Name: automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل مشاريع صندوق العلوم النمساوي (FWF) P30214-N36 و P32307-B وصندوق فيينا للعلوم والتكنولوجيا (WWTF) LS13-030.

<ol>
	<li>McKinney, S. A., D&#233;clais, A. -. C., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+individual+holliday+junctions.">Structural dynamics of individual holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).</li><li>Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+potassium-channel+gating+revealed+by+single-molecule+FRET.">Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).</li><li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks.">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), 235 (2018).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).</li><li>Wu, P. G., Brand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonance+energy+transfer:+Methods+and+applications.">Resonance energy transfer: Methods and applications.</a> Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).</li><li>Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecular+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+measurement+on+structures+and+interactions+of+biomolecules.">Single-molecular f&#246;rster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules.</a> Micromachines. 12 (5), 492 (2021).</li><li>Malkusch, N., D&#246;rfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=smFRET+experiments+of+the+RNA+polymerase+II+transcription+initiation+complex.">smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex.</a> Methods. 120, 115-124 (2017).</li><li>Lee, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+views+of+MutS+on+mismatched+DNA.">Single-molecule views of MutS on mismatched DNA.</a> DNA repair. 20, 82-93 (2014).</li><li>Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microsecond+single-molecule+FRET+to+determine+the+assembly+pathways+of+T4+ssDNA+binding+protein+onto+model+DNA+replication+forks.">Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).</li><li>Deindl, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+conformational+dynamics+with+single-molecule+fluorescence+energy+transfer:+Applications+in+nucleosome+remodeling.">Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling.</a> Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).</li><li>Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+colocalization+FRET+evidence+that+spliceosome+activation+precedes+stable+approach+of+5'+splice+site+and+branch+site.">Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).</li><li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations.">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li><li>Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+kinesin+waits+between+steps.">How kinesin waits between steps.</a> Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).</li><li>G&#246;hring, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+analysis+of+T-cell+receptor-imposed+forces+via+quantitative+single+molecule+FRET+measurements.">Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements.</a> Nature Communications. 12 (1), 2502 (2021).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669 (2018).</li><li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-aided+molecule+sorting:+Analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li><li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells.">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).</li><li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules.">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).</li><li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation.">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li><li>Asher, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+imaging+of+GPCR+dimers+in+living+cells.">Single-molecule FRET imaging of GPCR dimers in living cells.</a> Nature Methods. 18 (4), 397-405 (2021).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy. (12), 1223-1237 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(excitation)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (excitation) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1189-1191 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(emission)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (emission) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1192-1194 (2012).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., van der Wel, C. M., Dimiduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft-matter/pims: PIMS v0.5. , (2020).</li><li>Anaconda Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Miniconda. , (2021).</li><li>conda-forge community. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The conda-forge project: community-based software distribution built on the conda package format and ecosystem. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> JupyterLab Contributors Notebooks - JupyterLab documentation. , (2021).</li><li>Babcock, H., Sigal, Y. M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-density+3D+localization+algorithm+for+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">A high-density 3D localization algorithm for stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Optical Nanoscopy. 1 (6), (2012).</li><li>Gao, Y., Kilfoil, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+detection+and+complete+tracking+of+large+populations+of+features+in+three+dimensions.">Accurate detection and complete tracking of large populations of features in three dimensions.</a> Optics Express. 17 (6), 4685 (2009).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> sdt-python: Python library for fluorescence microscopy data analysis (v17.1). , (2021).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nature Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li><li>Bradski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OpenCV+library.">The OpenCV library.</a> Dr. Dobb's Journal: Software Tools for the Professional Programmer. 25 (11), 120-123 (2000).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft-matter/trackpy:+Trackpy+v0.5.0.">Soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0.</a> Zenodo. , 4682814 (2021).</li><li>Killick, R., Fearnhead, P., Eckley, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+detection+of+changepoints+with+a+linear+computational+cost.">Optimal detection of changepoints with a linear computational cost.</a> Journal of the American Statistical Association. 107 (500), 1590-1598 (2012).</li><li>Schrangl, L., G&#246;hring, J., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+single+molecule+FRET+transitions+without+trajectories.">Kinetic analysis of single molecule FRET transitions without trajectories.</a> The Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123328 (2018).</li><li>Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+single-molecule+FRET+dynamics+with+probability+distribution+analysis.">Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis.</a> ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+analysis+software+(3.0).">Single-molecule FRET analysis software (3.0).</a> Zenodo. , (2021).</li><li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers.">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li><li>Platzer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unscrambling+fluorophore+blinking+for+comprehensive+cluster+detection+via+photoactivated+localization+microscopy.">Unscrambling fluorophore blinking for comprehensive cluster detection via photoactivated localization microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4993 (2020).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The molecular probes handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies. , (2010).</li><li>Szalai, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+energy+transfer+by+intensity-based+STED-FRET.">Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET.</a> Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+two-photon+probe+for+in+vivo+tracking+of+pH+during+a+traumatic+brain+injury+process.">A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process.</a> New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).</li></ol>

