Name: automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den østrigske Videnskabsfond (FWF) projekter P30214-N36, P32307-B, og af Wien Science and Technology Fund (WWTF) LS13-030.

<ol>
	<li>McKinney, S. A., D&#233;clais, A. -. C., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+individual+holliday+junctions.">Structural dynamics of individual holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).</li><li>Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+potassium-channel+gating+revealed+by+single-molecule+FRET.">Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).</li><li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks.">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), 235 (2018).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).</li><li>Wu, P. G., Brand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonance+energy+transfer:+Methods+and+applications.">Resonance energy transfer: Methods and applications.</a> Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).</li><li>Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecular+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+measurement+on+structures+and+interactions+of+biomolecules.">Single-molecular f&#246;rster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules.</a> Micromachines. 12 (5), 492 (2021).</li><li>Malkusch, N., D&#246;rfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=smFRET+experiments+of+the+RNA+polymerase+II+transcription+initiation+complex.">smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex.</a> Methods. 120, 115-124 (2017).</li><li>Lee, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+views+of+MutS+on+mismatched+DNA.">Single-molecule views of MutS on mismatched DNA.</a> DNA repair. 20, 82-93 (2014).</li><li>Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microsecond+single-molecule+FRET+to+determine+the+assembly+pathways+of+T4+ssDNA+binding+protein+onto+model+DNA+replication+forks.">Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).</li><li>Deindl, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+conformational+dynamics+with+single-molecule+fluorescence+energy+transfer:+Applications+in+nucleosome+remodeling.">Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling.</a> Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).</li><li>Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+colocalization+FRET+evidence+that+spliceosome+activation+precedes+stable+approach+of+5'+splice+site+and+branch+site.">Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).</li><li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations.">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li><li>Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+kinesin+waits+between+steps.">How kinesin waits between steps.</a> Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).</li><li>G&#246;hring, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+analysis+of+T-cell+receptor-imposed+forces+via+quantitative+single+molecule+FRET+measurements.">Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements.</a> Nature Communications. 12 (1), 2502 (2021).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669 (2018).</li><li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-aided+molecule+sorting:+Analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li><li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells.">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).</li><li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules.">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).</li><li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation.">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li><li>Asher, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+imaging+of+GPCR+dimers+in+living+cells.">Single-molecule FRET imaging of GPCR dimers in living cells.</a> Nature Methods. 18 (4), 397-405 (2021).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy. (12), 1223-1237 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(excitation)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (excitation) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1189-1191 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(emission)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (emission) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1192-1194 (2012).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., van der Wel, C. M., Dimiduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft-matter/pims: PIMS v0.5. , (2020).</li><li>Anaconda Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Miniconda. , (2021).</li><li>conda-forge community. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The conda-forge project: community-based software distribution built on the conda package format and ecosystem. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> JupyterLab Contributors Notebooks - JupyterLab documentation. , (2021).</li><li>Babcock, H., Sigal, Y. M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-density+3D+localization+algorithm+for+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">A high-density 3D localization algorithm for stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Optical Nanoscopy. 1 (6), (2012).</li><li>Gao, Y., Kilfoil, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+detection+and+complete+tracking+of+large+populations+of+features+in+three+dimensions.">Accurate detection and complete tracking of large populations of features in three dimensions.</a> Optics Express. 17 (6), 4685 (2009).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> sdt-python: Python library for fluorescence microscopy data analysis (v17.1). , (2021).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nature Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li><li>Bradski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OpenCV+library.">The OpenCV library.</a> Dr. Dobb's Journal: Software Tools for the Professional Programmer. 25 (11), 120-123 (2000).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft-matter/trackpy:+Trackpy+v0.5.0.">Soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0.</a> Zenodo. , 4682814 (2021).</li><li>Killick, R., Fearnhead, P., Eckley, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+detection+of+changepoints+with+a+linear+computational+cost.">Optimal detection of changepoints with a linear computational cost.</a> Journal of the American Statistical Association. 107 (500), 1590-1598 (2012).</li><li>Schrangl, L., G&#246;hring, J., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+single+molecule+FRET+transitions+without+trajectories.">Kinetic analysis of single molecule FRET transitions without trajectories.</a> The Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123328 (2018).</li><li>Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+single-molecule+FRET+dynamics+with+probability+distribution+analysis.">Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis.</a> ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+analysis+software+(3.0).">Single-molecule FRET analysis software (3.0).</a> Zenodo. , (2021).</li><li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers.">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li><li>Platzer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unscrambling+fluorophore+blinking+for+comprehensive+cluster+detection+via+photoactivated+localization+microscopy.">Unscrambling fluorophore blinking for comprehensive cluster detection via photoactivated localization microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4993 (2020).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The molecular probes handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies. , (2010).</li><li>Szalai, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+energy+transfer+by+intensity-based+STED-FRET.">Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET.</a> Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+two-photon+probe+for+in+vivo+tracking+of+pH+during+a+traumatic+brain+injury+process.">A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process.</a> New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Denne artikel beskriver en pipeline til automatiserede optagelser og kvantitativ analyse af smFRET-data, der stammer fra mobile, men overfladebundne sondemolekyler. Det supplerer de to fremherskende tilgange til smFRET eksperimenter, der involverer enten overflade-immobiliserede sonder eller sonder diffusing i opløsning ind og ud af en konfocal excitation volume17. Det giver den korrekte FRET effektivitet og de molekylære positioner som en funktion af tiden. Det kan derfor bruges som input til specialiserede analyseprogrammer, f.eks. til at kvantificere overgangs kinetik1, FRET-histogrammer39 eller todimensionel diffusion22.
