Name: generation of an orthotopic xenograft of pancreatic cancer cells by ultrasound-guided injection
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Orthotopic Xenograft of Pancreatic Cancer Cells by Ultrasound-Guided Injection at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, מענק מס '15627, IG 21510, ו- IG 19766) ל- AA, PRIN משרד האוניברסיטה והמחקר האיטלקי (MIUR). מינוף ידע בסיסי ברשת תעלות יונים בסרטן לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות (LIONESS) 20174TB8KW ל- AA, pHioniC: מענק Horizon 2020 של האיחוד האירופי ללא 813834 ל- AA. CD נתמך על ידי מלגת AIRC עבור איטליה ID 24020.

הפרוטוקול הנוכחי קיבל אישור ממשרד הבריאות האיטלקי עם אישור מספר 843/2020-PR. על מנת להבטיח תנאים אספטיים, בעלי החיים הוחזקו בתוך חדר המחסום של חיות המחקר vivarium (Ce.S.A.L.) של אוניברסיטת פירנצה. כל ההליכים בוצעו באותו חלל שבו שוכנו העכברים במתקן LIGeMA של אוניברסיטת פירנצה (איטליה).
1. ה?...

<ol>
	<li>Zeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoresistance+in+pancreatic+cancer.">Chemoresistance in pancreatic cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4504 (2019).</li><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Rahib, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projecting+cancer+incidence+and+deaths+to+2030:+The+unexpected+burden+of+thyroid,+liver,+and+pancreas+cancers+in+the+united+states.">Projecting cancer incidence and deaths to 2030: The unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the united states.</a> Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).</li><li>Rawla, P., Sunkara, T., Gaduputi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+pancreatic+cancer:+Global+trends,+etiology+and+risk+factors.">Epidemiology of pancreatic cancer: Global trends, etiology and risk factors.</a> World Journal of Oncology. 10 (1), 10 (2019).</li><li>Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+pancreatic+cancer.">Mouse models of pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).</li><li>Hofschroer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+orchestrate+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+progression+and+therapy.">Ion channels orchestrate pancreatic ductal adenocarcinoma progression and therapy.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 586599 (2021).</li><li>Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma:+Current+and+evolving+therapies.">Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).</li><li>Qiu, W., Su, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+orthotopic+pancreatic+tumor+mouse+models.">Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).</li><li>Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+models+are+necessary+to+predict+therapy+of+transplantable+tumors+in+mice.">Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice.</a> Cancer Metastasis Reviews. 17 (3), 279-284 (1998).</li><li>Qiu, W., Su, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advances+in+mouse+modeling+for+human+pancreatic+tumorigenesis+and+metastasis.">Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 32 (1-2), 83-107 (2013).</li><li>Erstad, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+and+heterotopic+murine+models+of+pancreatic+cancer+and+their+different+responses+to+FOLFIRINOX+chemotherapy.">Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).</li><li>Lottini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-ultrasound,+non-linear+contrast+mode+with+microbubbles+and+Optical+Flow+software+tool:+together+for+a+new+translational+method+in+the+study+of+the+tumoral+rheology+microenvironment.">Micro-ultrasound, non-linear contrast mode with microbubbles and Optical Flow software tool: together for a new translational method in the study of the tumoral rheology microenvironment.</a> WMIC 2017: Imaging the Future from Molecules to Medicine. , (2017).</li><li>Ludders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+guidelines+for+using+isoflurane.">Advantages and guidelines for using isoflurane.</a> The Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice. 22 (2), 328-331 (1992).</li><li>Huynh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+orthotopic+human+pancreatic+cancer+xenograft+model+using+ultrasound+guided+injection+of+cells.">Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound guided injection of cells.</a> PLoS One. 6 (5), 20330 (2011).</li><li>Duranti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+hERG1/&#946;1+Integrin+Complex+via+a+Novel+Bispecific+Single-chain+Antibody:+An+Effective+Strategy+against+Solid+Cancers.">Harnessing the hERG1/&#946;1 Integrin Complex via a Novel Bispecific Single-chain Antibody: An Effective Strategy against Solid Cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 20 (8), 1338-1349 (2021).</li></ol>

למרות שהשימוש בהדמיית US נפוץ במרפאה, התפתחות גידולים במודלים פרה-קליניים רבים של עכברים מתוארת בדרך כלל באמצעות הדמיה ביולומינסנטית11. זו האחרונה היא דרך עקיפה להעריך את השתלת הגידול והרחבתו והיא גם אינה מספקת קינטיקה אמינה לגידול גידול. במחקר הנוכחי יישמנו הדמיית US לביצוע ה?...