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

تفصل هذه المقالة خط أنابيب للتسجيلات الآلية والتحليل الكمي لبيانات smFRET الناشئة عن جزيئات المسبار المتنقلة والمربوطة بالسطح. وهو يكمل النهجين السائدين لتجارب smFRET ، التي تنطوي إما على مجسات مثبتة على السطح أو مجسات منتشرة في محلول داخل وخارج حجم الإثارة البؤرية17. يوفر كفاءة FRET الصحيحة والمواقع الجزيئية كدالة للوقت. وبالتالي يمكن استخدامه كمدخلات لبرامج التحليل المتخصصة، على سبيل المثال، لتحديد الحركيات الانتقالية 1 أو المدرج التكراري FRET39 أو الانتشار ثنائي الأبعاد22.
يتم إصدار البرنامج بموجب ترخيص مجاني ومفتوح المصدر معتمد من قبل مبادرة المصدر المفتوح التي تمنح المستخدم الحق الدائم في الاستخدام المجاني والتعديل وإعادة التوزيع. تم اختيار Github كمنصة تطوير وتوزيع لتسهيل الحصول على البرنامج والمشاركة في عملية التطوير قدر الإمكان من خلال الإبلاغ عن الأخطاء أو المساهمة برمز40. مكتوب في بايثون ، لا يعتمد البرنامج على مكونات خاصة. إن اختيار أجهزة الكمبيوتر المحمولة Jupyter كوجهات مستخدم يسهل فحص البيانات في كل خطوة تحليل ويسمح بتخصيص وتوسيع خط الأنابيب خصيصا للنظام التجريبي في متناول اليد. تعمل مكتبة sdt-python32 كأساس وتنفذ وظائف لتقييم بيانات الفحص المجهري الفلوري ، مثل توطين جزيء واحد ، وتحليل الانتشار ، وتحليل كثافة التألق ، وتسجيل قناة اللون ، وتحليل التوطين المشترك ، ومعالجة عائد الاستثمار.
من حيث المبدأ ، يمكن إجراء تتبع جسيم واحد في أنظمة أحادية أو ثنائية أو ثلاثية الأبعاد. هنا ، تم تصميم خط أنابيب تحليل الجزيء الواحد لدراسة أنظمة الهاتف المحمول 2D. يعكس هذا الاختيار توافر أنظمة بسيطة ، مثل الطبقات الثنائية للدهون المدعومة بالمستوي (SLBs) ، لتقديم مجسات الفلورسنت المتنقلة. تتكون أنظمة الطبقة الثنائية الدهنية هذه عادة من اثنين أو أكثر من الدهون الفوسفاتية ، حيث يحدد الكسر السائب المعلمات الفيزيائية الكيميائية الرئيسية ل SLB (مثل الطور واللزوجة) ، ويوفر الكسر الصغير مواقع التعلق للجزيئات الحيوية. يمكن أن تكون مواقع التعلق هذه فوسفوليبيدات بيوتينيل لمنصات البروتين القائمة على أفيدين أو ستريبتافيدين أو الدهون الفوسفاتية المترافقة مع النيكل NTA لمنصات البروتين مع علامات الهيستيدين41. يعتمد اختيار المنصة المناسبة لربط البروتينات ب SLB على السؤال العلمي. يمكن للقراء الرجوع إلى الأدبيات16،38،42 للحصول على أمثلة على الاستراتيجيات المستخدمة بنجاح. يجب أن تكون كثافة المجسات في العينة منخفضة بما فيه الكفاية لتجنب وظائف انتشار النقاط المتداخلة ؛ عادة ، يوصى بأقل من 0.1 جزيء لكل ميكرومتر 2 . انظر قسم النتائج التمثيلية (على وجه الخصوص ، الشكل 6) للحصول على مثال يوضح كثافة مسبار مناسبة. تنطبق طريقة التحليل أيضا على جزيئات البروتين المفردة ذات العلامات الفلورية المنتشرة في الغشاء البلازمي للخلايا الحية.
أحد الجوانب الحاسمة لتجارب smFRET هو إنتاج وتوصيف تحقيقات FRET نفسها. عند اختيار الفلوروفورات لزوج FRET ، يجب أن يتطابق نصف قطر Förster مع المسافات المتوقعة بين الأصباغ43. يفضل استخدام الأصباغ المقاومة للتبييض الضوئي لأنها تنتج آثارا طويلة الأمد. ومع ذلك ، بالنسبة لمعدلات التبييض المرتفعة ، يمكن استخدام نوع واحد من الفلوروفور للتعرف على الأحداث متعددة الباعث الناشئة عن جزيئات متمركزة عن طريق تحليل التبييض الضوئي التدريجي؛ راجع الخطوة 8.1.4 في قسم البروتوكول. يجب أن تكون أزواج الفلوروفور مرتبطة بشكل خاص بالموقع وساهميا بالجزيئات ذات الأهمية ، وتشكيل أزواج FRET داخل أو بين الجزيئات.
يمكن أن يؤدي الجمع بين smFRET والتقنيات الأخرى المتاحة بسهولة إلى زيادة استبانته المكانية إلى ما وراء حد الحيود (عبر STED44). تعمل خوارزمية تتبع smFRET المعروضة هنا على توسيع نطاق تطبيق النهج على الإعدادات التجريبية الجديدة وأنظمة النماذج. ويشمل ذلك دراسات (i) التغيرات الحركية في قياس الجزيئات الحيوية المتنقلة، (ii) الارتباط الديناميكي للجزيئات الحيوية المتنقلة، (iii) معدل التفاعلات الأنزيمية للتفاعلات المتفاعلة المنتشرة بحرية، و (iv) حركية التغيرات التوافقية للجزيئات الحيوية المتنقلة. يتطلب المثالان الأولان أنظمة نموذجية تظهر FRET بين الجزيئات ، أي أن المتبرع والمتقبل مقترنان بكيانات جزيئية حيوية منفصلة ذات أهمية. قد تستفيد الأمثلة الأخيرة من أجهزة الاستشعار الحيوية التي تحمل المتبرع والمتقبل داخل نفس الكيان الجزيئي (FRET داخل الجزيئات).
يمكن أن توفر المستشعرات القائمة على FRET داخل الجزيئية نظرة ثاقبة على التغيرات التوافقية الجوهرية للجزيئات الحيوية1،2،3،4 ، أو التغيرات التوافقية الناجمة عن حمل القوة الذاتية أو الخارجية (مستشعرات القوة الجزيئية16) ، أو تركيزات الأيونات في البيئة النانوية مثل الكالسيوم45 و pH46 . واعتمادا على النظام النموذجي ومنصة الإرساء المفضلة، يمكن تتبع أحداث smFRET هذه إما في 2D أو 3D: (i) يمكن استخدام التتبع المستوي لأحداث smFRET لتحديد كمية أوقات تفاعل المستقبلات مع الليغاند داخل غشاء البلازما، وارتباط سلاسل تضخيم الإشارة المرتبطة بالغشاء، وتغيرات قياس الستويشيومتري للمستقبلات السطحية؛ (ii) يمكن استخدام تتبع حجم أحداث smFRET لأي مجسات FRET داخل أو بين الجزيئات في الخلايا الحية أو في الأنظمة المعاد تشكيلها في المختبر .
تم تطوير طريقة تتبع smFRET بشكل رئيسي مع وضع مجسات FRET داخل الجزيئات في الاعتبار. تتميز هذه المجسات بعدد ثابت ومعروف من ملصقات الفلورسنت ، وهي حقيقة تم استغلالها لرفض البيانات من الجزيئات المتكتلة والمركبة بشكل غير صحيح (على سبيل المثال ، غير المصنفة بشكل كامل) ، وكذلك من المجسات التي تم فيها تبييض أحد الفلوروفورات ضوئيا. ومع ذلك ، من خلال ضبط خطوات التصفية ، يمكن أيضا تطبيق الطريقة على مجسات FRET بين الجزيئية. على سبيل المثال، بدلا من قبول الجزيئات التي تضم متبرعا واحدا وفلوروفور متقبلا واحدا فقط، يمكن للمرء أن يدرس المسارات المكانية للأصباغ المانحة والمتقبلة ويختار، على سبيل المثال، للمسارات المشتركة بين المتبرع والمتقبل.
نظرا لأن خوارزمية 3D-DAOSTORM لديها دعم لتحديد موقع الإشارة على طول المحور البصري عبر الاستجماتيزم بسبب عدسة أسطوانية في مسار شعاع الانبعاثات ، يمكن دمج تجارب 3D بسهولة في خط أنابيب التحليل. في هذه الحالة ، ستعمل إشارة المستقبل عند إثارة المتقبل على تحديد قياس stoichiometry والموقف المحوري. يمكن أيضا استخدام برنامج التحليل لتقييم البيانات من التجارب التي تتميز بتحقيقات مجمدة من خلال استخدام درجة كبيرة من الأتمتة ومخططات التصفية. في الواقع ، تم تحليل مجموعات بيانات كفاءة smFRET من تقاطعات هوليداي المجمدة على الطبقات الثنائية للطور الهلامي38 باستخدام إصدار مبكر من البرنامج.

