Name: automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de projecten P30214-N36, P32307-B van het Oostenrijkse Wetenschapsfonds (FWF) en door het Vienna Science and Technology Fund (WWTF) LS13-030.

<ol>
	<li>McKinney, S. A., D&#233;clais, A. -. C., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+individual+holliday+junctions.">Structural dynamics of individual holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).</li><li>Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+potassium-channel+gating+revealed+by+single-molecule+FRET.">Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).</li><li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks.">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), 235 (2018).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).</li><li>Wu, P. G., Brand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonance+energy+transfer:+Methods+and+applications.">Resonance energy transfer: Methods and applications.</a> Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).</li><li>Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecular+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+measurement+on+structures+and+interactions+of+biomolecules.">Single-molecular f&#246;rster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules.</a> Micromachines. 12 (5), 492 (2021).</li><li>Malkusch, N., D&#246;rfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=smFRET+experiments+of+the+RNA+polymerase+II+transcription+initiation+complex.">smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex.</a> Methods. 120, 115-124 (2017).</li><li>Lee, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+views+of+MutS+on+mismatched+DNA.">Single-molecule views of MutS on mismatched DNA.</a> DNA repair. 20, 82-93 (2014).</li><li>Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microsecond+single-molecule+FRET+to+determine+the+assembly+pathways+of+T4+ssDNA+binding+protein+onto+model+DNA+replication+forks.">Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).</li><li>Deindl, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+conformational+dynamics+with+single-molecule+fluorescence+energy+transfer:+Applications+in+nucleosome+remodeling.">Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling.</a> Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).</li><li>Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+colocalization+FRET+evidence+that+spliceosome+activation+precedes+stable+approach+of+5'+splice+site+and+branch+site.">Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).</li><li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations.">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li><li>Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+kinesin+waits+between+steps.">How kinesin waits between steps.</a> Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).</li><li>G&#246;hring, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+analysis+of+T-cell+receptor-imposed+forces+via+quantitative+single+molecule+FRET+measurements.">Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements.</a> Nature Communications. 12 (1), 2502 (2021).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669 (2018).</li><li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-aided+molecule+sorting:+Analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li><li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells.">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).</li><li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules.">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).</li><li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation.">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li><li>Asher, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+imaging+of+GPCR+dimers+in+living+cells.">Single-molecule FRET imaging of GPCR dimers in living cells.</a> Nature Methods. 18 (4), 397-405 (2021).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy. (12), 1223-1237 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(excitation)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (excitation) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1189-1191 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(emission)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (emission) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1192-1194 (2012).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., van der Wel, C. M., Dimiduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft-matter/pims: PIMS v0.5. , (2020).</li><li>Anaconda Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Miniconda. , (2021).</li><li>conda-forge community. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The conda-forge project: community-based software distribution built on the conda package format and ecosystem. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> JupyterLab Contributors Notebooks - JupyterLab documentation. , (2021).</li><li>Babcock, H., Sigal, Y. M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-density+3D+localization+algorithm+for+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">A high-density 3D localization algorithm for stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Optical Nanoscopy. 1 (6), (2012).</li><li>Gao, Y., Kilfoil, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+detection+and+complete+tracking+of+large+populations+of+features+in+three+dimensions.">Accurate detection and complete tracking of large populations of features in three dimensions.</a> Optics Express. 17 (6), 4685 (2009).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> sdt-python: Python library for fluorescence microscopy data analysis (v17.1). , (2021).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nature Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li><li>Bradski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OpenCV+library.">The OpenCV library.</a> Dr. Dobb's Journal: Software Tools for the Professional Programmer. 25 (11), 120-123 (2000).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft-matter/trackpy:+Trackpy+v0.5.0.">Soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0.</a> Zenodo. , 4682814 (2021).</li><li>Killick, R., Fearnhead, P., Eckley, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+detection+of+changepoints+with+a+linear+computational+cost.">Optimal detection of changepoints with a linear computational cost.</a> Journal of the American Statistical Association. 107 (500), 1590-1598 (2012).</li><li>Schrangl, L., G&#246;hring, J., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+single+molecule+FRET+transitions+without+trajectories.">Kinetic analysis of single molecule FRET transitions without trajectories.</a> The Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123328 (2018).</li><li>Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+single-molecule+FRET+dynamics+with+probability+distribution+analysis.">Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis.</a> ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+analysis+software+(3.0).">Single-molecule FRET analysis software (3.0).</a> Zenodo. , (2021).</li><li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers.">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li><li>Platzer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unscrambling+fluorophore+blinking+for+comprehensive+cluster+detection+via+photoactivated+localization+microscopy.">Unscrambling fluorophore blinking for comprehensive cluster detection via photoactivated localization microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4993 (2020).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The molecular probes handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies. , (2010).</li><li>Szalai, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+energy+transfer+by+intensity-based+STED-FRET.">Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET.</a> Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+two-photon+probe+for+in+vivo+tracking+of+pH+during+a+traumatic+brain+injury+process.">A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process.</a> New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).</li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Dit artikel beschrijft een pijplijn voor de geautomatiseerde registratie en kwantitatieve analyse van smFRET-gegevens afkomstig van mobiele maar aan het oppervlak vastgebonden sondemoleculen. Het vormt een aanvulling op de twee overheersende benaderingen van smFRET-experimenten, waarbij ofwel oppervlakte-geïmmobiliseerde sondes of sondes diffunderen in oplossing in en uit een confocale excitatievolume17. Het biedt de juiste FRET-efficiëntie en de moleculaire posities als functie van de tijd. Het kan daarom worden gebruikt als input voor gespecialiseerde analyseprogramma's, bijvoorbeeld om overgangskinetiek1, FRET-histogrammen39 of tweedimensionale diffusie22 te kwantificeren.