PCa, וצורתו הנפוצה ביותר, קרצינומה אדנו דוקטלית לבלב (PDAC), היא אחת הסיבות הנפוצות ביותר למוות הקשור לסרטן עם שיעור הישרדות של שנה אחת נמוך מ -20% ושיעור הישרדות של 5 שנים של 8%, ללא קשר לשלב 1,2. המחלה כמעט תמיד קטלנית, ושכיחותה צפויה לגדול ברציפות בשנים הקרובות, בניגוד לסוגי סרטן אחרים, ששכיחותם יורדת3. גורמים כגון גילוי מאוחר של סרטן, הנטייה להתקדמות מהירה והיעדר טיפולים ספציפיים מובילים לפרוגנוזה גרועה שלPCa 4. התקדמות רבה בחקר הסרטן הושגה, הודות לפיתוח מודלים מדויקים יותר של עכברים פרה-קליניים. המודלים סיפקו תובנות מתאימות להבנת המנגנון המולקולרי העומד בבסיס הסרטן ולפיתוח טיפולים חדשים5. התקדמות זו חלה בצורה גרועה על PCa, אשר, למרות מאמצים רבים לאחרונה, נשאר עמיד לטיפולים כימותרפיים הנוכחי1. מסיבות אלה, פיתוח גישות חדשניות לשיפור סיכויי המטופלים הוא חובה.
במהלך השנים פותחו דגמים רבים של עכברי PCa, כולל xenografts, שהם הדגמים הנפוצים ביותר כיום5. מודלים של Xenograft מסווגים כהטרוטופיים תת עוריים ואורתוטופיים, בהתאם למיקום תאי הגידול המושתלים. קסנוגראפטים הטרוטופיים תת-עוריים קלים וזולים יותר להשגה, אך מפספסים תכונות אופייניות מסוימות של PCa (כלומר, המיקרו-סביבה המוזרה של הגידול, המאופיינת בהצטברות של רקמה פיברוטית, היפוקסיה, חומציות ואנגיוגנזה)6,7. זה מסביר מדוע קסנוגרפטים תת-עוריים לעתים קרובות אינם מצליחים לספק נתונים חזקים לטיפולים טיפוליים המובילים לכישלונות כאשר הם מתורגמים לסביבה הקלינית8. מאידך גיסא, קסנוגרפטים אורתוטופיים דומים יותר למיקרו-סביבה של הגידול, מה שמוביל לחיקוי טוב יותר של ההתפתחות הטבעית של המחלה. בנוסף, קסנוגרפטים אורתוטופיים מתאימים יותר לחקר התהליך הגרורתי והתכונות הפולשניות של PCa, שכמעט אינן מתרחשות במודלים תת עוריים9. באופן כללי, מודלים של עכברי xenograft אורתוטופיים עדיפים כיום לבצע בדיקות פרה-קליניות של תרופות 9,10. קסנוגרפטים אורתוטופיים מסתמכים בדרך כלל על הליכים כירורגיים כדי להשתיל תאים או חתיכות רקמת גידול קטנות מאוד בלבלב. ואכן, כמה מאמרים המבוססים על מודלים כירורגיים של PCa פורסמו בעשורים האחרונים11. עם זאת, האיכות והתוצאה של ההליך הכירורגי להקמת מודל גידול אורתוטופי תלויים מאוד במיומנות הטכנית של המפעיל. נקודת מפתח נוספת עבור אורתוטופית מוצלחת PCa xenograft עבור גישה קלינית תרגומית היא האפשרות להקים מחלה מקומית עם קינטיקה צמיחה צפויה.
כדי להתמודד עם בעיות אלה, כאן אנו מתארים הליך חדשני לייצור PCa xenograft אורתוטופי, תוך ניצול הזרקה מונחית אולטרסאונד (US) של תאי PCa אנושיים לזנב הלבלב בעכברים מדוכאי חיסון. הליך זה יוצר מודל עכבר PCa אמין. הגידול מלווה ב-in vivo על ידי הדמיית US.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>P5856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-Mode package</td>
			<td>Visualsonics Fujifilm, Italy</td>
			<td></td>
			<td>Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel</td>
			<td>PARKER LABORATORIES, INC.</td>
			<td>150</td>
			<td>Gel for ultrasound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic Mice (Nude-Foxn1nu)</td>
			<td>ENVIGO, Italy</td>
			<td>69</td>
			<td>20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator Function Line</td>
			<td>Heraeus Instruments, Germany</td>
			<td>BB16-ICN2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature</td>
			<td>Visualsonics Fujifilm, Italy</td>
			<td>11426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Euroclone Spa, Italy</td>
			<td>ECM0101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td>Euroclone Spa, Italy</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf (1.5mL)</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Euroclone Spa, Italy</td>
			<td>ECS0170L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge</td>
			<td>Permax S.r.l., Italy</td>
			<td>7803-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Syringe 705RM 50 &#181;L</td>
			<td>Permax S.r.l., Italy</td>
			<td>7637-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflo (250 mL)</td>
			<td>Ecuphar</td>
			<td>7081219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100X</td>
			<td>Euroclone Spa, Italy</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Handling table II</td>
			<td>Visualsonics Fujifilm, Italy</td>
			<td>50249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX550D: 55 MHz MX Series Transducer</td>
			<td>Visualsonics Fujifilm, Italy</td>
			<td>51069</td>
			<td>Ultrasound Transducers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen/isofluorane mixer</td>
			<td>Angelo Franceschini S.r.l.</td>
			<td>LFY-I-5A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC1 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), USA</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl (carprofen)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>11319</td>
			<td>20 mL, injection solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X in PBS</td>
			<td>Euroclone Spa, Italy</td>
			<td>ECB3052D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet ointment for eyes, Systane nighttime</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>509/28555-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)</td>
			<td>Visualsonics Fujifilm, Italy</td>
			<td>VS-12055</td>
			<td>complete with gas chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station 2</td>
			<td>Visualsonics Fujifilm, Italy</td>
			<td>VS-11983</td>
			<td>Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Lab</td>
			<td>Visualsonics Fujifilm, Italy</td>
			<td>VS-20034</td>
			<td>Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System</td>
			<td>Visualsonics Fujifilm, Italy</td>
			<td>VS-20054</td>
			<td>Includes analytic software package for B-mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Photoacoustic Enclosure</td>
			<td>Visualsonics Fujifilm, Italy</td>
			<td>53157</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of an orthotopic xenograft of pancreatic cancer cells by ultrasound-guided injection