كان نقل طاقة الرنين Förster (FRET) محركا رئيسيا في البحوث البيولوجية الجزيئية والبيوفيزيائية ، لأنه يسمح بالتحقيق في العمليات بدقة أقل من النانومتر. نظرا لأن كفاءة نقل الطاقة بين الفلوروفورات المانحة والمتقبلة تعتمد بشدة على المسافة بين الصبغات في نطاق ما دون النانومتر إلى النانومتر ، فقد تم استخدامه بفعالية كمسطرة طيفية لاستكشاف التشكيل الثابت والديناميكي للجزيئات الحيوية1،2،3،4. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام ظاهرة FRET على نطاق واسع لدراسات التوطين المشترك للبروتينات المرتبطة بالأغشية وداخل الخلايا على مستوى الجزء الأكبر5,6. وفي العقدين الماضيين، تم تكييف هذه الطريقة لرصد أحداث smFRET7، مما ساعد على زيادة الاستبانة الزمنية والمكانية بشكل كبير وحل حتى المجموعات الفرعية النادرة في عينات غير متجانسة. وبفضل هذه التقنيات، تم اكتساب رؤى فريدة في ديناميكيات الآلات الجزيئية مثل معدل معالجة النسخ لبوليميراز الحمض النووي الريبي II8، وسرعة تكرار بوليميراز الحمض النووي9،10، ومعدل نقل النيوكليوسوم11، وربط النسخ ومعدل توقف الوصلات المجمعة12، ونشاط المجموعات الفرعية الريبوسومية13، وسرعة المشي لمحركات كينسين14 ، على سبيل المثال لا الحصر. تم تحديد مدد التفاعل بين المستقبلات والرباط15 والقوى الجزيئية16 كميا.
تعتمد دراسات smFRET القائمة على الكثافة عادة على الانبعاثات الحساسة لقياس كفاءة FRET: يفصل مقسم الحزم في مسار الانبعاث مكانيا الضوء الناشئ عن الفلوروفورات المانحة والمتقبلة عند إثارة المتبرع ، مما يسمح بتحديد كمية كثافة التألق الفردية. يمكن حساب الكفاءة لاحقا على أنها جزء الفوتونات المنبعثة من المتقبل فيما يتعلق بإجمالي عدد الفوتونات17. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح إثارة المتقبل بعد إثارة المتبرع (ALEX) بقياس قياس stoichiometry لأحداث FRET ، مما يساعد في التمييز بين إشارات FRET المنخفضة الحقيقية من الإشارات الناشئة ، على سبيل المثال ، من المجسات التي تتميز بفلوروفور متقبل مبيض ضوئيا18.
عادة ما يتم إجراء تجارب FRET أحادية الجزيء بإحدى طريقتين. أولا ، يتم إضاءة منطقة صغيرة في حجم العينة باستخدام المجهر البؤري. يتم إثارة جزيئات المسبار الواحد في المحلول عندما يحدث انتشارها داخل الحجم البؤري. باستخدام هذه التقنية ، يمكن استخدام كاشفات عد الفوتونات السريعة ، مما يتيح دقة زمنية دون الميكروثانية. ثانيا، يتم تثبيت المجسات على وجه التحديد على الأسطح ومراقبتها عبر الفحص المجهري واسع النطاق، وغالبا ما تستخدم تكوين الانعكاس الداخلي الكلي (TIR) لتقليل تألق الخلفية. يسمح تجميد المسبار بأوقات تسجيل أطول بكثير من استخدام النهج الأول. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح مجال الرؤية الأكبر بمراقبة مجسات متعددة بالتوازي. الحاجة إلى كاميرا تجعل هذه الطريقة بطيئة مقارنة بالطريقة الموضحة أعلاه. تقتصر دقة الوقت على المللي ثانية إلى النطاق الثاني.
إذا كانت هناك حاجة إلى آثار طويلة الأمد ، على سبيل المثال ، لدراسة العمليات الديناميكية على مقياس زمني من مللي ثانية إلى ثانية ، فإن الطريقة الأولى غير قابلة للتطبيق ، لأن انفجارات التألق عادة ما تكون قصيرة جدا. يفشل النهج الثاني عندما يكون التجميد غير ممكن ، على سبيل المثال ، في تجارب الخلايا الحية التي تتميز بتحقيقات منتشرة داخل غشاء الخلية. وعلاوة على ذلك، لوحظ أن نظم النماذج البيولوجية يمكن أن تغير استجابتها بشكل كبير اعتمادا على حركة السطح الملامس16.
في حين تم إجراء تجارب تتبع smFRET والجسيمات المفردة المشتركة التي تسجل مجسات FRET المتنقلة في الماضي 19 ، لا توجد برامج متاحة للجمهور لتقييم البيانات. وقد دفع ذلك إلى تطوير منصة تحليل جديدة ، والتي تسمح بتحديد خصائص متعددة لمجسات الفلورسنت المتنقلة ، بما في ذلك كفاءة smFRET وقياس stoichiometry ، والمواقع ذات الدقة الفرعية للبكسل ، وكثافة التألق كوظائف للوقت. تم إنشاء طرق لتصفية الآثار الناتجة من خلال فحص سلوك التبييض التدريجي ، ومسافات أقرب جار ، وكثافة الانبعاثات ، وغيرها من السمات لاختيار جزيئات أحادية المسبار المركبة والوظيفية بشكل صحيح. يدعم البرنامج أيضا التقنيات التجريبية والتحليلية المتفق عليها مؤخرا في دراسة متعددة المختبرات لإنتاج بيانات smFRET كمية موثوقة17. على وجه الخصوص ، يلتزم التنفيذ بالإجراءات التي تم التحقق منها لحساب كفاءة FRET وقياس stoichiometry. يتم استخدام كثافة التألق عند إثارة المتبرع في معرف قناة الانبعاثات المانحة و IDA لقناة الانبعاثات المتقبلة لحساب كفاءة FRET الظاهرة Eapp باستخدام Eq (1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg"> (1)
بمساعدة شدة التألق في قناة انبعاث المستقبل عند إثارة المتقبل IAA ، يتم حساب قياس اللمعان الظاهر باستخدام Eq (2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg"> (2)
يمكن اشتقاق كفاءة FRET E و stoichiometry S من Eapp و Sapp من خلال النظر في أربعة عوامل تصحيح.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg">
يصف α تسرب الفلورة المانحة إلى قناة انبعاث المستقبل، ويمكن تحديده باستخدام عينة تحتوي فقط على الفلوروفورات المانحة أو عن طريق تحليل أجزاء من المسارات التي تم فيها تبييض المتقبل. δ يصحح الإثارة المباشرة للمتقبل من قبل مصدر ضوء الإثارة المانحة ويمكن قياسه باستخدام عينة مع الفلوروفورات المتقبلة فقط أو عن طريق تحليل أجزاء من المسارات حيث تم تبييض المتبرع.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg">.
