Name: isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro
Uploaded: 2022-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

Vi vill tacksamt tacka Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, PAREL-AAA-teamet och alla kärlkirurger i Amsterdam UMC, Zaans Medisch Centrum och Dijklander sjukhus för att tillhandahålla material och stöd för denna studie.

OBS: Aortabiopsier erhölls under öppen aneurysmreparation i Amsterdam University Medical Centers, VU University Medical Center, Amsterdam, Zaans Medisch Centrum, Zaandam och Dijklander sjukhus, Hoorn, Nederländerna. Kontroll aortavävnad erhölls från den bit av aortan fäst vid njurartären som skördades för njurtransplantationer. Endast patienter över 18 år inkluderades, och alla patienter gav sitt informerade samtycke till att delta i studien. Allt material samlades in i enlighet med bestämmelserna i WMA-dekl...

<ol>
	<li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections:+focus+on+smooth+muscle+cell+contractile+dysfunction.">Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).</li><li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+smooth+muscle+cell+force+generation+as+a+driver+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections.">Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).</li><li>Groeneveld, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaglycan+(TGFBR3)+up-regulation+correlates+with+increased+TGF-&#946;+signaling+in+Marfan+patient+fibroblasts+in+vitro.">Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-&#946; signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).</li><li>Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-smooth+muscle+actin+expression+enhances+cell+traction+force.">Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).</li><li>Peyton, S. R., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+governs+smooth+muscle+cell+motility+in+a+biphasic+fashion.">Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion.</a> Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).</li><li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2.">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+(nucleotide+oligomerization+domain-like+receptor+family,+pyrin+domain+containing+3)-caspase-1+inflammasome+degrades+contractile+proteins:+implications+for+aortic+biomechanical+dysfunction+and+aneurysm+and+dissection+formation.">NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).</li><li>Bogunovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+smooth+muscle+cell+contractility+as+a+novel+concept+of+abdominal+aortic+aneurysm+pathophysiology.">Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).</li><li>Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangement+of+adherens+junctions+by+transforming+growth+factor-&#946;1:+role+of+contraction.">Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-&#946;1: role of contraction.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).</li><li>Hu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+ECIS+and+LAPS+for+establishing+a+cardiomyocyte-based+biosensor.">Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).</li><li>Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+cellular+impedance+assays:+bringing+cardiotoxicity+screening+to+the+front+line.">Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line.</a> Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).</li><li>Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-stimulated+cyclic+guanosine+monophosphate+inhibits+vascular+smooth+muscle+cell+migration+by+inhibiting+Ca/calmodulin-dependent+protein+kinase+II.">Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).</li><li>Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor+of+activated+T+cells+5+regulates+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation.">Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).</li><li>Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin+induces+a+quiescent+phenotype+and+inhibits+migration+in+vascular+smooth+muscle+cells+in+vitro.">Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro.</a> Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).</li><li>Burger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+and+functional+assessment+of+smooth+muscle+like-cells+with+pathogenic+variants+in+aneurysm+genes+ACTA2,+MYH11,+SMAD3+and+FBN1.">Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1.</a> Human Molecular Genetics. , (2021).</li><li>Yeung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+human+dermal+fibroblasts+to+smooth+muscle-like+cells+to+study+the+effect+of+MYH11+and+ACTA2+mutations+in+aortic+aneurysms.">Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms.</a> Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).</li></ol>

Detta dokument presenterar en metod för att mäta SMC-sammandragning in vitro, baserat på förändringar i impedans och ytockupation. Först beskrivs isolering, odling och expansion av patientspecifika primära humana SMC och hudfibroblaster, följt av hur man använder dem för sammandragningsmätningar. 
En begränsning av studien är relaterad till att erhålla cellerna genom ett explantprotokoll. Cellerna som förökar sig från biopsin kan ha andra egenskaper än den ursprungli...