סרטן הלבלב (PCa) מייצג את אחד מסוגי הסרטן הקטלניים ביותר בעולם. הסיבות לממאירות PCa מסתמכות בעיקר על התנהגותה הממאירה הפנימית ועמידותה הגבוהה לטיפולים טיפוליים. ואכן, למרות מאמצים רבים, הן כימותרפיה סטנדרטית והן טיפולי מטרה חדשניים נכשלו באופן משמעותי כאשר הועברו מהערכה פרה-קלינית למסגרת הקלינית. בתרחיש זה, פיתוח מודלים של עכברים פרה-קליניים המחקים טוב יותר את מאפייני ה- in vivo של PCa נחוץ בדחיפות כדי לבדוק תרופות שפותחו לאחרונה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ליצירת מודל עכברי של PCa, המיוצג על ידי קסנוגרפט אורתוטופי המתקבל על ידי הזרקה מונחית אולטרסאונד של תאי גידול בלבלב אנושי. באמצעות פרוטוקול כה אמין וזעיר פולשני, אנו מספקים גם עדויות לחריטה in vivo והתפתחות של מסות גידול, אשר ניתן לנטר על ידי הדמיית אולטרסאונד (US). היבט ראוי לציון של מודל PCa המתואר כאן הוא התפתחות איטית של המוני הגידול לאורך זמן, המאפשר זיהוי מדויק של נקודת המוצא לטיפולים תרופתיים וניטור טוב יותר של ההשפעות של התערבויות טיפוליות. יתר על כן, הטכניקה המתוארת כאן היא דוגמה ליישום עקרונות 3Rs שכן היא ממזערת כאב וסבל ומשפרת באופן ישיר את רווחתם של בעלי חיים במחקר.

בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל, עכברים הורדמו תחילה בתא איזופלורן, והונחו על משטח החיה (איור 1A). הלבלב הודגם באמצעות דימות אולטרסאונד (איור 1B). מזרק המילטון 50 μL הועמס ב-1 x 106 תאי PANC1 שהיו תלויים ב-20 μL של PBS והונחו על מחזיק המחט (איור 1C). הזווית ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Orthotopic Xenograft of Pancreatic Cancer Cells by Ultrasound-Guided Injection at JoVE.com

Generation of an Orthotopic Xenograft of Pancreatic Cancer Cells by Ultrasound-Guided Injection

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מודל סרטן לבלב אורתוטופי זעיר פולשני על ידי הזרקה מונחית אולטרסאונד של תאי סרטן הלבלב האנושיים וניטור לאחר מכן של צמיחת הגידול in vivo על ידי הדמיית אולטרסאונד.

יצירת קסנוגראפט אורתוטופי של תאים סרטניים בלבלב על ידי הזרקה מונחית אולטרסאונד

Pancreatic cancer (PCa) represents one of the deadliest cancer types worldwide. The reasons for PCa malignancy mainly rely on its intrinsic malignant ...

הפרוטוקול מתאר שיטה ליצירת מודל עכברי אורתוטופי של סרטן הלבלב באמצעות מערכת המשלבת הזרקת תאים והערכת חריטה ופיתוח גידולים. טכניקה זו יש שכפול גדול, הוא פולשני מינימלי, מאפשר להתגבר על חסרונות רבים הנגרמים על ידי הליך כירורגי, ועומד בעקרונות 3Rs. ההזרקה מונחית ההד יכולה לשמש למודלים אורתוטופיים אחרים, כגון הזרקות בעץ המרה או מודלים של סרטן השד.השימוש בטכניקה כזו יכול להיות משולב עם השימוש במולקולות קטנות. התחל להכין 20 עכברים עירומים-Foxn-1nu אתימיים בני 8 שבועות להזרקה מונחית אולטרסאונד על ידי מתן טרמדול תוך צפק במינון של 5 מיליגרם לקילוגרם באמצעות מזרק שחפת עם מחט 27 מד. לאחר מכן, הפעל את התמונה ובחר עכבר, קטן, בטן"בתפריט היישום מלוח המתמרים.ודא שחלון ההדמיה במצב B, או מצב בהירות, מופיע ושהמערכת מוכנה לקבל נתוני B-Mode. עבור אל דפדפן המחקר כדי לבחור מחקר חדש" והקלד את שם המחקר והמידע, כגון תאריך המחקר. לאחר מכן, מלא את כל המידע הדרוש בשם הסדרה, כמו זן בעלי חיים, מזהה, תאריך לידה.לאחר הזנת המידע, הקש על סיום"כדי להכין את התוכנית להדמיה במצב B. הניחו את העכבר המרדים על צדו הימני על שולחן הטיפול המחומם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם חוטמו בתוך חרוט אף ומרחו טיפת משחה וטרינרית על עיני העכבר. לאחר מכן, השתמש בגאזה דביקה כדי להדביק את יד ימין, רגל ימין וזנב העכבר על רפידות האלקטרודה על פלטפורמת החיה.קצב הנשימה והאלקטרוקרדיוגרמה של העכבר נרשמים דרך רפידות האלקטרודות. לפני הזרקת העכבר עם תאי PANC1, לטהר את עור העכבר עם 70% אתנול ולשמור על העור של האגף השמאלי מתוח באמצעות גזה דבק. השתמש מזרק 20 מיליליטר ללא המחט כדי להחיל ג'ל אולטרסאונד על הבטן ואת האגף השמאלי של העכבר.בעזרת ידית בקרת הגובה של מתמר האולטרסאונד, הורידו את המתמר כדי לגעת באגף השמאלי של העכבר והניחו את המתמר באופן רוחבי לגוף החיה. לאחר מכן, הזז את המתמר כדי לדמיין את הלבלב בתצוגת המתמר באמצעות הדמיה במצב B. הכינו מזרק המילטון 50 מיקרוליטר, המכיל 10 מיליון תאי PANC1 המרחפים ב-20 מיקרוליטרים של PBS עם מחט מחוטא בקוטר 30 מ"מ והניחו את המזרק על המחזיק המתאים.באמצעות מיקרומניפולטור המחזיק, מורידים את המזרק לעור העכבר, כאשר המחט משופעת כלפי מעלה ובאותו מישור כמו מתמר האולטרסאונד, ויוצרים זווית של 45 מעלות עם המתמר. לנקב את העור עם micromanipulator ולהחדיר את מחט מזרק לתוך הלבלב תוך התבוננות בתמונת אולטרסאונד על התצוגה כדי לעקוב אחר המסלול. לאחר החדרת המחט ללבלב, הזריקו בולוס של 20 מיקרוליטר המכיל את התאים על ידי הפעלת לחץ מתמיד על הבוכנה של המזרק.הליך ההזרקה הנכון ניתן לבדוק על ידי נוכחות של בועה קטנה בלבלב ואת זרימת נוזל hypoechogenic. לאחר 5 עד 10 שניות של ההזרקה, להחזיר את המחט. לאחר מכן, הסר את מתמר האולטרסאונד ונקה את הג'ל מהאגף.בסיום, הניחו את העכבר לבדו בכלוב חדש תחת השגחה עד שהוא יחזור להכרה מספקת כדי לשמור על משענת עצם החזה. התמונה המייצגת מראה את נוכחותה של מסת גידול בזנב הלבלב לאחר הזרקת תאים מונחית הד, המאשרת את יכולת השכפול של הפרוטוקול. נפח הגידול של גידולי לבלב אורתוטופיים שמקורם בתאי PANC1 הוערך על ידי הדמיית אולטרסאונד פעם בשבוע, החל מיום 8 לאחר הזרקת התא.בנקודת הסיום של הניסוי ביום 43, נרכשו תמונות אולטרסאונד של המוני הגידול. בבדיקת נמק, מסת הגידול, נצפתה מנה קטנה של לבלב, טחול, קיבה וכבד בריאים. בנוסף, מסות הגידול הוצאו לניתוח היסטולוגי.חשוב למקם את העכבר על צדו הימני על השולחן, ואת העור חייב להיות מתוח כראוי כדי למנוע את הסיכון של תאים נשפך מן הלבלב. יישומים עתידיים של מודל סרטן הלבלב המתקבל על ידי הזרקה מונחית אולטרסאונד כוללים את המחקרים שמטרתם פיתוח טיפולים מתאימים או שילובי טיפול.