γ مقاييس IDD لتصحيح كفاءات الكشف المتباينة في قنوات انبعاثات المانحين والمستقبلين والكفاءات الكمومية المختلفة للفلوروفورات. يمكن حساب العامل من خلال تحليل الزيادة في كثافة المانحين عند تبييض المتقبلين في مسارات ذات كفاءات FRET عالية20 أو من خلال دراسة عينة تضم حالات FRET منفصلة متعددة.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg">
β مقاييس IAA لتصحيح الكفاءات المتباينة لإثارة المتبرع والمتقبل. إذا تم تحديد γ من خلال تحليل تبييض المتقبلين، يمكن حساب β من عينة من نسبة المتبرع إلى المتقبلين المعروفة21. خلاف ذلك ، فإن عينة FRET متعددة الحالات تنتج أيضا β.
معا ، تسمح التصحيحات بحساب كفاءة FRET المصححة باستخدام Eq (3).
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg"> (3)
وقياس الستويشيومتري المصحح باستخدام Eq (4).
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg"> (4)
من الناحية المثالية ، فإن قياس stoichiometry المصحح لنسبة 1: 1 من المتبرع إلى المتقبل يعطي S = 0.5. ومن الناحية العملية، ينتج عن انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء انتشار القيم المقاسة ل S، مما يعوق التمييز بين الإشارات المقدمة من المانحين فقط (S = 1) وإشارات المستقبلين فقط (S = 0). يمكن استخدام الآثار الزمنية الناتجة كمدخلات لإجراء تحليل أكثر تفصيلا لمسارات الجزيء الواحد للحصول على معلومات مثل ملامح القوة المكانية الزمانية16، أو حركة أحداث الجزيء الواحد22، أو الحركيات الانتقالية بين الحالات المختلفة1.
يصف البروتوكول التالي المعلمات والإجراءات التجريبية لتجارب تتبع smFRET ، بالإضافة إلى مبدأ العمل وراء تحليل البيانات باستخدام مجموعة البرامج المطورة حديثا. للحصول على البيانات التجريبية ، يوصى باستخدام إعداد الفحص المجهري الذي يلبي المتطلبات التالية: أ) القدرة على الكشف عن انبعاث جزيئات الصبغة المفردة. ii) إضاءة واسعة المجال: خاصة بالنسبة لتجارب الخلايا الحية ، يوصى بتكوين الانعكاس الداخلي الكلي (TIR23,24,25) ؛ ج) الفصل المكاني لضوء الانبعاث وفقا للطول الموجي بحيث يتم إسقاط التألق المانح والمتقبل على مناطق مختلفة من نفس شريحة الكاميرا 25 أو كاميرات مختلفة ؛ د) تعديل مصادر الضوء لإثارة المتبرع والمتقبل بدقة مللي ثانية ، على سبيل المثال ، باستخدام أشعة الليزر القابلة للتعديل مباشرة أو التشكيل عبر المعدلات الصوتية البصرية. هذا يسمح بالإضاءة الستروبوسكوبية لتقليل التبييض الضوئي للفلوروفورات وكذلك الإثارة بالتناوب لتحديد stoichiometries. v) إخراج ملف واحد لكل تسلسل صورة مسجل بتنسيق يمكن قراءته بواسطة حزمة PIMS Python26. على وجه الخصوص ، يتم دعم ملفات TIFF متعددة الصفحات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790404P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945; Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1084-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer microscope body</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET570/60m</td>
			<td>donor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET675/50m</td>
			<td>acceptor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conda-forge</td>
			<td>conda-forge community</td>
			<td></td>
			<td>community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td>
			<td>MENZEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>FF640-FDi01-25&#215;36</td>
			<td>separation of donor and acceptor emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (quad band)</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>Di01-R405/488/532/635-25&#215;36</td>
			<td>separation of excitation and emission light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fret-analysis</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python package for smFRET data analysis; version 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11524766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBeam Smart 405-S 405 nm laser</td>
			<td>Toptica Photonics AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek chambers (8 wells)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177402PK</td>
			<td>for sample preparation and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenia Prime 532 nm laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniconda</td>
			<td>Anaconda Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Python 3 distribution. Min. version: 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20860 &#38; 20859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBIS 640 nm laser</td>
			<td>Coherent Inc</td>
			<td>1185055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optosplit II</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5253</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sdt-python</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python library for data analysis; version 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpek bead size kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T14792</td>
			<td>Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USC500TH Ultrasound bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>for SUV formation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes

نقل طاقة الرنين Förster أحادي الجزيء (smFRET) هي تقنية متعددة الاستخدامات للإبلاغ عن المسافات في نطاق ما دون النانومتر إلى النانومتر. وقد تم استخدامه في مجموعة واسعة من التجارب البيولوجية الفيزيائية الحيوية والجزيئية ، بما في ذلك قياس القوى الجزيئية ، وتوصيف الديناميكيات التوافقية للجزيئات الحيوية ، ومراقبة التوطين المشترك داخل الخلايا للبروتينات ، وتحديد أوقات التفاعل بين المستقبلات والروابط. في تكوين الفحص المجهري واسع المجال ، يتم إجراء التجارب عادة باستخدام مجسات مثبتة على السطح. هنا ، يتم تقديم طريقة تجمع بين تتبع الجزيء الواحد مع تجارب smFRET للإثارة بالتناوب (ALEX) ، مما يسمح باكتساب آثار زمنية smFRET للتحقيقات السطحية ، ولكن المتنقلة في أغشية البلازما أو الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالزجاج. ولتحليل البيانات المسجلة، تم تطوير مجموعة برمجيات آلية مفتوحة المصدر تدعم (أ) توطين إشارات الفلورسنت، (ب) تتبع الجسيمات المفردة، (ج) تحديد الكميات المتعلقة ب FRET بما في ذلك عوامل التصحيح، (د) التحقق الصارم من آثار smFRET، و (ت) العرض البديهي للنتائج. يمكن استخدام البيانات التي تم إنشاؤها بسهولة كمدخلات لمزيد من الاستكشاف عبر برامج متخصصة ، على سبيل المثال ، لتقييم السلوك المنتشر للمجسات أو التحقيق في انتقالات FRET.