Softwaren frigives under en gratis og open source-licens, der er godkendt af Open Source Initiative, der giver brugeren den evige ret til gratis brug, ændring og omfordeling. Github blev valgt som udviklings- og distributionsplatform for at gøre det så nemt som muligt at få softwaren og deltage i udviklingsprocessen ved at rapportere fejl eller bidrage med kode40. Skrevet i Python, softwaren afhænger ikke af proprietære komponenter. Valget af Jupyter notebooks som brugergrænseflader letter inspektionen af data på hvert analysetrin og giver mulighed for at skræddersy og udvide rørledningen specielt til det eksperimentelle system ved hånden. Den sdt-python bibliotek32 tjener som fundament og gennemfører funktionalitet til at evaluere fluorescens mikroskopi data, såsom enkelt-molekyle lokalisering, diffusion analyse, fluorescens intensitet analyse, farve kanal registrering, colocalization analyse, og ROI håndtering.
I princippet kan enkeltpartikelsporing udføres i en-, to- eller tredimensionelle systemer. Her blev enkeltmolekyleanalysepipelinen skræddersyet til studiet af 2D-mobile systemer. Dette valg afspejler tilgængeligheden af enkle systemer, såsom planar-støttede lipid bilayers (SLBs), til at præsentere mobile fluorescerende sonder. Sådanne lipid bilayer systemer er typisk består af to eller flere fosfolipider moieties, hvor bulk fraktion bestemmer de vigtigste fysisk-kemiske parametre i SLB (såsom fase og viskositet), og den mindre fraktion giver fastgørelsessteder for biomolekyler. Disse vedhæftede filer kan være biotinylerede fosfolipider til avidin- eller streptavidin-baserede proteinplatforme eller nikkel-NTA konjugerede fosfolipider til proteinplatforme med histidin tags41. Valget af den rette platform til at forbinde proteiner med SLB afhænger af det videnskabelige spørgsmål. Læserne kan henvise til litteraturen16,38,42 for eksempler på succesfuldt anvendte strategier. Massefylden af sonder i prøven skal være tilstrækkelig lav til at undgå overlappende punktspredningsfunktioner. typisk anbefales mindre end 0,1 molekyler pr. μm2. Se afsnittet om repræsentative resultater (især figur 6) for et eksempel, der viser en passende sondetæthed. Analysemetoden gælder også for enkelt fluorescerende mærkede proteinmolekyler, der spredes i plasmamembranen i levende celler.
Et kritisk aspekt af smFRET eksperimenter er produktion og karakterisering af FRET sonder selv. Når de vælger fluorophorer til et FRET-par, skal deres Förster-radius matche de forventede interfarveafstande43. Farvestoffer, der er resistente over for fotobleaching, foretrækkes, da de giver langtidsspor. Men for forhøjede blegningshastigheder kan en fluorophore-art bruges til at genkende multiemitterhændelser, der stammer fra colocalized molekyler via trinvis fotobleachinganalyse; se trin 8.1.4 i protokolafsnittet. Fluorophorepar skal være sted-specifikt og kovalent fastgjort til molekyler af interesse, danner intra- eller intermolekylær FRET par.
Kombinationen af smFRET med andre lettilgængelige teknikker kan øge dens rumlige opløsning ud over diffraktionsgrænsen (via STED44). SmFRET tracking algoritme præsenteret her udvider tilgangens anvendelighed til nye eksperimentelle indstillinger og modelsystemer. Dette omfatter undersøgelser af i) kinetiske ændringer i stoichiometri af mobile biomolekyler, ii) dynamisk sammenslutning af mobile biomolekyler, iii) hastigheden af enzymatiske reaktioner hos frit diffuserende reaktanter og (iv) kinetik af kropslige ændringer af mobile biomolekyler. De to første eksempler kræver modelsystemer, der viser intermolekylær FRET, dvs. donor og acceptor, er konjugeret for at adskille biomolekylære enheder af interesse. Sidstnævnte eksempler kan gøre brug af biosensorer, der bærer donor og acceptor inden for samme molekylære enhed (intramolekylær FRET).