De software wordt uitgebracht onder een gratis en open-source licentie die is goedgekeurd door het Open Source Initiative en die de gebruiker het eeuwigdurende recht op gratis gebruik, wijziging en herdistributie verleent. Github is gekozen als ontwikkelings- en distributieplatform om het zo gemakkelijk mogelijk te maken om de software te verkrijgen en deel te nemen aan het ontwikkelingsproces door bugs te melden of code40 bij te dragen. Geschreven in Python, is de software niet afhankelijk van propriëtaire componenten. De keuze voor Jupyter-notebooks als gebruikersinterfaces vergemakkelijkt de inspectie van gegevens bij elke analysestap en maakt het mogelijk om de pijplijn specifiek voor het experimentele systeem aan te passen en uit te breiden. De sdt-python library32 dient als basis en implementeert functionaliteit om fluorescentiemicroscopiegegevens te evalueren, zoals lokalisatie van één molecuul, diffusieanalyse, fluorescentie-intensiteitsanalyse, kleurkanaalregistratie, colocalisatieanalyse en ROI-verwerking.
In principe kan single-particle tracking worden uitgevoerd in een-, twee- of driedimensionale systemen. Hier werd de single-molecule analysepijplijn afgestemd op de studie van 2D mobiele systemen. Deze keuze weerspiegelt de beschikbaarheid van eenvoudige systemen, zoals planair ondersteunde lipide bilayers (SLBs), om mobiele fluorescerende sondes te presenteren. Dergelijke lipide dubbellaagssystemen zijn meestal samengesteld uit twee of meer fosfolipiden moieties, waarbij de bulkfractie de belangrijkste fysisch-chemische parameters van de SLB bepaalt (zoals fase en viscositeit), en de kleine fractie zorgt voor hechtingsplaatsen voor biomoleculen. Deze hechtingsplaatsen kunnen gebiotinyleerde fosfolipiden zijn voor op avidine of streptavidin gebaseerde eiwitplatforms of nikkel-NTA geconjugeerde fosfolipiden voor eiwitplatforms met histidinetags41. De keuze van het geschikte platform voor het koppelen van eiwitten aan de SLB hangt af van de wetenschappelijke vraag. Lezers kunnen de literatuur16,38,42 raadplegen voor voorbeelden van succesvol toegepaste strategieën. De dichtheid van sondes in het monster moet voldoende laag zijn om overlappende puntspreidingsfuncties te voorkomen; doorgaans worden minder dan 0,1 moleculen per μm2 aanbevolen. Zie de sectie representatieve resultaten (met name figuur 6) voor een voorbeeld met een geschikte sondedichtheid. De analysemethode is ook toepasbaar op enkele fluorescerend gelabelde eiwitmoleculen die diffunderen in het plasmamembraan van levende cellen.
Een cruciaal aspect van smFRET-experimenten is de productie en karakterisering van de FRET-sondes zelf. Bij het kiezen van fluoroforen voor een FRET-paar moet hun Förster-straal overeenkomen met de verwachte interkleurafstanden43. Kleurstoffen die bestand zijn tegen fotobleaching hebben de voorkeur omdat ze lange tijd sporen opleveren. Voor verhoogde bleeksnelheden kan echter één fluorofoorsoort worden gebruikt om multiemittergebeurtenissen afkomstig van geglokaliseerde moleculen te herkennen via stapsgewijze fotobleachinganalyse; zie stap 8.1.4 in de protocolsectie. Fluorofoorparen moeten plaatsspecifiek en covalent aan de betreffende moleculen worden bevestigd en intra- of intermoleculaire FRET-paren vormen.
Het combineren van smFRET met andere direct beschikbare technieken kan de ruimtelijke resolutie verhogen tot boven de diffractielimiet (via STED44). Het hier gepresenteerde smFRET-trackingalgoritme verbreedt de toepasbaarheid van de aanpak op nieuwe experimentele instellingen en modelsystemen. Dit omvat studies van (i) kinetische veranderingen in de stoichiometrie van mobiele biomoleculen, (ii) dynamische associatie van mobiele biomoleculen, (iii) de snelheid van enzymatische reacties van vrij diffunderende reactanten, en (iv) de kinetiek van conformationele veranderingen van mobiele biomoleculen. De eerste twee voorbeelden vereisen modelsystemen die intermoleculaire FRET laten zien, d.w.z. donor en acceptor worden geconjugeerd om biomoleculaire entiteiten van belang te scheiden. Deze laatste voorbeelden kunnen gebruik maken van biosensoren die donor en acceptor binnen dezelfde moleculaire entiteit dragen (intramoleculaire FRET).