Glattmuskelceller (SMC) är den dominerande celltypen i aortamedialskiktet, det tjockaste lagret av aortan. Inom väggen är de radiellt orienterade och är involverade i bland annat vasokonstriktion och vasodilatation1. SMC-kontraktilmaskineriet är involverat i överföringen av kraft i aortan genom den funktionella länken med den extracellulära matrisen2. Mutationer i gener som kodar för proteinerna i SMC-kontraktilapparaten, såsom glattmuskel myosin tung kedja (MYH11) och glattmuskelaktin (ACTA2), har varit relaterade till fall av familjära thoraxaortaaneurysmer, vilket understryker relevansen av SMC-sammandragning för att upprätthålla den strukturella och funktionella integriteten hos aortan 1,2 . Vidare är mutationer i TGFβ-signalvägen också associerade med aortaaneurysmer, och deras effekter i aortaaneurysm patofysiologi kan också studeras i hudfibroblaster3.
Mätning med hög genomströmning av SMC-sammandragning in vitro är utmanande. Eftersom SMC-kontraktilitet inte kan mätas in vivo hos människor, utgör in vitro-analyser på mänskliga celler ett genomförbart alternativ. Dessutom är utvecklingen av bukaortaaneurysm (AAA) i djurmodeller antingen kemiskt inducerad av exempelvis elastasperfusion eller orsakad av en specifik mutation. Därför är djurdata inte jämförbara med AAA-utveckling hos människor, som oftast har en multifaktoriell orsak, såsom rökning, ålder och/eller ateroskleros. In vitro SMC-kontraktilitet har hittills huvudsakligen mätts med dragkraftsmikroskopi 4,5, kvantifiering av Fura-2 fluorescens intracellulära kalciumflöden6 och kollagenrynkningsanalyser7. Medan dragkraftsmikroskopi ger ovärderlig numerisk inblick i de krafter som genereras av en enda cell, är den inte lämplig för screening med hög genomströmning på grund av den komplexa matematiska databehandlingen och analysen av en cell i taget, vilket innebär att det är mycket tidskrävande att mäta ett representativt antal celler per givare. Fura-2-färgämnes- och kollagenrynkningsanalyser möjliggör ytlig bestämning av sammandragning och ger inte en exakt numerisk utgång, vilket gör dem mindre lämpliga för att diskriminera patientspecifika skillnader. Försämrad SMC-sammandragning i celler härledda från aorta hos patienter med bukaortaaneurysm demonstrerades för första gången genom att optimera en ny metod för att mäta SMC-sammandragning in vitro8. Detta gjordes genom att återanvända ECIS-metoden (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing). ECIS är en realtidsanalys med medelhög genomströmning för kvantifiering av vidhäftande cellbeteende och sammandragning 9,10,11 såsom SMC-tillväxt och beteende i sårläknings- och migrationsanalyser 12,13,14. Den exakta metoden beskrivs i protokollavsnittet. På detta optimerade sätt kan ECIS också användas för att studera fibroblastkontraktion på grund av deras liknande storlek och morfologi.
Syftet med denna uppsats är att ge en stegvis beskrivning av metoden för att mäta SMC-sammandragning in vitro med ECIS8 och jämföra sammandragningen mellan kontroll- och patient-SMC. Först förklaras isolering och odling av primära SMC från kontroll- och patientaortabiopsier, som kan användas för sammandragningsmätning. För det andra beskrivs sammandragningsmätningar och analyser, tillsammans med verifieringen av SMC-marköruttryck. Vidare beskriver denna uppsats metoden för isolering av patientspecifika dermala fibroblaster vars sammandragning kan mätas med samma metodik. Dessa celler kan användas för patientspecifika studier med fokus på aortaaneurysm eller andra kardiovaskulära patologier15 eller prognostiska studier med hjälp av ett transdifferentieringsprotokoll som möjliggör sammandragningsmätning före aneurysmkirurgi16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Array</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>96W10idf PET</td>
			<td>Array used to measure contraction in the ECIS setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol</td>
			<td>Dr. Franz H&#246;hler Chemie GmbH</td>
			<td>RVG 12801</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solution used to dilute ionomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Addition to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Medium used to culture skin fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly &#39;&#39;Medium 231&#39;&#39;)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>M231500</td>
			<td>Medium used to culture smooth muscle cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen countess II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>Compound used for contraction stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>B230561</td>
			<td>Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics used for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospathe buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td>Kit used for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S00725</td>
			<td>Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11754250</td>
			<td>Kit used for cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td>Reagent for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZTheta</td>
			<td>Applied Biophysics</td>
			<td>ZTheta</td>
			<td>ECIS instrument used for contraction measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary patient-specific aortic smooth muscle cells and semiquantitative real-time contraction measurements in vitro