Intramolekylære FRET-baserede sensorer kan give indsigt i iboende kropslige ændringer af biomolekyler1,2,3,4, kropslige ændringer forårsaget af endogene eller ekstern kraftbelastning (molekylære kraftsensorer16) eller ionkoncentrationer i nanomiljøet, såsom calcium45 og pH46 . Afhængigt af modelsystemet og den foretrukne forankringsplatform kan sådanne smFRET-hændelser enten spores i 2D eller 3D: (i) planarsporing af smFRET-hændelser kan anvendes til kvantificering af receptor-ligand-interaktionstider inden for en plasmamembran, sammenslutningen af membranforankrede signalforstærkningskaskader og stoichiometriændringerne i overfladereceptorer; ii) volumensporing af smFRET-hændelser kan anvendes til intra- eller intermolekulære FRET-sonder i levende celler eller i in vitro-rekonstituerede systemer.
SmFRET-sporingsmetoden blev udviklet hovedsageligt med intramolekulære FRET-sonder i tankerne. Disse sonder har et fast og velkendt antal fluorescerende etiketter, et faktum, der blev udnyttet til at afvise data fra agglomererede og forkert syntetiserede (f.eks. ufuldstændigt mærkede) molekyler samt fra sonder, hvor en af fluorophorerne er blevet fotoblecheret. Men ved at justere filtreringstrinnene kan metoden også anvendes på intermolekulære FRET-sonder. For eksempel, i stedet for kun at acceptere molekyler med en enkelt donor og en enkelt acceptor fluorophore, kunne man undersøge de rumlige baner af donor og acceptor farvestoffer og vælge, for eksempel for co-diffusing donor-acceptor baner.
Da 3D-DAOSTORM-algoritmen har støtte til bestemmelse af et signals position langs den optiske akse via bygningsfejlen på grund af en cylindrisk linse i emissionsstrålevejen, kunne 3D-eksperimenter let integreres i analysepipelinen. I dette tilfælde vil acceptorsignalet ved acceptor excitation tjene til at bestemme stoichimetrien og den aksiale position. Analysesoftwaren kan også anvendes til at evaluere data fra eksperimenter med immobiliserede sonder ved at udnytte sin store grad af automatiserings- og filtreringsordninger. Faktisk blev smFRET effektivitet datasæt fra Holliday vejkryds immobiliseret på gel-fase bilayers38 analyseret ved hjælp af en tidlig version af softwaren.

Förster resonans energioverførsel (FRET) har været en vigtig drivkraft i molekylær biologisk og biofysisk forskning, da det giver mulighed for undersøgelse af processer ved sub-nanometer opløsning. Da effektiviteten af energioverførsel mellem donor og acceptorfluoripher i høj grad afhænger af den interfarvede afstand i sub-nanometeret til nanometerområdet, er det effektivt blevet brugt som spektroskopisk lineal til at udforske statisk og dynamisk kropsbygning af biomolekyler1,2,3,4. Derudover har FRET-fænomenet været meget udbredt til colocalization undersøgelser af membran-associerede og intracellulære proteiner på et bulkniveau5,6. I de sidste to årtier blev metoden tilpasset til overvågning af smFRET-hændelser7, hvilket bidrog til at øge den tidsmæssige og rumlige opløsning betydeligt og løste selv sjældne delpopulationer i heterogene prøver. Udstyret med disse teknikker blev der opnået unik indsigt i dynamikken i molekylære maskiner såsom udskriftsbehandlingshastigheden af RNA polymerase II8, replikationshastighed af DNA-polymeraser9,10, nukleosomtranslokationshastighed11, udskriftssplejsning og stallingshastighed af samlede splekom12, aktiviteten af ribosomale delpopulationer13 og kinesinmotorers ganghastighed14 , for at nævne nogle få. Receptor-ligand interaktion varigheder15 og molekylære kræfter16 er blevet kvantificeret.
Intensitetsbaserede smFRET-undersøgelser er typisk afhængige af sensibiliseret emission for at måle FRET-effektivitet: en strålekløver i emissionsvejen adskiller rumligt lys, der stammer fra donor- og acceptorfluoriorter ved donor excitation, hvilket giver mulighed for kvantificering af individuelle fluorescensintensiteter. Effektiviteten kan efterfølgende beregnes som den del af fotoner, der udsendes af acceptoren med hensyn til det samlede fotonantal17. Desuden tillader acceptor excitation efter donor excitation (ALEX) måling af stoichiometri af FRET begivenheder, medvirken i forskelsbehandlingen mellem ægte lave FRET signaler fra signaler, der opstår, f.eks fra sonder byder på en fotoblecheret acceptor fluorophore18.