Intramoleculaire FRET-gebaseerde sensoren kunnen inzicht geven in intrinsieke conformatieveranderingen van biomoleculen1,2,3,4, conformationele veranderingen veroorzaakt door endogene of externe krachtbelasting (moleculaire krachtsensoren16) of ionenconcentraties in de nano-omgeving zoals calcium45 en pH46 . Afhankelijk van het modelsysteem en het gewenste verankeringsplatform kunnen dergelijke smFRET-gebeurtenissen in 2D of 3D worden gevolgd: (i) planaire tracking van smFRET-gebeurtenissen kan worden gebruikt voor de kwantificering van receptor-ligandinteractietijden binnen een plasmamembraan, de associatie van membraan-verankerde signaalversterkingscascades en de stoichiometrieveranderingen van oppervlaktereceptoren; ii) volumetracking van smFRET-voorvallen kan worden gebruikt voor intra- of intermoleculaire FRET-sondes in levende cellen of in in vitro gereconstitueerde systemen.
De smFRET-trackingmethode is voornamelijk ontwikkeld met intramoleculaire FRET-sondes in gedachten. Deze sondes hebben een vast en bekend aantal fluorescerende labels, een feit dat werd gebruikt om gegevens van geagglomereerde en onjuist gesynthetiseerde (bijv. Onvolledig gelabelde) moleculen af te wijzen, evenals van sondes waar een van de fluoroforen is gefotobleekt. Door de filterstappen aan te passen, kan de methode echter ook worden toegepast op intermoleculaire FRET-sondes. In plaats van alleen moleculen met een enkele donor en een enkele acceptorfluoofoor te accepteren, zou men bijvoorbeeld de ruimtelijke trajecten van donor- en acceptorkleurstoffen kunnen onderzoeken en bijvoorbeeld kunnen selecteren voor co-diffusie van donor-acceptortrajecten.
Omdat het 3D-DAOSTORM-algoritme ondersteuning biedt voor het bepalen van de positie van een signaal langs de optische as via het astigmatisme als gevolg van een cilindrische lens in het emissiestraalpad, kunnen 3D-experimenten eenvoudig worden geïntegreerd in de analysepijplijn. In dit geval zou het acceptorsignaal bij acceptorexcitatie dienen om de stoichiometrie en de axiale positie te bepalen. De analysesoftware kan ook worden gebruikt om gegevens van experimenten met geïmmobiliseerde sondes te evalueren door gebruik te maken van de grote mate van automatisering en filterschema's. In feite werden smFRET-efficiëntiedatasets van Holliday-juncties geïmmobiliseerd op gel-fase bilayers38 geanalyseerd met behulp van een vroege versie van de software.

Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een belangrijke drijfveer geweest in moleculair biologisch en biofysisch onderzoek, omdat het het onderzoek van processen met sub-nanometer resolutie mogelijk maakt. Aangezien de efficiëntie van de energieoverdracht tussen donor- en acceptorfluooforen sterk afhangt van de inter-kleurstofafstand in het subnanometer-nanometer-nanometerbereik, is het effectief gebruikt als een spectroscopische liniaal om statische en dynamische conformatie van biomoleculen te onderzoeken1,2,3,4. Bovendien is het FRET-fenomeen op grote schaal gebruikt voor colocalisatiestudies van membraangeassocieerde en intracellulaire eiwitten op bulkniveau5,6. In de afgelopen twee decennia werd de methode aangepast voor het monitoren van smFRET-gebeurtenissen7, wat hielp om de temporele en ruimtelijke resolutie aanzienlijk te verhogen en zelfs zeldzame subpopulaties in heterogene monsters op te lossen. Uitgerust met deze technieken werden unieke inzichten verkregen in de dynamiek van moleculaire machines, zoals de transcriptverwerkingssnelheid van RNA-polymerase II8, replicatiesnelheid van DNA-polymerasen9,10, nucleosoomtranslocatiesnelheid11, transcriptsplitsing en stagnatiesnelheid van geassembleerde spliceosomen12, de activiteit van ribosomale subpopulaties13 en de loopsnelheid van kinesinemotoren14 , om er maar een paar te noemen. Receptor-ligand interactie duur15 en moleculaire krachten16 zijn gekwantificeerd.
Op intensiteit gebaseerde smFRET-studies vertrouwen doorgaans op gesensibiliseerde emissie om de FRET-efficiëntie te meten: een bundelsplitser in het emissiepad scheidt ruimtelijk licht afkomstig van donor- en acceptorfluooforen bij donorexcitatie, waardoor de kwantificering van individuele fluorescentie-intensiteiten mogelijk is. Het rendement kan vervolgens worden berekend als de fractie van fotonen die door de acceptor wordt uitgezonden ten opzichte van het totale aantal fotonen17. Bovendien maakt acceptor excitatie na donor excitatie (ALEX) het mogelijk om de stoichiometrie van de FRET-gebeurtenissen te meten, wat helpt bij het onderscheid tussen echte lage FRET-signalen van signalen die bijvoorbeeld voortkomen uit sondes met een fotogebleekte acceptorfluoofoor18.