Glattmuskelceller (SMC) är den dominerande celltypen i aortamediet. Deras kontraktila maskineri är viktigt för överföring av kraft i aortan och reglerar vasokonstriktion och vasodilatation. Mutationer i gener som kodar för SMC-kontraktila apparatproteiner är associerade med aortasjukdomar, såsom thoraxaortaaneurysmer. Att mäta SMC-sammandragning in vitro är utmanande, särskilt på ett sätt med hög genomströmning, vilket är viktigt för screening av patientmaterial. För närvarande tillgängliga metoder är inte lämpliga för detta ändamål. Detta dokument presenterar en ny metod baserad på elektrisk cell-substratimpedansavkänning (ECIS). Först beskrivs ett explantprotokoll för att isolera patientspecifika humana primära SMC från aortabiopsier och patientspecifika humana primära dermala fibroblaster för studier av aorta aneurysmer. Därefter ges en detaljerad beskrivning av en ny sammandragningsmetod för att mäta kontraktilresponsen hos dessa celler, inklusive efterföljande analys och förslag till jämförelse av olika grupper. Denna metod kan användas för att studera sammandragningen av vidhäftande celler i samband med translationella (kardiovaskulära) studier och patient- och läkemedelsscreeningstudier.

För att testa reproducerbarheten av denna metod validerades metoden först med hjälp av kontroll-SMC: er. För att bestämma interexperimentell mätreproducerbarhet plottades två oberoende mätningar av alla inkluderade kontroll- och patientcellinjer som ett Bland-Altman-diagram (figur 3B). Diagrammet visade att denna metod inte visar variabilitet utanför konfidensintervallet, förutom en avvikande cellinje. Vidare visade dessa resultat att två brunnar sådda inom samma experiment och s...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro at JoVE.com

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Denna uppsats beskriver en explantkulturbaserad metod för isolering och odling av primära, patientspecifika humana aorta glatta muskelceller och dermala fibroblaster. Vidare presenteras en ny metod för att mäta cellkontraktion och efterföljande analys, som kan användas för att studera patientspecifika skillnader i dessa celler.

Isolering av primära patientspecifika aorta glatta muskelceller och semikvantitiva realtidskontraktionsmätningar in vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