Enkelt-molekyle FRET eksperimenter er almindeligt udført på en af to måder. For det første belyses et lille område i prøvevolumen ved hjælp af et konfokalt mikroskop. Enkelt sonde molekyler i opløsning er begejstrede, når de tilfældigvis diffus inden for brændvolumen. Med denne teknik kan hurtige fotontællingsdetektorer bruges, hvilket muliggør submikrosekundtidsopløsning. For det andet er sonder specielt immobiliseret på overflader og overvåges via widefield mikroskopi, ofte ved hjælp af total intern refleksion (TIR) konfiguration for at minimere baggrund fluorescens. Sonde immobilisering giver mulighed for meget længere optagelsestider end ved hjælp af den første tilgang. Derudover tillader det større synsfelt overvågning af flere sonder parallelt. Behovet for et kamera gør denne metode langsom i forhold til den, der er beskrevet ovenfor. Tidsopløsningen er begrænset til millisekunderne til andet område.
Hvis der kræves spor i lang tid, f.eks. til at studere dynamiske processer på et millisekund til anden gangskala, er den første metode ikke relevant, da fluorescensudbruddene typisk er for korte. Den anden fremgangsmåde mislykkes, når immobilisering ikke er mulig, f.eks. i levende celleeksperimenter med sonder, der spredes i cellemembranen. Desuden er det blevet observeret, at biologiske modelsystemer kan variere deres respons dramatisk afhængigt af mobiliteten af den kontaktede overflade16.
Mens kombinerede smFRET og single-partikel tracking eksperimenter optagelse mobile FRET sonder er blevet udført i de seneste19, der er ingen offentligt tilgængelig software til evaluering af data. Dette førte til udviklingen af en ny analyseplatform, som giver mulighed for bestemmelse af flere egenskaber af mobile fluorescerende sonder, herunder smFRET-effektivitet og stoichimetri, positioner med nøjagtighed underpixel og fluorescensintensiteter som tidsfunktioner. Metoder til filtrering af de resulterende spor ved at undersøge trinvis blegning adfærd, nærmeste nabo afstande, emission intensiteter, og andre træk blev etableret for udelukkende at vælge korrekt syntetiseret og funktionelle enkelt-sonde molekyler. Softwaren understøtter også eksperimentelle og analytiske teknikker, der for nylig blev aftalt i en multilaboratorisk undersøgelse for at producere pålidelige, kvantitative smFRET-data17. Gennemførelsen overholder navnlig de validerede procedurer for beregning af FRET-effektivitet og stoichimetri. Fluorescensintensiteter ved donor excitation i donor emission kanal IDD og acceptor emission kanal IDA anvendes til beregning af den tilsyneladende FRET effektivitet Eapp ved hjælp af Eq (1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg"> (1)
Ved hjælp af fluorescensintensiteten i acceptoremissionskanalen ved acceptor excitation IAA beregnes den tilsyneladende stoichimetri ved hjælp af Eq (2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg"> (2)
FRET-effektivitet E og stoichiometri S kan udledes af Eapp og Sapp ved at overveje fire korrektionsfaktorer.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg">
α beskriver udsivningen af donorfluescens i acceptoremissionskanalen og kan bestemmes ved hjælp af en prøve, der kun indeholder donorfluoriorter, eller ved at analysere dele af baner, hvor acceptoren er blevet bleget. δ korrigerer for donor excitation lyskildens direkte excitation og kan måles ved hjælp af en prøve med kun acceptorfluoriorter eller ved at analysere dele af baner, hvor donoren er blevet bleget.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg">.
γ skalerer IDD for at rette op på divergerende detektionseffektivitet i donor- og acceptoremissionskanaler og forskellige kvanteeffektiviteter i fluorophorerne. Faktoren kan beregnes ved at analysere stigningen i donorintensiteten ved acceptor blegning i baner med høj FRET effektivitet20 eller ved at studere en prøve byder på flere diskrete FRET stater.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg">
β skalaer IAA til at korrigere for forskellige effektivitetsgevinster af donor og acceptor excitation. Hvis γ blev bestemt via acceptor blegning analyse, β kunne beregnes ud fra en stikprøve af kendte donor-til-acceptor ratio21. Ellers giver fret-prøven med flere stater også β.
Tilsammen gør korrektionerne det muligt at beregne den korrigerede FRET-effektivitet ved hjælp af Eq (3).
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg"> (3)
og den korrigerede stoichimetri ved hjælp af Eq (4).