يمكن استخراج مجموعة متنوعة من المعلومات منخفضة وعالية المستوى من مسارات smFRET اعتمادا على السؤال العلمي للتجربة. هنا ، يتم تقديم أمثلة على خطوط أنابيب التحليل مع المجسات التناظرية والرقمية: مستشعر القوة الجزيئية القائم على الببتيد16 ومسبار الحمض النووي مع التبديل العشوائي لتكوينه38 ، على التوالي. ارجع إلى الشكل 5 لمعرفة التصميم ومبدأ عمل هذه المجسات.
بعد تنفيذ خوارزميات التوطين والتتبع كما هو موضح في البروتوكول ، توفر الحزمة أدوات متعددة لتصور البيانات لتحسين المعلمات الأولية وخطوات التصفية اللاحقة: (i) تصور أحداث smFRET الفردية ، (ii) تجزئة الصور الاختيارية لتحليل البيانات في مناطق معينة من الاهتمامات ، (iii) مراقبة خطوات التصفية عبر كفاءة FRET مقابل مؤامرات stoichiometry (E-S). يتم عرض تصور بيانات الجزيء الواحد في الشكل 6.
أخيرا ، يتم تمثيل أحداث FRET التي تمت تصفيتها بواسطة مخطط E-S ورسم بياني لكفاءة FRET (الشكل 4). تعد مؤامرة E-S أداة مفيدة لتحسين خطوات التصفية المذكورة أعلاه والتحقيق في النتيجة النهائية. يمكن استبعاد مستشعرات FRET المبيضة جزئيا أو غير المكتملة من خلال قيمة قياس الخصر الخاصة بها. يمكن التحقيق في معلمات التنقل عن طريق رسم مسار مسار فردي في مخطط x-y (الشكل 6) أو مخطط متوسط الإزاحة المربعة (MSD) (الشكل 4). الطريقة الأولى مفيدة بشكل خاص للتمييز بين الحركة والأحداث المجمدة ، في حين يتم استخدام الطريقة الأخيرة لحساب معامل الانتشار.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> الشكل 4: الإخراج المثالي. (أ) يتم رسم كفاءة FRET مقابل قياس الكيمياء (E-S plot) لمجموعة من مستشعر القوة الجزيئية (اللوحة اليسرى) التي تزين طبقة ثنائية من الدهون المدعومة بالزجاج وتوترها خلية T. سحابة سكانية واحدة فقط مرئية. يجسد الرسم البياني الخاص بكفاءات FRET الفرق بين مجموعة مستشعر القوة في وجود الخلايا وغيابها (اللوحة الوسطى). لا يمكن ملاحظة أي تحول إلى انخفاض كفاءة FRET لأفراد المستشعر في وجود الخلايا التائية ، مما يشير إلى تمدد ضئيل أو معدوم يعتمد على القوة لوحدة الاستشعار. تؤكد مخطط MSD لهذه الظروف التجريبية أن مجموعة مستشعر القوة تحت الخلية التائية تتحرك بشكل أبطأ بكثير من نظيراتها غير المقيدة (اللوحة اليمنى). (ب) وأجري التحليل نفسه باستخدام مستشعر الحمض النووي لتقاطع هوليداي الذي يزين طبقة ثنائية من الدهون السائلة المدعومة بالزجاج. تظهر مؤامرة E-S بوضوح مجموعتين من السكان ، والتي هي واضحة أيضا في الرسم البياني لكفاءة FRET. تشير مؤامرة MSD إلى وجود مجموعة أجهزة استشعار واحدة سريعة الحركة. الاختصارات: FRET = نقل طاقة الرنين Förster؛ MSD = متوسط الإزاحة المربعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> الشكل 5: التصميم ومبدأ العمل لمجسات FRET داخل الجزيئية. (أ) مستشعر الببتيد التناظري للقياس الكمي للقوى الجزيئية الميكانيكية. ترتبط الفلوروفورات المانحة والمتقبلة تساهميا بأي من طرفي العمود الفقري للببتيد. ترتبط وحدة المستشعر على وجه التحديد برابطة محددة ، والتي بدورها تربط مستقبلا سطحيا مقيما في الخلية محل اهتمام (هنا ، جزء من الجسم المضاد يتعرف على وجه التحديد على سلسلة بيتا لمستقبل الخلايا التائية). عند ربط رباط المستقبلات ، يتم ممارسة القوة ، وتمتد وحدة المستشعر وترتد في النهاية بعد انقسام الرابطة. تم تعديل هذه اللوحة من 16. (ب) مستشعر الحمض النووي الرقمي لتحديد كمية انتقالات FRET. يتكون مستشعر FRET من أربعة خيوط من الحمض النووي تشكل تقاطع هوليداي. يتم ربط الفلوروفور المانح والمتقبل تساهميا بخيطين. غالبا ما تقوم تقاطعات هوليداي بتبديل تشكيلها اعتمادا على ظروف التخزين المؤقت المحيطة. يمكن مراقبة التبديل العشوائي لهذه التشكيلات عن طريق تحديد كفاءة FRET للمجسات الفردية. الاختصارات: TCR = مستقبلات الخلايا التائية. FRET = نقل طاقة الرنين Förster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> الشكل 6: أمثلة على توطين وتتبع مجسات FRET. (أ) يتم حساب كفاءة FRET وقياس الترويشيومتري للأحداث الفردية عن طريق تحديد شدة الفلوروفور المانح عند إثارة المتبرع (D → D) ، والفلوروفور المتقبل عند إثارة المتبرع (D → A) ، والفلوروفور المتقبل عند إثارة المتقبل (A → A). تمنع تصفية أقرب جار التحيز عن طريق تداخل وظائف انتشار النقطة للبواعث القريبة. يسمح تجزئة الصور للمستخدم باختيار أحداث smFRET معينة مترجمة داخل منطقة الاهتمام (على سبيل المثال ، خلية أو نمط صغير). وكمثال على تجزئة الصورة، تم تلطيخ الخلايا التائية ب Fura-2 (معروضة على اليسار) وإخضاعها للعتبات التكيفية لتحديد حواف الخلية (الخط البرتقالي المنقط). أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر (B) مسارات smFRET باستخدام مستشعر القوة الجزيئية. يمكن رسم المسارات الفردية في مستوى x-y ، وتصور سلوك الانتشار والتوطين (اللوحة اليسرى). علاوة على ذلك ، يمكن رسم كثافة كل مسار بمرور الوقت لتحديد انتقالات FRET أو خطوات التبييض (تظهر اللوحة الوسطى المسار الأحمر من اللوحة اليسرى). يمكن تصور كفاءة FRET الناتجة وقياس stoichiometry بالمثل (اللوحة اليمنى). (ج) مسارات smFRET باستخدام مستشعر الحمض النووي لتقاطع هوليداي. تم استخدام HBSS + 12 mM MgCl2 كمخزن مؤقت أثناء القياسات. بصرف النظر عن خطوة تبييض المستقبل الظاهرة بالقرب من نهاية تسلسل هذه الأمثلة ، يمكن تحديد تردد انتقالات FRET لكل مستشعر. تقوم تقاطعات هوليداي بتبديل تشكيلها بتردد عال ، في حين أن مستشعر القوة الجزيئية لا يظهر انتقالات FRET. هذه المعلومات تجعل من الممكن ضبط الظروف التجريبية ، مثل التأخير بين الإطارات ، لزيادة أو تقليل عدد التحولات المرصودة. الاختصارات: FRET = نقل طاقة الرنين Förster؛ smFRET = جزيء واحد FRET; HBSS = محلول الملح المتوازن من هانك. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
معلومات تكميلية: توطين وتتبع الجزيئات المفردة (01. Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