generation-an-orthotopic-xenograft-pancreatic-cancer-cells-ultrasound

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will survive longer than five years. In order to understand and mimic the microenvironment of pancreatic tumors, we utilized a murine orthotopic model of pancreatic cancer that allows non-invasive imaging of tumor progression in real time. Pancreatic cancer cells expressing green fluorescent protein (PANC-1 GFP) were suspended in basement membrane matrix, high concentration, (e.g., Matrigel HC) with serum-free media and then injected into the tail of the pancreas via laparotomy. The cell suspension in the high concentration basement membrane matrix becomes a gel-like substance once it reaches room temperature; therefore, it gels when it comes in contact with the pancreas, creating a seal at the injection site and preventing any cell leakage. Tumor growth and metastasis to other organs are monitored in live animals by using fluorescence. It is critical to use the appropriate filters for excitation and emission of GFP. The steps for the orthotopic implantation are detailed in this article so researchers can easily replicate the procedure in nude mice. The main steps of this protocol are preparation of the cell suspension, surgical implantation, and whole body fluorescent in vivo imaging. This orthotopic model is designed to investigate the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

דגם פלורסנט Orthotopic עכבר של סרטן הלבלב

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Endobronchial Ultrasound-guided Intratumoral Injection of Cisplatin for the Treatment of Isolated Mediastinal Recurrence of Lung Cancer