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg"> (4)
Ideelt set giver den korrigerede stoichimetri for et 1:1 donor-til-acceptor-forhold S = 0,5. I praksis giver et reduceret signal-til-støj-forhold en spredning af de målte værdier af S, hvilket hæmmer forskelsbehandlingen fra donorsignaler (S = 1) og acceptorsignaler (S = 0). De resulterende tidsspor kan bruges som input til en mere detaljeret analyse af enkeltmolekylets baner for at få oplysninger som spatiotemporal kraftprofiler16, mobiliteten af enkeltmolekylehændelserne22 eller overgangskinetik mellem forskellige tilstande1.
Følgende protokol beskriver eksperimentelle parametre og procedurer for smFRET-sporingseksperimenter samt arbejdsprincippet bag dataanalyse ved hjælp af den nyudviklede softwarepakke. Ved erhvervelse af eksperimentelle data anbefales det at anvende en mikroskopiopsætning, der opfylder følgende krav: i) evne til at detektere emissionen af enkeltfarvemolekyler; ii) bredfeltsbelysning: navnlig for levende celleforsøg anbefales total intern refleksion (TIR23,24,25) konfiguration; iii) geografisk adskillelse af emissionslys i henhold til bølgelængde, således at donor og acceptor fluorescens projices på forskellige områder af samme kamerachip25 eller forskellige kameraer iv) graduering af lyskilder til donor og acceptor excitation med millisekunder præcision, f.eks ved hjælp af direkte modulatable lasere eller graduering via acousto-optiske modulatorer. Dette gør det muligt stroboskopisk belysning for at minimere fotobleaching af fluorophores samt vekslende excitation til bestemmelse stoichiometrier; v) output af én fil pr. optaget billedsekvens i et format, der kan læses af PIMS Python-pakken26. TIFF-filer med flere sider understøttes især.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790404P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945; Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1084-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer microscope body</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET570/60m</td>
			<td>donor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET675/50m</td>
			<td>acceptor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conda-forge</td>
			<td>conda-forge community</td>
			<td></td>
			<td>community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td>
			<td>MENZEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>FF640-FDi01-25&#215;36</td>
			<td>separation of donor and acceptor emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (quad band)</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>Di01-R405/488/532/635-25&#215;36</td>
			<td>separation of excitation and emission light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fret-analysis</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python package for smFRET data analysis; version 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11524766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBeam Smart 405-S 405 nm laser</td>
			<td>Toptica Photonics AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek chambers (8 wells)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177402PK</td>
			<td>for sample preparation and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenia Prime 532 nm laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniconda</td>
			<td>Anaconda Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Python 3 distribution. Min. version: 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20860 &#38; 20859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBIS 640 nm laser</td>
			<td>Coherent Inc</td>
			<td>1185055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optosplit II</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5253</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sdt-python</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python library for data analysis; version 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpek bead size kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T14792</td>
			<td>Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USC500TH Ultrasound bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>for SUV formation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes

Single-molecule Förster resonans energioverførsel (smFRET) er en alsidig teknik rapportering om afstande i sub-nanometer til nanometer rækkevidde. Det har været anvendt i en bred vifte af biofysiske og molekylære biologiske eksperimenter, herunder måling af molekylære kræfter, karakterisering af kropsbygningsdynamikken i biomolekyler, observation af intracellulær colocalization af proteiner og bestemmelse af receptor-ligand interaktionstider. I en widefield mikroskopi konfiguration, eksperimenter udføres typisk ved hjælp af overflade-immobiliserede sonder. Her præsenteres en metode, der kombinerer sporing af enkeltmolekyler med skiftevis excitation (ALEX) smFRET-eksperimenter, der tillader erhvervelse af smFRET-tidsspor af overfladebundne, men alligevel mobile sonder i plasmamembraner eller glasstøttede lipid-bilayers. Til analyse af registrerede data blev der udviklet en automatiseret, open source-softwaresamling, der understøtter i) lokalisering af fluorescerende signaler, (ii) sporing af enkeltpartikler, iii) bestemmelse af FRET-relaterede mængder, herunder korrektionsfaktorer, iv) streng verifikation af smFRET-spor og (v) intuitiv præsentation af resultaterne. De genererede data kan bekvemt bruges som input til yderligere udforskning via specialiseret software, f.eks. til vurdering af sondernes diffusion eller undersøgelse af FRET-overgange.

En række oplysninger på lavt og højt niveau kan udtrækkes fra smFRET-spor afhængigt af eksperimentets videnskabelige spørgsmål. Her præsenteres eksempler på analyserørledninger med analoge og digitale sonder: en peptidbaseret molekylær kraftsensor16 og en DNA-sonde med stokastisk skift af dens kropsbygning38. Se figur 5 for udformningen og arbejdsprincippet for disse sonder.