Single-molecule FRET-experimenten worden vaak op twee manieren uitgevoerd. Eerst wordt een klein gebied in het monstervolume belicht met behulp van een confocale microscoop. Enkele sondemoleculen in oplossing worden opgewonden wanneer ze toevallig diffunderen binnen het focale volume. Met deze techniek kunnen snelle detectoren voor het tellen van fotonen worden gebruikt, waardoor een tijdresolutie van minder dan een microseconde mogelijk is. Ten tweede worden sondes specifiek geïmmobiliseerd op oppervlakken en bewaakt via widefield-microscopie, vaak met behulp van totale interne reflectie (TIR) -configuratie om achtergrondfluorescentie te minimaliseren. Probe immobilisatie zorgt voor veel langere opnametijden dan het gebruik van de eerste benadering. Bovendien maakt het grotere gezichtsveld het mogelijk om meerdere sondes parallel te bewaken. De behoefte aan een camera maakt deze methode traag in vergelijking met de hierboven beschreven methode. De tijdresolutie is beperkt tot het milliseconde tot tweede bereik.
Als lange tijdsporen nodig zijn, bijvoorbeeld voor het bestuderen van dynamische processen op een milliseconde tot tweede tijdschaal, is de eerste methode niet van toepassing, omdat de fluorescentie-uitbarstingen meestal te kort zijn. De tweede benadering faalt wanneer immobilisatie niet haalbaar is, bijvoorbeeld in live-celexperimenten met sondes die zich in het celmembraan verspreiden. Bovendien is waargenomen dat biologische modelsystemen hun respons dramatisch kunnen variëren, afhankelijk van de mobiliteit van het gecontacteerde oppervlak16.
Hoewel in het verleden gecombineerde smFRET- en single-particle tracking-experimenten met mobiele FRET-sondes zijn uitgevoerd19, is er geen openbaar beschikbare software voor de evaluatie van de gegevens. Dit leidde tot de ontwikkeling van een nieuw analyseplatform, dat de bepaling van meerdere eigenschappen van mobiele fluorescerende sondes mogelijk maakt, waaronder smFRET-efficiëntie en stoichiometrie, posities met subpixelnauwkeurigheid en fluorescentie-intensiteiten als functies van de tijd. Methoden voor het filteren van de resulterende sporen door stapsgewijs bleekgedrag, nearest-neighbor afstanden, emissie-intensiteiten en andere eigenschappen te onderzoeken, werden vastgesteld om uitsluitend correct gesynthetiseerde en functionele single-probe moleculen te kiezen. De software ondersteunt ook experimentele en analytische technieken die onlangs zijn overeengekomen in een multilaboratoriumstudie om betrouwbare, kwantitatieve smFRET-gegevens te produceren17. In het bijzonder houdt de implementatie zich aan de gevalideerde procedures voor de berekening van FRET-efficiëntie en stoichiometrie. Fluorescentie-intensiteiten bij donorexcitatie in het donoremissiekanaal IDD en het acceptoremissiekanaal IDA worden gebruikt voor de berekening van de schijnbare FRET-efficiëntie-Eapp met Eq (1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg"> (1)
Met behulp van de fluorescentie-intensiteit in het acceptoremissiekanaal bij acceptor-excitatie IAA wordt de schijnbare stoichiometrie berekend met behulp van Eq (2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg"> (2)
De FRET-efficiëntie E en de stoichiometrie S kunnen worden afgeleid van Eapp en Sapp door rekening te houden met vier correctiefactoren.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg">
α beschrijft de lekkage van donorfluorescentie in het acceptoremissiekanaal en kan worden bepaald met behulp van een monster dat alleen donorfluoroforen bevat of door delen van trajecten te analyseren waar de acceptor is gebleekt. δ corrigeert voor de directe excitatie van de acceptor door de donor excitatie lichtbron en kan worden gemeten met behulp van een monster met alleen acceptor fluoroforen of door het analyseren van delen van trajecten waar de donor is gebleekt.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg">.
γ schaalt de ID om divergerende detectie-efficiënties in donor- en acceptoremissiekanalen en verschillende kwantumefficiënties van de fluoroforen te corrigeren. De factor kan worden berekend door de toename van de donorintensiteit te analyseren bij het bleken van de acceptor in trajecten met hoge FRET-efficiëntie20 of door een monster met meerdere discrete FRET-toestanden te bestuderen.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg">
β schaalt IAA om te corrigeren voor ongelijksoortige efficiëntie van donor- en acceptorexcitatie. Als γ werd bepaald via een analyse van het bleken van de acceptor, kon β worden berekend uit een monster van de bekende donor-acceptorverhouding21. Anders levert de multi-state FRET-steekproef ook β op.
Samen maken de correcties het mogelijk om de gecorrigeerde FRET-efficiëntie te berekenen met behulp van Eq (3).
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg"> (3)
en de gecorrigeerde stoichiometrie met Eq (4).
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg"> (4)
Idealiter geeft de gecorrigeerde stoichiometrie voor een 1:1 donor-to-acceptor ratio S = 0,5. In de praktijk zorgt een verminderde signaal-ruisverhouding voor een spreiding van de gemeten waarden van S, waardoor de discriminatie van donor-only signalen (S = 1) en acceptor-only signalen (S = 0) wordt belemmerd. De resulterende tijdsporen kunnen worden gebruikt als input voor een meer gedetailleerde analyse van de trajecten met één molecuul om informatie te verkrijgen zoals spatiotemporale krachtprofielen16, de mobiliteit van de single-molecule events22 of overgangskinetiek tussen verschillende toestanden1.