Isolated hilar and mediastinal recurrence (IMHR) following external beam radiation therapy (EBRT) in patients with lung cancer is common. These patients do not have many treatment options and are usually offered palliative chemotherapy or best supportive care. Endobronchial ultrasound (EBUS)-guided intratumoral injection of cisplatin (ITC) is a novel approach for these patients. The procedure is performed under conscious sedation. The lesion is located with a bronchoscopy using EBUS, and a 22-gauge EBUS needle is advanced through the working channel of the scope and locked in position. Under ultrasound guidance, the wall of the tracheobronchial tree is punctured and the needle is moved into the target lesion. The needle stylet is then removed and cisplatin (40 mg/40 mL) is injected into the lesion. One to two sites are treated per session. Details of the procedure are described in the protocol section of paper. At our center, 50 sites were treated in 36 patients (19 males, 17 females). The mean age of our cohort was 61.9 &#177;8.5 years. We performed final analyses on 35 patients and 41 sites. 24/35 (69%) had complete or partial response (responders), whereas 11/35 (31%) had stable or progressive disease (non-responders). Overall, survival in our group was 8 months (95% CI of 6-11 months), with patients who responded having significantly better survival than the ones who did not.

The management of isolated recurrent lung cancer in a previously-irradiated field is challenging. Here, we describe an endobronchial ultrasound (EBUS)-guided cisplatin injection for the management of patients with localized lung cancer recurrence in a previously-radiated field.

Endobronchial אולטראסאונד מונחה הזרקת intratumoral של ציספלטין לטיפול ישן Mediastinal הבודדה של סרטן הריאות

Isolated hilar and mediastinal recurrence (IMHR) following external beam radiation therapy (EBRT) in patients with lung cancer is common. These patients ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly its immune-components, is vital to the prognosis and prediction of treatment outcomes, especially those of immunotherapy. TME immune-components are composed of different subsets of tumor-infiltrating immune cells assessable by multi-color FACS. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is among the deadliest malignances lacking good treatment options, thus an urgent and unmet medical need. One important reason for its non-responsiveness to various therapies (chemo-, targeted, I/O) has been its abundant TME, consisting of fibroblasts and leukocytes that protect tumor cells from these therapies. Orthotopically implanted PDAC is believed to more accurately recapture the TME of human pancreatic cancers than conventional subcutaneous (SC) models.
Homograft tumors (KPC) are transplants of mouse spontaneous PDAC originating from genetically engineered KPC-mice (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). The primary tumor tissue is cut into small fragments (~2 mm3) and transplanted subcutaneously (SC) to the syngeneic recipients (C57BL/6, 7&#8211;9 weeks old). The homografts were then surgically orthotopically transplanted onto the pancreas of new C57BL/6 mice, along with SC-implantation, which reached tumor volumes of 300&#8211;1,000 mm3 by 17 days. Only tumors of 400&#8211;600 mm3 were harvested per approved autopsy procedure and cleaned to remove the adjacent non-tumor tissues. They were dissociated per protocol using a tissue dissociator into single-cell suspensions, followed by staining with designated panels of fluorescently-labeled antibodies for various markers of different immune cells (lymphoid, myeloid and NK, DCs). The stained samples were analyzed using multi-color FACS to determine numbers of immune cells of different lineages, as well as their relative percentage within tumors. The immune profiles of orthotopic tumors were then compared to those of SC tumors. The preliminary data demonstrated significantly elevated infiltrating TILs/TAMs in tumors over the pancreas, and higher B-cell infiltration into orthotopic rather than SC tumors.

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

The experimental procedure on the immunophenotyping of murine orthotopic PDAC homografts aims at profiling the tumor immuno-microenvironment. Tumors are orthotopically implanted via surgery. Tumors of 200&#8211;600 mm3 in size were harvested and dissociated to prepare single-cell suspensions, followed by multi-immune marker FACS analysis using different fluorescently-labeled antibodies.

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

הזרקת Orthotopic של תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב עכברים

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and basic cancer researches. Generations of PDX models in traditional host mice are time-consuming and only working for a small proportion of samples. Recently, zebrafish PDX (zPDX) has emerged as a unique host system, with the characteristics of small-scale and high efficiency. Here, we describe an optimized methodology for generating a dual fluorescence-labeled tumor xenograft model for comparative chemotherapy assessment in zPDX models. Tumor cells and fibroblasts were enriched from freshly-harvested or frozen pancreatic cancer tissue at different culture conditions. Both cell groups were labeled by lentivirus expressing green or red fluorescent proteins, as well as an anti-apoptosis gene BCL2L1. The transfected cells were pre-mixed and co-injected into the 2 dpf larval zebrafish that were then bred in modified E3 medium at 32 &#176;C. The xenograft models were treated by chemotherapy drugs and/or BCL2L1 inhibitor, and the viabilities of both tumor cells and fibroblasts were investigated simultaneously. In summary, this protocol allows researchers to quickly generate a large amount of zPDX models with a heterogeneous tumor microenvironment and provides a longer observation window and a more precise quantitation in assessing the efficiency of drug candidates.