Efter lokaliserings- og sporingsalgoritmerne er blevet udført som beskrevet i protokollen, tilbyder pakken flere datavisualiseringsværktøjer til optimering af de indledende parametre og efterfølgende filtertrin: (i) visualisering af individuelle smFRET-hændelser, (ii) valgfri billedsegmentering til analyse af data i visse interesseområder, (iii) overvågning af filtertrin via FRET-effektivitet vs. stoichimetri (E-S) plots. Visualiseringen af enkeltmolekyledataene er præsenteret i figur 6.
Endelig repræsenteres de filtrerede FRET-hændelser af et E-S-plot og et FRET-effektivitets histogram (figur 4). E-S-plottet er et nyttigt værktøj til optimering af de ovennævnte filtreringstrin og undersøgelse af det endelige resultat. Delvist blegede eller ufuldstændigt mærkede FRET-sensorer kan udelukkes ved deres stoichimetriværdi. Mobilitetsparametre kan undersøges ved at afbilde en individuel banesti i et x-y-plot (figur 6) eller et gennemsnitligt kvadratforskydningsplot (FIGUR 4). Den første metode er især nyttig til kræsen mobil fra immobiliserede hændelser, mens sidstnævnte bruges til at beregne diffusionskoefficienten.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> Figur 4: Eksemplarisk output. (A) FRET-effektiviteten er plottet versus stoichimetri (E-S plot) for en population af molekylær kraft sensor (venstre panel) dekorere en glas-støttet lipid bilayer og anstrengt af en T-celle. Kun én befolkningssky er synlig. Det respektive histogramme af FRET-effektivitetsgevinster er et eksempel på forskellen mellem en kraftsensorpopulation i nærvær og fravær af celler (mellempanel). Der kan ikke observeres skift til lavere FRET-effektivitet i sensorpopulationen i nærværelse af T-celler, hvilket indikerer lidt eller ingen kraftafhængig strækning af sensormodulet. MSD-plottet af disse eksperimentelle forhold bekræfter, at kraftsensorpopulationen under en T-celle bevæger sig betydeligt langsommere end deres ubundne modstykker (højre panel). (B) Den samme analyse blev udført med Holliday junction DNA-sensor dekorere en glas-understøttet væske lipid bilayer. E-S-plottet viser tydeligt to populationer, som også er synlige i FRET-effektivitets histogrammet. Msd-plottet angiver tilstedeværelsen af en sensorpopulation i hurtig bevægelse. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverførsel; MSD = gennemsnitlig firkantet forskydning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> Figur 5: Design og arbejdsprincip for intramolekylære FRET-sonder. (A) Analog peptidsensor til kvantificering af mekaniske molekylære kræfter. Donoren og acceptor fluorophores er kovalent fastgjort til hver ende af peptid rygraden. Sensormodulet er sted-specifikt fastgjort til en bestemt ligand, som igen binder en celle-resident overflade receptor af interesse (her, et antistof fragment specifikt anerkender beta-kæden af T-celle receptor). Ved receptor-ligand bindende, kraft udøves, og sensoren modulet udvider og i sidste ende viger tilbage efter bond kavalergang. Dette panel er ændret fra 16. (B) Digital DNA-sensor til kvantificering af FRET-overgange. FRET-sensoren består af fire DNA-strenge, der danner et Holliday-kryds. Donoren og acceptorfluoriphen er kovalent fastgjort til to tråde. Holliday-vejkryds skifter ofte deres kropsbygning afhængigt af de omgivende bufferforhold. Den stokastiske skift af disse konformationer kan overvåges ved at kvantificere FRET-effektiviteten af de enkelte sonder. Forkortelser: TCR = T-cellereceptor; FRET = Förster resonans energioverførsel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> Figur 6: Eksempler på lokalisering og sporing af FRET-sonder. (A) FRET-effektiviteten og stoichimetrien af individuelle hændelser beregnes ved at kvantificere intensiteten af donorfluoriphe ved donor excitation (D → D), acceptor fluorophore ved donor excitation (D → A) og acceptor fluorophore ved acceptor excitation (A → A). Nærmeste nabofiltrering forhindrer bias ved at overlappe punktspredningsfunktioner for lukke emittittere. Billedsegmentering giver brugeren mulighed for at vælge visse smFRET-hændelser, der er lokaliseret inden for et interesseområde (f.eks. en celle eller en mikropattern). Som et eksempel på billedsegmentering blev T-celler farves med Fura-2 (vist til venstre) og udsat for adaptiv tærskeling for at identificere cellekanterne (orange prikket linje). Skalastænger = 5 μm. (B) smFRET baner ved hjælp af molekylær kraftsensoren. Individuelle baner kan plottet i x-y-flyet , visualisere deres diffusion og lokalisering (venstre panel). Desuden kan hver bane intensiteter plottes over tid for at identificere FRET overgange eller blegning trin (midterste panel viser den røde bane fra venstre panel). Den resulterende FRET effektivitet og stoichiometri kan visualiseres på samme måde (højre panel). (C) smFRET baner ved hjælp af Holliday krydset DNA-sensor. HBSS + 12 mM MgCl2 blev brugt som buffer under målingerne. Bortset fra den tilsyneladende acceptor blegning skridt nær sekvensen slutningen af disse eksempler, kan hyppigheden af FRET overgange for hver sensor bestemmes. Holliday-krydsene skifter deres kropsbygning med en høj frekvens, mens molekylær kraftsensoren ikke udviser FRET-overgange. Disse oplysninger gør det muligt at justere forsøgsbetingelserne, såsom forsinkelsen mellem rammerne, for at øge eller reducere antallet af observerede overgange. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverførsel; smFRET = enkeltmolekyle FRET; HBSS = Hanks afbalancerede saltopløsning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende information: Lokalisering og sporing af enkelte molekyler (01. Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Denne artikel præsenterer en metode til spatiotemporal analyse af mobile, enkelt-molekyle Förster resonans energioverførsel (smFRET)-baserede sonder ved hjælp af widefield fluorescens mikroskopi. Den nyudviklede software toolkit gør det muligt at afgøre smFRET tidsspor af bevægelige sonder, herunder den korrekte FRET-effektivitet og de molekylære positioner, som tidsfunktioner.