Het volgende protocol beschrijft experimentele parameters en procedures voor smFRET-trackingexperimenten, evenals het werkingsprincipe achter data-analyse met behulp van de nieuw ontwikkelde softwaresuite. Voor het verzamelen van experimentele gegevens wordt aanbevolen om een microscopie-opstelling te gebruiken die aan de volgende vereisten voldoet: i) het vermogen om de emissie van enkele kleurstofmoleculen te detecteren; ii) widefieldverlichting: met name voor experimenten met levende cellen wordt een configuratie van de totale interne reflectie (TIR23,24,25) aanbevolen; iii) ruimtelijke scheiding van emissielicht volgens golflengte, zodat donor- en acceptorfluorescentie wordt geprojecteerd op verschillende regio's van dezelfde camerachip25 of verschillende camera's; iv) modulatie van lichtbronnen voor donor- en acceptorexcitatie met millisecondeprecisie, bijvoorbeeld met behulp van direct modulalabele lasers of modulatie via acousto-optische modulatoren. Dit maakt stroboscopische verlichting mogelijk om fotobleaching van fluoroforen te minimaliseren, evenals afwisselende excitatie om stoichiometrieën te bepalen; v) uitvoer van één bestand per opgenomen beeldreeks in een formaat dat kan worden gelezen door het PIMS Python-pakket26. In het bijzonder worden TIFF-bestanden met meerdere pagina's ondersteund.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790404P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945; Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1084-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer microscope body</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET570/60m</td>
			<td>donor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET675/50m</td>
			<td>acceptor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conda-forge</td>
			<td>conda-forge community</td>
			<td></td>
			<td>community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td>
			<td>MENZEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>FF640-FDi01-25&#215;36</td>
			<td>separation of donor and acceptor emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (quad band)</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>Di01-R405/488/532/635-25&#215;36</td>
			<td>separation of excitation and emission light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fret-analysis</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python package for smFRET data analysis; version 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11524766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBeam Smart 405-S 405 nm laser</td>
			<td>Toptica Photonics AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek chambers (8 wells)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177402PK</td>
			<td>for sample preparation and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenia Prime 532 nm laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniconda</td>
			<td>Anaconda Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Python 3 distribution. Min. version: 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20860 &#38; 20859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBIS 640 nm laser</td>
			<td>Coherent Inc</td>
			<td>1185055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optosplit II</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5253</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sdt-python</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python library for data analysis; version 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpek bead size kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T14792</td>
			<td>Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USC500TH Ultrasound bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>for SUV formation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes

Single-molecule Förster resonantie energieoverdracht (smFRET) is een veelzijdige techniek die rapporteert over afstanden in het sub-nanometer tot nanometer bereik. Het is gebruikt in een breed scala van biofysische en moleculair biologische experimenten, waaronder de meting van moleculaire krachten, karakterisering van conformatiedynamiek van biomoleculen, observatie van intracellulaire colocalisatie van eiwitten en bepaling van receptor-ligand interactietijden. In een widefield-microscopieconfiguratie worden experimenten meestal uitgevoerd met behulp van oppervlakte-geïmmobiliseerde sondes. Hier wordt een methode gepresenteerd die single-molecule tracking combineert met alternating excitation (ALEX) smFRET-experimenten, waardoor smFRET-tijdsporen van oppervlaktegebonden, maar mobiele probes in plasmamembranen of door glas ondersteunde lipide bilayers kunnen worden verkregen. Voor de analyse van geregistreerde gegevens werd een geautomatiseerde, open-source softwareverzameling ontwikkeld ter ondersteuning van (i) de lokalisatie van fluorescerende signalen, (ii) single-particle tracking, (iii) bepaling van FRET-gerelateerde grootheden inclusief correctiefactoren, (iv) strenge verificatie van smFRET-sporen en (v) intuïtieve presentatie van de resultaten. De gegenereerde gegevens kunnen gemakkelijk worden gebruikt als input voor verdere verkenning via gespecialiseerde software, bijvoorbeeld voor de beoordeling van het diffusionele gedrag van sondes of het onderzoek van FRET-overgangen.

Een verscheidenheid aan informatie op laag en hoog niveau kan worden geëxtraheerd uit smFRET-tracks, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag van het experiment. Hier worden voorbeelden gegeven van analysepijplijnen met analoge en digitale sondes: respectievelijk een op peptiden gebaseerde moleculaire krachtsensor16 en een DNA-sonde met stochastische schakeling van zijn conformatie38. Zie figuur 5 voor het ontwerp- en werkingsprincipe van deze sondes.
Nadat de lokalisatie- en trackingalgoritmen zijn uitgevoerd zoals beschreven in het protocol, biedt het pakket meerdere gegevensvisualisatietools om de initiële parameters en daaropvolgende filterstappen te optimaliseren: (i) visualisatie van individuele smFRET-gebeurtenissen, (ii) optionele beeldsegmentatie om gegevens in bepaalde interessegebieden te analyseren, (iii) monitoring van filterstappen via FRET-efficiëntie versus stoichiometrie (E-S) plots. De visualisatie van de single-molecule data is weergegeven in figuur 6.