This protocol describes optimization procedures in a virus-based dual fluorescence-labeled tumor xenograft model using larval zebrafish as hosts. This heterogeneous xenograft model mimics the tissue composition of pancreatic cancer microenvironment in vivo and serves as a more precise tool for assessing drug responses in personalized zPDX (zebrafish patient-derived xenograft) models.

מטופל-נגזר הטרוגנית מודל Xenograft של סרטן הלבלב באמצעות הזחלים Zebrafish כפונדקאים עבור הערכת סמים השוואתי

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more representative models to study human cancers in immunodeficient mice than traditional established human cell lines in vitro. Recently, orthotopically implanted patient-derived tumor xenograft (PDX) models in mice have been developed to better replicate features of patient tumors. A liver orthotopic xenograft mouse model is expected to be a useful cancer research platform, providing insights into tumor biology and drug therapy. However, liver orthotopic tumor implantation is generally complicated. Here we describe our protocols for the orthotopic implantation of patient-derived liver-metastatic uveal melanoma tumors. We cultured human liver metastatic uveal melanoma cell lines into immunodeficient mice. The protocols can result in consistently high technical success rates using either a surgical orthotopic implantation technique with chunks of patient-derived uveal melanoma tumor or a needle injection technique with cultured human cell line. We also describe protocols for CT scanning to detect interior liver tumors and for re-implantation techniques using cryopreserved tumors to achieve re-engraftment. Together, these protocols provide a better platform for liver orthotopic tumor mouse models of liver metastatic uveal melanoma in translational research.

Orthotopic human liver metastatic uveal melanoma xenograft mouse models were created using surgical orthotopic implantation techniques with patient-derived tumor chunk and needle injection techniques with cultured human uveal melanoma cell lines.

הדור של מלנומה האדם Uveal האנושי פלטפורמת Xהשתל בעכברים חיסוני

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

אולטרה סאונד-הדרכה אורתודפית של הלבלב מורלין אדנוקרצינומה

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer (PC). To address this deficiency, we describe a mouse model involving orthotopic implantation of PC followed by distal pancreatectomy and splenectomy. The model has been demonstrated to be safe and suitably flexible for the study of various therapeutic approaches in adjuvant and neo adjuvant settings.
In this model, a pancreatic tumor is first generated by implanting a mixture of human pancreatic cancer cells (luciferase-tagged AsPC-1) and human cancer associated pancreatic stellate cells into the distal pancreas of Balb/c athymic nude mice. After three weeks, the cancer is resected by re-laparotomy, distal pancreatectomy and splenectomy. In this model, bioluminescence imaging can be used to follow the progress of cancer development and effects of resection/treatments. Following resection, adjuvant therapy can be given. Alternatively, neoadjuvant treatment can be given prior to resection.
Representative data from 45 mice are presented. All mice underwent successful distal pancreatectomy/splenectomy with no issues of hemostasis. A macroscopic proximal pancreatic margin greater than 5 mm was achieved in 43 (96%) mice. The technical success rate of pancreatic resection was 100%, with 0% early mortality and morbidity. None of the animals died during the week after resection.
In summary, we describe a robust and reproducible technique for a surgical resection model of pancreatic cancer in mice which mimics the clinical scenario. The model may be useful for the testing of both adjuvant and neoadjuvant treatments.

In the clinical context, patients with localized pancreatic cancer will undergo pancreatectomy followed by adjuvant treatment. This protocol reported here aims to establish a safe and effective method of modelling this clinical scenario in nude mice, through orthotopic implantation of pancreatic cancer followed by distal pancreatectomy and splenectomy.

מודל עכבר כריתה אורתוטופי של סרטן הלבלב

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...