تقدم هذه المقالة طريقة للتحليل المكاني الزماني للمجسات المتنقلة أحادية الجزيء Förster القائمة على نقل الطاقة بالرنين (smFRET) باستخدام المجهر الفلوري واسع المجال. تسمح مجموعة أدوات البرامج المطورة حديثا بتحديد آثار الوقت smFRET للمجسات المتحركة ، بما في ذلك كفاءة FRET الصحيحة والمواقع الجزيئية ، كوظائف للوقت.

التحليل المكاني الزماني الآلي ثنائي الأبعاد لمجسات FRET أحادية الجزيء المتنقلة

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

تم إجراء تجارب FRET أحادية الجزيء باستخدام مجسات سطحية بشكل حصري تقريبا على الجزيئات المجمدة في الماضي. ومع ذلك ، تنتشر العديد من الجزيئات الحيوية ويمكن تحليلها باستخدام طريقتنا. إن الجمع بين FRET أحادي الجزيء والتتبع يجعل من الممكن تحليل ليس فقط آثار وقت نقص FRET للمجسات المتحركة ، ولكن أيضا للتحقيق في الجوانب المكانية الزمانية مثل السلوك المنتشر.طريقتنا متوافقة مع مجموعة متنوعة من المجسات المختلفة القائمة على FRET. على سبيل المثال ، يمكن أن يوفر رؤى بشأن القوى الجزيئية ، والديناميكيات التوافقية ، والحركيات الملزمة في تجارب الخلايا الحية. من الصعب إجراء تجارب FRET أحادية الجزيء عالية الجودة.من أجل تحديد كمي موثوق به ، من المهم تسجيل البيانات بنسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة ومسارات أحادية الجزيء بطول كاف. لبدء قياس العينة، قم بإثارة الفلوروفورات المانحة والمتقبلة للحصول على وقت إضاءة مناسب أثناء تشغيل الكاميرا وانتظر حتى يتم تمكين قراءة الكاميرا. كرر إثارة الفلوروفورات المانحة والمتقبلة بدلا من ذلك.اختر عدد التكرارات لتكون كبيرة بما يكفي لضمان التبييض الضوئي لفلوروفور واحد على الأقل لكل مسبار داخل مجال الرؤية مما يسمح لتحليل التبييض الضوئي التدريجي بالتمييز بين إشارات الجزيء الواحد من المجاميع. حدد تسلسل الإضاءة للسماح بتحديد إطارات الإثارة المانحة والمتقبلة وكذلك إطارات تجزئة الصورة من تسلسلات الصور المسجلة. في الوقت نفسه ، قم بتحليل مجموعات البيانات المسجلة باستخدام نفس إعدادات الإضاءة.تحقيقا لهذه الغاية، قم بتعيين معرف ونمط يطابق أسماء ملفات تسلسل الصور المعنية لكل مجموعة بيانات. بالإضافة إلى ذلك، حدد مجموعات بيانات محددة لأغراض خاصة مثل تسجيلات العلامات الائتمانية لتسجيل الصور، وملفات تعريف ضوء الإثارة لتصحيح الحقل المسطح، وعينات اختيارية للمتبرعين فقط والمقبولين فقط لتحديد عوامل التصحيح. بعد ذلك، حدد قنوات الانبعاثات والصور الخام إذا تم تسجيل كلتا القناتين باستخدام كاميرا واحدة.لهذا ، استخدم الأداة الرسومية المناسبة لتحديد المناطق المناسبة لانبعاثات المانحين والمستقبلين ، ثم قم بتوطين العلامات الائتمانية في كل من قنوات الانبعاثات وإجراء تسجيل الصور. استخدم واجهة المستخدم المتوفرة للعثور على المعلمات المناسبة لخوارزمية التعريب لكل من قنوات الانبعاثات المانحة والمستقبلة. بعد ذلك ، قم بتعيين معلمات توطين جزيء واحد لمجسات FRET عند إثارة المتبرع في مجموع الصور التي تم الحصول عليها من انبعاثات المتبرع والمتقبل ، ثم قم بتعيين معلمات التوطين للمجسات عند إثارة المتلقي في قناة انبعاث المستقبل.توطين مجسات FRET عند إثارة المتبرع والمتقبل بشكل مستقل في جميع الإطارات. يتم دمج النتائج في جدول واحد يحتوي على رقم الإطار الأصلي والإحداثيات ثنائية الأبعاد والمعرف الذي يشير إلى ملف الصورة المصدر. لتتبع وقياس شدة التألق ، اختر الخيارات المناسبة لخوارزمية Trackpy لربط توطينات مسبار FRET بالمسارات.بعد ذلك ، باستخدام وظيفة برنامج التحليل ، قم بمعالجة بيانات الصور الإضافية من تسلسل الصور. استخراج صور إضافية مسجلة لتسهيل التجزئة المميزة بحرف S في تسلسل الإثارة. وأخيرا، حدد ملفات تعريف ضوء الإثارة المانحة والمتقبلة عبر مجال الرؤية من الصور المسجلة على عينة ذات علامات كثيفة.بالنسبة لخطوات التصفية الأولية ، تجاهل الإشارات ذات وظائف انتشار النقطة المتداخلة لأنه من الصعب تحديد شدتها الفلورية بشكل موثوق. في حالة الإضاءة غير المتجانسة، لا تقبل سوى الإشارات الموجودة في المناطق المضاءة جيدا داخل مجال الرؤية لضمان نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة. إذا كنت تدرس FRET داخل الجزيئات ، فقم بتقييد التحليل على تلك المسارات الموجودة منذ بداية تسلسل الصورة.