Ten slotte worden de gefilterde FRET-gebeurtenissen weergegeven door een E-S-plot en een FRET-efficiëntiehistogram (figuur 4). De E-S plot is een handig hulpmiddel voor het optimaliseren van de bovengenoemde filterstappen en het onderzoeken van het eindresultaat. Gedeeltelijk gebleekte of onvolledig gelabelde FRET-sensoren kunnen worden uitgesloten door hun stoichiometriewaarde. Mobiliteitsparameters kunnen worden onderzocht door een individueel trajectpad uit te zetten in een x-y plot (figuur 6) of een gemiddelde vierkante verplaatsing (MSD) plot (figuur 4). De eerste methode is vooral nuttig voor het onderscheiden van mobiele van geïmmobiliseerde gebeurtenissen, terwijl de laatste wordt gebruikt om de diffusiecoëfficiënt te berekenen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> Figuur 4: Voorbeeldige output. (A) De FRET-efficiëntie wordt uitgezet versus stoichiometrie (E-S-plot) voor een populatie van de moleculaire krachtsensor (linkerpaneel) die een door glas ondersteunde lipide-bilaag versiert en wordt gespannen door een T-cel. Er is slechts één populatiewolk zichtbaar. Het respectievelijke histogram van FRET-efficiënties illustreert het verschil tussen een krachtsensorpopulatie in aan- en afwezigheid van cellen (middelste paneel). Er kan geen verschuiving naar lagere FRET-efficiëntie van de sensorpopulatie in aanwezigheid van T-cellen worden waargenomen, wat wijst op weinig tot geen krachtafhankelijke uitrekken van de sensormodule. De MSD-plot van deze experimentele omstandigheden bevestigt dat de krachtsensorpopulatie onder een T-cel aanzienlijk langzamer beweegt dan hun ongebonden tegenhangers (rechterpaneel). (B) Dezelfde analyse werd uitgevoerd met Holliday junction DNA-sensor die een door glas ondersteunde vloeibare lipide bilayer decoreerde. De E-S plot toont duidelijk twee populaties, die ook zichtbaar zijn in het FRET efficiëntie histogram. De MSD-plot geeft de aanwezigheid aan van één snel bewegende sensorpopulatie. Afkortingen: FRET = Förster resonantie energieoverdracht; MSD = gemiddelde vierkante verplaatsing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> Figuur 5: Ontwerp en werkingsprincipe van intramoleculaire FRET-sondes. (A) Analoge peptidesensor voor kwantificering van mechanische moleculaire krachten. De donor- en acceptorfluooforen zijn covalent bevestigd aan beide uiteinden van de peptide-ruggengraat. De sensormodule is plaatsspecifiek bevestigd aan een specifiek ligand, dat op zijn beurt een celbewonende oppervlaktereceptor van belang bindt (hier een antilichaamfragment dat specifiek de bètaketen van de T-celreceptor herkent). Bij receptor-ligandbinding wordt kracht uitgeoefend en de sensormodule strekt zich uit en deinst uiteindelijk terug na de splitsing van de binding. Dit paneel is aangepast van 16. (B) Digitale DNA-sensor voor kwantificering van FRET-overgangen. De FRET-sensor bestaat uit vier DNA-strengen die een Holliday-junctie vormen. De donor en acceptor fluorofoor zijn covalent bevestigd aan twee strengen. Holliday-juncties veranderen vaak hun bevleesdheid afhankelijk van de omringende bufferomstandigheden. De stochastische schakeling van deze conformaties kan worden bewaakt door de FRET-efficiëntie van individuele sondes te kwantificeren. Afkortingen: TCR = T cell receptor; FRET = Förster resonantie energieoverdracht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> Figuur 6: Voorbeelden van lokalisatie en tracking van FRET-sondes. (A) De FRET-efficiëntie en stoichiometrie van individuele gebeurtenissen worden berekend door de intensiteit van de donorfluoofoor bij donorexcitatie (D → D), de acceptorfluoofoor bij donorexcitatie (D → A) en de acceptorfluoofoor bij acceptorexcitatie (A → A) te kwantificeren. Nearest neighbor filtering voorkomt bias door overlappende puntspreidingsfuncties van dichte emitters. Beeldsegmentatie stelt de gebruiker in staat om bepaalde smFRET-gebeurtenissen te kiezen die gelokaliseerd zijn binnen een interessegebied (bijvoorbeeld een cel of een micropattern). Als voorbeeld van beeldsegmentatie werden T-cellen gekleurd met Fura-2 (links weergegeven) en onderworpen aan adaptieve drempels om de celranden te identificeren (oranje stippellijn). Schaalstaven = 5 μm. (B) smFRET-trajecten met behulp van de moleculaire krachtsensor. Individuele trajecten kunnen worden uitgezet in het x-y-vlak , waarbij hun diffusiegedrag en lokalisatie worden gevisualiseerd (linkerpaneel). Bovendien kunnen de intensiteiten van elk traject in de loop van de tijd worden uitgezet om FRET-overgangen of bleekstappen te identificeren (het middelste paneel toont het rode traject vanaf het linkerpaneel). De resulterende FRET-efficiëntie en stoichiometrie kunnen op dezelfde manier worden gevisualiseerd (rechterpaneel). (C) smFRET-trajecten met behulp van de Holliday junction DNA-sensor. HBSS + 12 mM MgCl2 werd gebruikt als buffer tijdens de metingen. Afgezien van de schijnbare acceptorbleekstap nabij het sequentie-einde van deze voorbeelden, kan de frequentie van FRET-overgangen voor elke sensor worden bepaald. De Holliday-juncties schakelen hun conformatie met een hoge frequentie, terwijl de moleculaire krachtsensor geen FRET-overgangen vertoont. Deze informatie maakt het mogelijk om de experimentele omstandigheden, zoals de vertraging tussen de frames, aan te passen om het aantal waargenomen overgangen te vergroten of te verminderen. Afkortingen: FRET = Förster resonantie energieoverdracht; smFRET = single-molecule FRET; HBSS = Hank's gebalanceerde zoutoplossing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende informatie: Lokalisatie en tracking van afzonderlijke moleculen (01. Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Dit artikel presenteert een methode voor spatiotemporale analyse van mobiele, single-molecule Förster resonantie energieoverdracht (smFRET)-gebaseerde probes met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie. De nieuw ontwikkelde softwaretoolkit maakt het mogelijk om smFRET-tijdsporen van bewegende sondes te bepalen, inclusief de juiste FRET-efficiëntie en de moleculaire posities, als functies van de tijd.