Automatiseret todimensionel Spatiotemporal Analyse af Mobile Enkeltmolekyle FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Enkeltmolekyle FRET-eksperimenter ved hjælp af overfladebundne sonder er blevet udført næsten udelukkende på immobiliserede molekyler i fortiden. Men mange biomolekyler diffuse og kan analyseres med vores metode. Ved at kombinere enkeltmolekyle FRET med sporing gør det muligt at analysere ikke kun FRET-mangeltidsspor af bevægelige sonder, men også at undersøge spatiotemporale aspekter som diffusionel adfærd.Vores metode er kompatibel med en række forskellige FRET-baserede sonder. For eksempel kan det give indsigt om molekylære kræfter, kropsbygningsdynamik og bindende kinetikere i levende celleeksperimenter. Fret-eksperimenter af høj kvalitet er notorisk svære at udføre.For pålidelig kvantificering er det vigtigt at registrere data med et godt signal-til-støj-forhold og enkeltmolekylespor af tilstrækkelig længde. For at begynde prøvemålingen skal du ophidse donoren og accepter fluorophores i en passende belysningstid, mens du udløser kameraet og venter, indtil kameraets udlæsning er aktiveret. Gentag excitation af donor og accepter fluorophores alternativt.Vælg antallet af gentagelser, der skal være stort nok til at sikre fotobleaching af mindst én fluorophore pr. sonde inden for synsfeltet, der tillader trinvis fotobleachinganalyse for at diskriminere enkeltmolekylesignaler fra aggregater. Angiv belysningssekvensen for at tillade valg af donor- og accepter excitationsrammer samt rammer til billedsegmentering fra optagede billedsekvenser. Analyser samtidig de datasæt, der er registreret ved hjælp af de samme belysningsindstillinger.Til dette formål skal du tildele et id og et mønster, der svarer til de respektive billedsekvensfilnavne, til hvert datasæt. Derudover definere specifikke datasæt til særlige formål såsom optagelser af fiducial markører til billedregistrering, excitation lys profiler til flad felt korrektion, og eventuelt donor-only og accepter-only prøver til at bestemme korrektion faktorer. Vælg derefter emissionskanaler og rå billeder, hvis begge kanaler optages ved hjælp af et enkelt kamera.Til dette skal du bruge den relevante grafiske widget til at vælge passende områder til donor- og accepteemission og derefter lokalisere fiducialmarkører i begge emissionskanaler og udføre billedregistrering. Brug den medfølgende brugergrænseflade til at finde de relevante parametre for lokaliseringsalgoritmen for både donor- og accepteremissionskanaler. Derefter indstilles enkeltmolekyle lokaliseringsparametre for FRET-sonder ved donor excitation i summen af de billeder, der er opnået fra donor- og acceptoremissioner, og derefter indstille lokaliseringsparametre for sonder ved acceptor excitation i acceptor emissionskanalen.Lokalisere FRET sonder på donor og acceptor excitation uafhængigt i alle rammer. Resultaterne flettes ind i én tabel, der indeholder det oprindelige rammenummer, todimensionelle koordinater og et id, der refererer til kildebilledfilen. Hvis du vil spore og måle fluorescensintensiteten, skal du vælge passende muligheder for Trackpy-algoritmen for at forbinde FRET-sonde localizations i baner.Ved hjælp af analysesoftwarefunktionen skal du derefter behandle ekstra billeddata fra billedsekvenser. Uddrag yderligere billeder, der er optaget for at lette segmentering markeret med S i excitationssekvensen. Endelig bestemme donor og acceptor excitation lys profiler på tværs af synsfeltet fra billeder optaget på en tæt mærket prøve.For de første filtreringstrin skal du kassere signaler med overlappende punktspredningsfunktioner, da det er vanskeligt at bestemme deres fluorescensintensiteter pålideligt. I tilfælde af inhomogen belysning skal du kun acceptere signaler, der er placeret i velbelyste områder inden for synsfeltet for at sikre et godt signal-til-støj-forhold. Hvis du studerer intramolekylær FRET, begrænse analysen til de baner til stede fra begyndelsen af billedet sekvens.Udfør derefter den flade feltkorrektion, som bruger excitationslyskildeprofilerne, der er opnået tidligere, til at vende de positionsafhængige fluorescensintensitetsvariationer