بعد ذلك ، قم بتنفيذ تصحيح المجال المسطح ، والذي يستخدم ملفات تعريف مصدر ضوء الإثارة التي تم الحصول عليها في وقت سابق لعكس اختلافات شدة التألق المعتمدة على الموضع الناجمة عن الإضاءة غير المتجانسة ، ثم حساب كفاءة FRET الظاهرة وقياس stoichiometry الظاهر. لإجراء تحليل تدريجي للتبييض الضوئي للتمييز بين المجسات الجزيئية المفردة والمجاميع ، ابحث عن المعلمات المناسبة لخوارزمية اكتشاف نقطة التغيير عند إثارة المتبرع والمستقبل بشكل مستقل. ثم قم بتنفيذ خوارزمية اكتشاف نقطة التغيير.لإزالة المسار الذي يظهر سلوك التبييض الضوئي الغامض، حدد عتبات الكثافة التي يعتبر الفلوروفور تحتها مبيضا، ثم حدد أحد الخيارات التالية. الخيار الأول حيث يبيض الفلوروفور المتقبل في خطوة واحدة بينما لا يظهر المتبرع أي تبييض جزئي. الخيار الثاني حيث يقوم المتبرع بالتبييض في خطوة واحدة بينما لا يوجد تبييض جزئي للمتقبل.الخيار الثالث حيث يقوم أي من المبيضات الفلوروفورية في خطوة واحدة بينما لا تبيض الأخرى جزئيا. والخيار الرابع حيث تظهر الفلوروفورات المانحة والمتقبلة تبييض ضوئي أحادي الخطوة أو لا يوجد تبييض ضوئي على الإطلاق. ثم احسب عوامل التصحيح لتسرب انبعاثات المانحين إلى قناة المستقبل، وإثارة المتقبل المباشر، وكفاءة الكشف وكفاءة الإثارة.بعد ذلك ، استخدم عوامل التصحيح لحساب كفاءة FRET من الكفاءة الظاهرة وقياس stoichiometry من stoichiometry الظاهر. لمزيد من التصفية، حدد نقاط البيانات فقط من قبل حدث التبييض الأول في كل مسار. بالإضافة إلى ذلك ، لتقييد التحليل على مجسات أحادية الجزيء ، تقبل فقط المسارات التي تحتوي على 75٪ على الأقل من نقاط البيانات ضمن حدود stoichiometry المناسبة.ثم قم بإجراء تجزئة الصورة عبر طرق العتبة العالمية أو التكيفية على الصور المساعدة المناسبة لتقييد التحليل إلى مناطق متميزة داخل مجال الرؤية. إنشاء مخططات الكفاءة مقابل قياس الستويشيومتري للتحقق من أن إشارات قياس الستويشيومتري غير الصحيحة قد تم تحديدها وإزالتها بشكل صحيح. ثم قم برسم المدرج التكراري لكفاءات FRET لتوفير نظرة عامة راسخة على توزيعات كفاءة FRET وتجميع المدرج التكراري للمقارنة المريحة للنتائج من التجارب المختلفة.من خلال الاستفادة من مكتبات Python العلمية ، من الممكن إجراء مزيد من التقييم للبيانات داخل دفتر الملاحظات ، وإجراء ، على سبيل المثال ، تحليل الانتشار. يتم عرض تصور وتتبع حدث FRET أحادي الجزيء هنا. يتم تمثيل أحداث FRET التي تمت تصفيتها من خلال مخططات الكفاءة مقابل stoichiometry في الرسم البياني لكفاءة FRET.علاوة على ذلك ، يمكن التحقيق في معلمات التنقل عن طريق رسم مسار مسار فردي في مخطط XY أو مخطط إزاحة مربع متوسط. يسمح لنا مخرجات منصتنا بتحديد التحولات بشكل أكبر في آثار وقت كفاءة FRET للمجسات المتنقلة. على سبيل المثال ، لتقييم التغيرات التوافقية للجزيئات الحيوية.باستخدام مستشعر قوة قائم على FRET ، سمحت لنا منصة التحليل بتحديد أحداث قوة الجزيء الواحد داخل المشبك المناعي أثناء إشارات الخلايا التائية المبكرة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

المضاعفة واحدة جزيء القياسات التحلل البروتيني باستخدام الملقط قوة مغناطيسية

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

الكمية الحنق (فورستر نقل الطاقة الرنين) تحليل لتحديد حركية SENP1 البروتياز

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

واحدة جزيء مضان المجهر على مستو المعتمدة طبقات ثنائية

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

تسمية خالية واحدة كشف الجزيئة عن طريق Microtoroid البصرية الرنين

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

كشف حساسية Proteopathic البذر آخر مع الحنق التدفق الخلوي

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

مضان الانتعاش بعد دمج قطرات لقياس انتشار ثنائي الأبعاد من الفوسفوليبيدية واحد رقائق

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

تحليل الآلي تقلص الإنسان المهندسة القلب الأنسجة للفحص القلب سلامة الأدوية

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...