Geautomatiseerde tweedimensionale spatiotemporale analyse van mobiele fret-sondes met één molecuul

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Single-molecule FRET-experimenten met behulp van oppervlaktegebonden sondes zijn in het verleden bijna uitsluitend uitgevoerd op geïmmobiliseerde moleculen. Veel biomoleculen diffunderen echter en kunnen met onze methode worden geanalyseerd. Het combineren van single-molecule FRET met tracking maakt het mogelijk om niet alleen FRET-deficiëntietijdsporen van bewegende probes te analyseren, maar ook om spatiotemporale aspecten zoals het diffusiegedrag te onderzoeken.Onze methode is compatibel met een verscheidenheid aan verschillende FRET-gebaseerde sondes. Het zou bijvoorbeeld inzichten kunnen bieden over moleculaire krachten, conformatiedynamica en bindingskinetiek in levende celexperimenten. Hoogwaardige single-molecule FRET-experimenten zijn notoir moeilijk uit te voeren.Voor een betrouwbare kwantificering is het belangrijk om gegevens vast te leggen met een goede signaal-ruisverhouding en single-molecule tracks van voldoende lengte. Om de monstermeting te starten, prikkelt u de fluoroforen donor en accepter voor een geschikte verlichtingstijd terwijl u de camera activeert en wacht u totdat de camera-uitlezing is ingeschakeld. Herhaal de excitatie van de fluoroforen van de donor en accepter als alternatief.Kies het aantal herhalingen dat groot genoeg is om fotobleaching van ten minste één fluorofoor per sonde binnen het gezichtsveld te garanderen, waardoor stapsgewijze fotobleachinganalyse mogelijk is om signalen van één molecuul van aggregaten te onderscheiden. Geef de verlichtingsvolgorde op om de selectie van donor- en accepter-excitatieframes en frames voor beeldsegmentatie van opgenomen beeldreeksen mogelijk te maken. Analyseer tegelijkertijd de datasets die zijn opgenomen met dezelfde verlichtingsinstellingen.Wijs hiertoe een id en een patroon toe dat overeenkomt met de respectieve bestandsnamen van de afbeeldingsreeks aan elke gegevensset. Definieer daarnaast specifieke datasets voor speciale doeleinden, zoals opnames van fiduciële markers voor beeldregistratie, excitatielichtprofielen voor vlakke veldcorrectie en optioneel donor-only en accepter-only monsters om correctiefactoren te bepalen. Selecteer vervolgens emissiekanalen en RAW-beelden als beide kanalen zijn opgenomen met één camera.Gebruik hiervoor de juiste grafische widget om de juiste regio's voor donor- en accepteeremissie te selecteren, lokaliseer vervolgens fiduciale markers in beide emissiekanalen en voer beeldregistratie uit. Gebruik de meegeleverde gebruikersinterface om de juiste parameters te vinden voor het lokalisatiealgoritme voor zowel donor- als accepteeremissiekanalen. Stel vervolgens lokalisatieparameters met één molecuul in voor FRET-sondes bij donorexcitatie in de som van de beelden die zijn verkregen van donor- en acceptoremissies en stel vervolgens lokalisatieparameters in voor sondes bij acceptorexcitatie in het acceptoremissiekanaal.Lokaliseer de FRET-sondes onafhankelijk van elkaar op donor- en acceptorexcitatie in alle frames. De resultaten worden samengevoegd tot één tabel met het oorspronkelijke framenummer, tweedimensionale coördinaten en een id die verwijst naar het bronafbeeldingsbestand. Om de fluorescentie-intensiteit te volgen en te meten, kiest u geschikte opties voor het Trackpy-algoritme om FRET-sondelokalisaties in trajecten te koppelen.Vervolgens, met behulp van de analysesoftwarefunctionaliteit, verwerken van hulpbeeldgegevens van beeldreeksen. Extra opgenomen beelden extraheren om segmentatie gemarkeerd door S in de excitatiesequentie te vergemakkelijken. Bepaal ten slotte de donor- en acceptor-excitatielichtprofielen over het gezichtsveld van beelden die zijn opgenomen op een dicht gelabeld monster.Voor de eerste filterstappen moet u signalen met overlappende puntspreidingsfuncties weggooien, omdat het moeilijk is om hun fluorescentie-intensiteiten betrouwbaar te bepalen. In het geval van inhomogene verlichting, accepteer alleen signalen die zich in goed verlichte gebieden binnen het gezichtsveld bevinden om een goede signaal-ruisverhouding te garanderen. Als u intramoleculaire FRET bestudeert, beperk de analyse dan tot die trajecten