal+fibroblasts+to+smooth+muscle-like+cells+to+study+the+effect+of+MYH11+and+ACTA2+mutations+in+aortic+aneurysms.">Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms.</a> Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).</li></ol>

Este artículo presenta un método para medir la contracción de SMC in vitro, basado en los cambios en la impedancia y la ocupación de la superficie. Primero, se describe el aislamiento, el cultivo y la expansión de los SMC humanos primarios específicos del paciente y los fibroblastos de la piel, seguidos de cómo usarlos para las mediciones de contracción. 
Una limitación del estudio está relacionada con la obtención de las células a través de un protocolo de explante. Las ...

Las células del músculo liso (SMC) son el tipo de célula predominante en la capa medial aórtica, la capa más gruesa de la aorta. Dentro de la pared, están orientados radialmente y están implicados, entre otras funciones, en la vasoconstricción y vasodilatación1. La maquinaria contráctil SMC está implicada en la transmisión de la fuerza en la aorta a través del enlace funcional con la matriz extracelular2. Las mutaciones en genes que codifican para las proteínas del aparato contráctil SMC, como la cadena pesada de miosina del músculo liso (MYH11) y la actina del músculo liso (ACTA2), se han relacionado con casos de aneurismas aórticos torácicos familiares, lo que subraya la relevancia de la contracción SMC en el mantenimiento de la integridad estructural y funcional de la aorta 1,2 . Además, las mutaciones en la vía de señalización TGFβ también se asocian con aneurismas aórticos, y sus efectos en la fisiopatología del aneurisma aórtico también se pueden estudiar en fibroblastos cutáneos3.
La medición de alto rendimiento de la contracción de SMC in vitro es un desafío. Como la contractilidad de SMC no se puede medir in vivo en humanos, los ensayos in vitro en células humanas presentan una alternativa factible. Además, el desarrollo del aneurisma aórtico abdominal (AAA) en modelos animales es inducido químicamente por, por ejemplo, la perfusión de elastasa o causado por una mutación específica. Por lo tanto, los datos en animales no son comparables al desarrollo de AAA en humanos, que en su mayoría tiene una causa multifactorial, como fumar, la edad y / o la aterosclerosis. In vitro Hasta ahora, la contractilidad de SMC se ha medido principalmente mediante microscopía de fuerza de tracción 4,5, cuantificación de flujos de calcio intracelulares de fluorescencia Fura-26 y ensayos de arrugas de colágeno7. Si bien la microscopía de fuerza de tracción proporciona una visión numérica invaluable de las fuerzas generadas por una sola célula, no es adecuada para la detección de alto rendimiento debido al complejo procesamiento matemático de datos y el análisis de una célula a la vez, lo que significa que lleva mucho tiempo medir un número representativo de células por donante. Los ensayos de colorante Fura-2 y arrugas de colágeno permiten la determinación superficial de la contracción y no dan una salida numérica precisa, lo que los hace menos adecuados para discriminar las diferencias específicas del paciente. La alteración de la contracción de SMC en células derivadas de la aorta de pacientes con aneurisma aórtico abdominal se demostró por primera vez mediante la optimización de un nuevo método para medir la contracción de SMC in vitro8. Esto se hizo reutilizando el método de detección de impedancia célula-sustrato eléctrico (ECIS). ECIS es un ensayo en tiempo real de rendimiento medio para la cuantificación del comportamiento y la contracción de las células adherentes 9,10,11, como el crecimiento y el comportamiento de SMC en ensayos de cicatrización de heridas y migración 12,13,14. El método exacto se describe en la sección de protocolo. De esta manera optimizada, el ECIS también se puede utilizar para estudiar la contracción de los fibroblastos debido a su tamaño y morfología similares.
El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción gradual del método para medir la contracción de SMC in vitro utilizando ECIS8 y comparar la contracción entre los SMC de control y pacientes. En primer lugar, se explica el aislamiento y el cultivo de los SMC primarios a partir de biopsias de control y aórticas de pacientes, que pueden utilizarse para la medición de la contracción. En segundo lugar, se describen las mediciones y el análisis de la contracción, junto con la verificación de la expresión del marcador SMC. Además, en este trabajo se describe el método para el aislamiento de fibroblastos dérmicos específicos del paciente cuya contracción puede medirse utilizando la misma metodología. Estas células pueden ser utilizadas para estudios específicos del paciente centrados en el aneurisma aórtico u otras patologías cardiovasculares15 o estudios pronósticos utilizando un protocolo de transdiferenciación que permite la medición de la contracción antes de la cirugía de aneurisma16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Array</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>96W10idf PET</td>
			<td>Array used to measure contraction in the ECIS setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol</td>
			<td>Dr. Franz H&#246;hler Chemie GmbH</td>
			<td>RVG 12801</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solution used to dilute ionomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Addition to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Medium used to culture skin fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly &#39;&#39;Medium 231&#39;&#39;)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>M231500</td>
			<td>Medium used to culture smooth muscle cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen countess II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>Compound used for contraction stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>B230561</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics used for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospathe buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td>Kit used for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S00725</td>
			<td>Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11754250</td>
			<td>Kit used for cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td>Reagent for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZTheta</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>ZTheta</td>
			<td>ECIS instrument used for contraction measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro

Las células del músculo liso (SMC) son el tipo de célula predominante en los medios aórticos. Su maquinaria contráctil es importante para la transmisión de la fuerza en la aorta y regula la vasoconstricción y la vasodilatación. Las mutaciones en los genes que codifican para las proteínas del aparato contráctil SMC están asociadas con enfermedades aórticas, como los aneurismas de la aorta torácica. Medir la contracción de SMC in vitro es un desafío, especialmente de una manera de alto rendimiento, que es esencial para la detección de material del paciente. Los métodos actualmente disponibles no son adecuados para este propósito. Este artículo presenta un nuevo método basado en la detección de impedancia célula-sustrato eléctrico (ECIS). En primer lugar, se describe un protocolo de explante para aislar las SMC primarias humanas específicas del paciente a partir de biopsias aórticas y fibroblastos dérmicos primarios humanos específicos del paciente para el estudio de los aneurismas aórticos. A continuación, se da una descripción detallada de un nuevo método de contracción para medir la respuesta contráctil de estas células, incluido el análisis posterior y la sugerencia para comparar diferentes grupos. Este método se puede utilizar para estudiar la contracción de las células adherentes en el contexto de estudios traslacionales (cardiovasculares) y estudios de detección de pacientes y fármacos.

Para probar la reproducibilidad de este método, el método se validó primero utilizando SMC de control solamente. Para determinar la reproducibilidad de la medición interexperimental, se trazaron dos mediciones independientes de todas las líneas celulares de control y pacientes incluidas como una gráfica de Bland-Altman (Figura 3B). La gráfica demostró que este método no muestra variabilidad fuera del intervalo de confianza, a excepción de una línea celular atípica. Además, estos...

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Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Este artículo describe un método basado en el cultivo de explantes para el aislamiento y cultivo de células primarias del músculo liso aórtico humano específico del paciente y fibroblastos dérmicos. Además, se presenta un nuevo método para medir la contracción celular y el análisis posterior, que se puede utilizar para estudiar las diferencias específicas del paciente en estas células.

Aislamiento de células primarias del músculo liso aórtico específicas del paciente y mediciones semicuantitativas de contracción en tiempo real in vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