forårsaget af inhomogen belysning, og derefter beregne den tilsyneladende FRET-effektivitet og den tilsyneladende stoichimetri. For at udføre trinvis analyse af fotobleaching til skelsbehandling mellem enkelte molekylære sonder og aggregater, finde passende parametre for ændringen punkt detektion algoritme på donor og accepter excitation uafhængigt. Udfør derefter algoritmen til registrering af ændringspunkt.Hvis du vil fjerne spor, der viser tvetydig fotobleachingadfærd, skal du definere intensitetstærskler, under hvilke en fluorophore betragtes som bleget, og derefter vælge en af følgende indstillinger. Mulighed et hvori acceptor fluorophore blegemidler i et enkelt trin, mens donoren viser ingen delvis blegning. Mulighed to hvori donor blegemidler i et enkelt trin, mens der ikke er nogen delvis acceptor blegning.Mulighed tre hvori enten fluorophore blegemidler i et enkelt trin, mens den anden ikke delvist blegemiddel. Og mulighed fire, hvori donor og acceptor fluorophores viser enkelt-trins photobleaching eller ingen photobleaching overhovedet. Beregn derefter korrektionsfaktorerne for donoremissionslækage i acceptorkanalen, direkte acceptor excitation, detektionseffektivitet og excitationseffektivitet.Dernæst skal du bruge korrektionsfaktorerne til at beregne FRET-effektivitet ud fra tilsyneladende effektivitet og stoichimetri fra tilsyneladende stoichimetri. For yderligere filtrering skal du kun vælge datapunkter fra før den første blegning begivenhed i hver bane. For at begrænse analysen til enkeltmolekylesonder accepteres derudover kun baner med mindst 75% af datapunkterne inden for de relevante stoichiometriske grænser.Udfør derefter billedsegmentering via globale eller adaptive tærskelmetoder på de relevante hjælpebilleder for at begrænse analysen til forskellige regioner inden for synsfeltet. Opret effektivitet versus stoichiometri plots for at kontrollere, at signaler om forkert stoichimetri er blevet korrekt identificeret og fjernet. Plot derefter histogrammer af FRET-effektivitet for at give et veletableret overblik over FRET-effektivitetsfordelinger og gruppere histogrammerne til bekvem sammenligning af resultater fra forskellige eksperimenter.Ved at drage fordel af videnskabelige Python-biblioteker er det muligt at evaluere dataene i notesbogen yderligere og udføre for eksempel diffusionsanalyse. Visualisering og sporing af enkeltmolekyle FRET-hændelse vises her. Filtrerede FRET-hændelser repræsenteres af effektivitet versus stoichimetriplotter i et FRET-effektivitets histogram.Desuden kan mobilitetsparametre undersøges ved at afbilde en individuel banesti i et XY-plot eller et gennemsnitligt kvadratforskydningsplot. Produktionen af vores platform giver os mulighed for yderligere at identificere overgange i FRET effektivitetstid spor af mobile sonder. For eksempel at evaluere kropslige ændringer af biomolekylerne.Ved hjælp af en FRET-baseret kraftsensor tillod analyseplatformen os at kvantificere krafthændelser med enkeltmolekyle i den immunologiske synapse under tidlig T-cellesignalering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed enkelt-molekyle Tving proteolyse målinger ved hjælp Magnetiske Pincetter

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Kvantitativ FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse for SENP1 Protease Kinetics Bestemmelse

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høj opløsning Spatiotemporal Analyse af receptor Dynamics ved Single-molekyle fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Single Molecule Fluorescens Mikroskopi på Planar Understøttet dobbeltlag

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Label-fri Single Molecule Detection Brug Microtoroid Optiske Resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Følsomme Påvisning af Proteopathic Seeding Aktivitet med FRET flowcytometri

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescens Recovery efter Sammenlægning en Droplet at Mål Todimensional Diffusion af et Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatiseret Sammentrækning Analyse af humant Engineered Heart Væv til Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...