die aanwezig zijn vanaf het begin van de beeldreeks.Voer vervolgens de vlakke veldcorrectie uit, die de eerder verkregen excitatielichtbronprofielen gebruikt om de positieafhankelijke fluorescentie-intensiteitsvariaties veroorzaakt door inhomogene verlichting om te keren en vervolgens de schijnbare FRET-efficiëntie en de schijnbare stoichiometrie te berekenen. Om stapsgewijze analyse van fotobleaching uit te voeren voor het onderscheid tussen enkele moleculaire sondes en aggregaten, vindt u geschikte parameters voor het veranderingspuntdetectiealgoritme bij donor- en accepterexcitatie onafhankelijk van elkaar. Voer vervolgens het wijzigingspuntdetectiealgoritme uit.Als u een spoor wilt verwijderen dat dubbelzinnig fotobleekend gedrag vertoont, definieert u intensiteitsdrempels waaronder een fluorofoor als gebleekt wordt beschouwd en selecteert u vervolgens een van de volgende opties. Optie één waarbij de acceptor fluorofoor in één stap bleekt terwijl de donor geen gedeeltelijke bleeking vertoont. Optie twee waarbij de donor in één stap bleekt terwijl er geen gedeeltelijke acceptorbleking is.Optie drie waarbij een van beide fluoroforen in één stap bleekt, terwijl de andere niet gedeeltelijk bleekt. En optie vier waarbij donor- en acceptorfluooforen eenstapsfotobleaching of helemaal geen fotobleaching vertonen. Bereken vervolgens de correctiefactoren voor donoremissielekkage in het acceptorkanaal, directe acceptorexcitatie, detectie-efficiëntie en excitatie-efficiëntie.Gebruik vervolgens de correctiefactoren om de FRET-efficiëntie te berekenen op basis van schijnbare efficiëntie en stoichiometrie op basis van schijnbare stoichiometrie. Voor verdere filtering selecteert u alleen gegevenspunten van vóór de eerste bleekgebeurtenis in elk traject. Bovendien, om de analyse te beperken tot sondes met één molecuul, accepteert u alleen trajecten met ten minste 75% van de gegevenspunten binnen de juiste stoichiometriegrenzen.Voer vervolgens beeldsegmentatie uit via globale of adaptieve drempelmethoden op de juiste hulpbeelden om de analyse te beperken tot verschillende gebieden in het gezichtsveld. Creëer efficiëntie versus stoichiometrie plots om te controleren of signalen van onjuiste stoichiometrie correct zijn geïdentificeerd en verwijderd. Plot vervolgens histogrammen van FRET-efficiënties om een goed vastgesteld overzicht van FRET-efficiëntieverdelingen te bieden en groepeer de histogrammen voor een gemakkelijke vergelijking van resultaten van verschillende experimenten.Door gebruik te maken van wetenschappelijke Python-bibliotheken is het mogelijk om de gegevens in het notitieblok verder te evalueren, bijvoorbeeld door diffusieanalyses uit te voeren. Visualisatie en tracking van single-molecule FRET-gebeurtenis worden hier getoond. Gefilterde FRET-gebeurtenissen worden weergegeven door efficiëntie versus stoichiometrieplots in een FRET-efficiëntiehistogram.Verder kunnen mobiliteitsparameters worden onderzocht door een individueel trajectpad uit te zetten in een XY-plot of een gemiddelde vierkante verplaatsingsplot. De output van ons platform stelt ons in staat om overgangen in FRET-efficiëntietijdsporen van mobiele sondes verder te identificeren. Bijvoorbeeld om conformationele veranderingen van de biomoleculen te evalueren.Met behulp van een FRET-gebaseerde krachtsensor stelde het analyseplatform ons in staat om krachtgebeurtenissen met één molecuul in de immunologische synaps te kwantificeren tijdens vroege T-celsignalering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Kwantitatieve FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse voor SENP1 Protease Kinetics Bepaling

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Label-free Single Molecule Detectie Met behulp microtoroıde optische resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Gevoelige detectie van Proteopathic Zaaien activiteit met FRET flowcytometrie

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescentie herstel na het samenvoegen van een druppel op de twee-dimensionale Verspreiding van een Phospholipid monolaag Meet

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Geautomatiseerde Contractie Analyse van Human Engineered hartweefsel voor Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...