Denna metod gör det möjligt för forskare att studera cellkontraktionen av flera patientcellinjer samtidigt. Det gör att vi kan studera sjukdomar snabbare och mer effektivt. Denna teknik gör det möjligt för oss att kvantifiera cellkontraktion i realtid.Inom en timme kan vi få kontraktionsvärdena för dussintals celler. Vi visade för första gången att muskelcellskontraktionen minskar hos en grupp patienter med aorta-aneurysm. Detta kan vara en ny biomarkör eller mål för medicinsk behandling.Börja med att sterilisera två par kirurgiska pincett och en skalpell genom att nedsänka dem i 70% etanol och därefter torka dem torra. Pipettera sedan två milliliter SMC-medium i en petriskål där vävnadsdissektionen kommer att utföras. Nästa pipett 2,5 ml SMC-medium i två T-25-kolvar.Virvla kolvarna runt så att den lilla volymen medium täcker hela ytan. Inspektera biopsin visuellt och identifiera de tre aortaskikten genom närvaron av aterosklerotiska plack på intima sidan och slemmig bindväv på en adventitial sida för att skilja skikten. För att isolera SMC från mediet, ta bort de andra två skikten genom att placera vävnaden med intima placksidan uppåt först och ta sedan bort den fasta placken genom att dra bort den från vävnaden med pincett medan du trycker ner vävnaden med det andra paret pincett tills det rosa enhetliga mediala skiktet är synligt.Vänd nu vävnaden och upprepa samma procedur genom att dra av det oavsiktliga skiktet, var noga med att ta bort alla synliga delar i så många försök som behövs eftersom detta lager inte lätt kommer att lossna från media. När medieskiktet är isolerat, skär vävnaden i kuber genom att trycka ner mediet med pincett och skära vävnaden i en riktning med skalpellen som gör rena enkelriktade snitt för att minimera skadorna. Placera 10 till 20 av dessa vävnadsstycken i den övre fjärdedelen av T-25-flaken med pincett.Efter sterilisering av två par kirurgiska pincett och en skalpell som beskrivits tidigare, pipettera två milliliter fibroblastmedium i en petriskål där vävnadsdissektionen kommer att utföras. Pipettera sedan 2,5 ml fibroblastmedium i två T-25-kolvar och virvla kolvarna runt så att den lilla volymen medium täcker hela ytan. Inspektera biopsin visuellt för att identifiera epidermis med en igenkännlig hudyta, ibland med synligt hår, leta sedan efter gult och slemmigt subkutant fett på motsatt sida.Skiktet mellan epidermis och det subkutana fettet är dermis, källan till livskraftiga fibroblaster. För att isolera fibroblaster från dermis, ta bort de andra två skikten genom att placera vävnaden på dermissidan för att göra alla tre skikten synliga. Håll sedan ner vävnaden med pincett och skär bort hela överhuden i en ren linje utan att skada vävnaden.Vänd nu vävnaden och upprepa samma procedur genom att skära inom dermis parallellt med gränsen till det subkutana fettet. När dermis är isolerad, skär vävnaden i kuber som pressar vävnaden ner med pincett och skär vävnaden i en riktning med skalpellen. Placera sedan 10 till 20 av dessa vävnadsstycken i den övre fjärdedelen av T-25-kolven med hjälp av tången.Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare och frö SMC: erna i tre exemplar vid en sådddensitet på 30 000 celler per brunn i 200 mikroliter SMC-medium i den gelatinbelagda ECIS-plattan. Placera plattan med SMC i ECIS: s 96-brunnshållare i cellodlingsinkubatorn. Dubbelklicka på ECIS Applied BioPhysics-programvaran för att öppna programmet och tryck på Setup-knappen.Kontrollera om alla elektroder har kontakt med hållaren i den vänstra nedre panelen märkt Well Configuration. Om elektroderna inte är ordentligt anslutna, justera plattan i hållaren innan du börjar mätningen. Välj nu platttypen i samma panel genom att klicka på Array-typ.Förbered sedan två pipetter inställda på två mikroliter och 150 mikroliter volym. Innan du börjar stimuleringen, tryck på Mark i programvaran och lägg en kommentar. För att stimulera cellerna, ta bort locket och placera det på en steril yta inuti inkubatorn.Inducera sedan SMC-sammandragning genom att pipettera två mikroliter av jonomycinarbetslösningen i varje brunn så snabbt som möjligt. När alla celler har stimulerats, blanda mediet i brunnarna med den andra pipetten. För att bestämma interexperimentell mätreproducerbarhet plottades två oberoende mätningar av alla inkluderade kontroll- och patientcellinjer som ett Bland-Altman-diagram, vilket visade att denna metod inte visade variabilitet utanför konfidensintervallet, förutom en avvikande cellinje.Två brunnar sådda med samma experiment och stimulerade samtidigt visade praktiskt taget samma kontraktuella svarskurva. För att validera om det visade svaret var en sammandragning och inte osmotisk stress på grund av jonomycinstimulering, ersattes mediet efter stimulering och cellernas beteende registrerades, vilket visade att de stimulerade cellerna började sprida sig över elektroden igen. Kontraktilsvaret hos SMC som härrör från friska, icke-dilaterade aortor visade ett mediansvar på 61 % jämfört med mediansvaret på 52 % från patienter med abdominal aorta aneurysm.Kontrollgruppens genomsnittliga kontraktila svar användes för att identifiera fyra patienter som hade lägre kontraktionsvärden än de normala värdena. Western blot-analysen och efterföljande kvantifiering bekräftade att cellerna uttrycker SMC-markörer. För att bestämma SMC: s proliferativa kapacitet utfördes qPCR för Ki67.Ki67-uttrycket var detekterbart i alla celler, men korrelerade inte med kontraktilutgången. När du stimulerar cellerna för sammandragning, kom ihåg att inte pipettera för många brunnar samtidigt och försökte pipettera så snabbt som möjligt. Denna procedur kan behöva lite övning.Med hjälp av denna metod har vi delat upp patienterna baserat på deras sammandragning och för att sänka normal kontraktering vilket gjorde det möjligt för oss att undersöka dessa patienter och kopplingarna till deras kliniska egenskaper som rökning.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolering av mänskliga Umbilical arteriella glatta muskelceller (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolering av lungartären glatta muskelceller från neonatala möss

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Realtid Mätningar av membranprotein: Receptor interaktioner Använda Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering av murin Coronary vaskulära glatta muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Skada: En Effektiv<em&gt; In vivo</em&gt; Modell för smidig muskelcellspridning och endotelfunktion

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolering och kultur av primära aortic endotelceller från miniatyr svin

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

Mäta spridningen av vaskulära glatta muskelceller med hjälp av Klicka kemi

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolering av musinterstitiella ventilceller för att studera förkalkningen av aortaventilen in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...