Este método permite a los investigadores estudiar la contracción celular de múltiples líneas celulares de pacientes simultáneamente. Nos permite estudiar las enfermedades de manera más rápida y eficiente. Esta técnica nos permite cuantificar la contracción celular en tiempo real.En una hora, podemos obtener los valores de contracción de docenas de células. Demostramos por primera vez que la contracción de las células musculares está disminuida en un grupo de pacientes con aneurismas aórticos. Esto puede ser un nuevo biomarcador o objetivo para la terapia médica.Comience esterilizando dos pares de pinzas quirúrgicas y un bisturí sumergiéndolas en etanol al 70% y posteriormente secándolas. A continuación, pipetee dos mililitros de medio SMC en una placa de Petri en la que se realizará la disección del tejido. A continuación pipete 2,5 mililitros de medio SMC en dos matraces T-25.Gire los matraces alrededor para que el pequeño volumen de medio cubra toda la superficie. Inspeccione visualmente la biopsia, identificando las tres capas aórticas por la presencia de placas ateroscleróticas en el lado íntimo y tejido conectivo viscoso en el lado adventicio para distinguir las capas. Para aislar las SMC de los medios, retire las otras dos capas colocando primero el tejido con placa íntima hacia arriba, luego retire la placa sólida alejándola del tejido con fórceps mientras empuja el tejido hacia abajo con el segundo par de fórceps hasta que la capa medial uniforme rosada sea visible.Ahora voltee el tejido y repita el mismo procedimiento sacando la capa adventicia, asegurándose de eliminar todas las partes visibles en tantos intentos como sea necesario, ya que esta capa no se desprenderá de los medios fácilmente. Una vez que la capa de medios esté aislada, corte el tejido en cubos presionando el medio hacia abajo con fórceps y cortando el tejido en una dirección usando el bisturí haciendo cortes unidireccionales limpios para minimizar el daño. Coloque de 10 a 20 de estas piezas de tejido en el cuarto superior de la escama T-25 usando fórceps.Después de esterilizar dos pares de pinzas quirúrgicas y un bisturí como se describió anteriormente, pipetee dos mililitros de medio fibroblasto en una placa de Petri en la que se realizará la disección de tejidos. Luego pipetee 2.5 mililitros de medio de fibroblastos en dos matraces T-25 y gire los matraces alrededor para que el pequeño volumen de medio cubra toda la superficie. Inspeccione visualmente la biopsia para identificar la epidermis con una superficie de piel reconocible, a veces con vello visible, luego busque grasa subcutánea amarilla y viscosa en el lado opuesto.La capa entre la epidermis y la grasa subcutánea es la dermis, la fuente de fibroblastos viables. Para aislar los fibroblastos de la dermis, retire las otras dos capas colocando el tejido en el lado de la dermis para que las tres capas sean visibles. Luego sostenga el tejido con fórceps y corte toda la epidermis en una línea limpia sin dañar el tejido.Ahora voltee el tejido y repita el mismo procedimiento cortando dentro de la dermis paralela al borde con la grasa subcutánea. Una vez que la dermis está aislada, corte el tejido en cubos presionando el tejido hacia abajo con fórceps y cortando el tejido en una dirección usando el bisturí. Luego coloque de 10 a 20 de estas piezas de tejido en el cuarto superior del matraz T-25 usando las pinzas.Cuente las células utilizando un contador celular automatizado y siembre los SMC por triplicado a una densidad de siembra de 30, 000 células por pozo en 200 microlitros de medio SMC en la placa ECIS recubierta de gelatina. Coloque la placa con los SMC en el soporte de 96 pocillos del ECIS en la incubadora de cultivo celular. Haga doble clic en el software ECIS Applied BioPhysics para abrir el programa y pulse el botón Configuración.Compruebe si todos los electrodos tienen contacto con el soporte en el panel inferior izquierdo etiquetado como Configuración de pozo. Si los electrodos no están conectados correctamente, ajuste la placa en el soporte antes de comenzar la medición. Ahora seleccione el tipo de placa en el mismo panel haciendo clic en Tipo de matriz.A continuación, prepare dos pipetas colocadas a dos microlitros y 150 microlitros de volumen. Antes de iniciar la estimulación, presione Marcar en el software y coloque un comentario. Para estimular las células, retire la tapa y colóquela sobre una superficie estéril dentro de la incubadora.Luego induzca la contracción de SMC pipeteando dos microlitros de la solución de trabajo de ionomicina en cada pozo lo más rápido posible. Una vez que todas las células hayan sido estimuladas, mezcle el medio en los pocillos usando la segunda pipeta. Para determinar la reproducibilidad de la medición interexperimental, se trazaron dos mediciones independientes de todas las líneas celulares de control y paciente incluidas como una gráfica de Bland-Altman, lo que demuestra que este método no mostró variabilidad fuera del intervalo de confianza, a excepción de una línea celular atípica.Dos pozos sembrados con el mismo experimento y estimulados simultáneamente mostraron prácticamente la misma curva de respuesta contractual. Para validar si la respuesta mostrada fue una contracción y no estrés osmótico debido a la estimulación con ionomicina, el medio se reemplazó después de la estimulación y se registró el comportamiento de las células, lo que mostró que las células estimuladas comenzaron a extenderse sobre el electrodo nuevamente. La respuesta contráctil en SMC derivada de aortas sanas y no dilatadas mostró una respuesta mediana del 61% en comparación con la respuesta mediana del 52% de los pacientes con aneurisma aórtico abdominal.La respuesta contráctil media del grupo control se utilizó para identificar a cuatro pacientes que tenían valores de contracción más bajos que los valores normales. El análisis de Western blot y la posterior cuantificación confirmaron que las células expresan marcadores SMC. Para determinar la capacidad proliferativa del SMC, se realizó qPCR para Ki67.La expresión de Ki67 fue detectable en todas las células, pero no se correlacionó con la salida contráctil. Al estimular las células para la contracción, recuerde no pipetear demasiados pozos al mismo tiempo y trate de pipetear lo más rápido posible. Este procedimiento puede necesitar algo de práctica.Utilizando este método, hemos dividido a los pacientes en función de su contracción y para reducir la contracción normal, lo que nos permitió investigar a estos pacientes y los vínculos con sus características clínicas, como el tabaquismo.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

El aislamiento de los Derechos Humanos de la arteria umbilical células musculares lisas (HUASMC)

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Investigación

Biología

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

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Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

El aislamiento de la arteria pulmonar células musculares lisas de los ratones recién nacidos

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Mediciones en tiempo real de proteínas de membrana: Receptor interacciones utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

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Lesión por aplastamiento aórtico murino: una eficacia<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de proliferación de células musculares lisas y función endotelial

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Aislamiento y cultivo de células endoteliales aórticas primarias de cerdos en miniatura

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Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

Medición de la proliferación de células musculares lisas vasculares mediante la química de clics

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Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

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Aislamiento De Células De La Válvula Intersticial De Ratón Para Estudiar La Calcificación De La Válvula Aórtica In Vitro

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