Name: automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
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Ce travail a été soutenu par les projets P30214-N36, P32307-B du Fonds autrichien pour la science (FWF) et par le Fonds viennois pour la science et la technologie (WWTF) LS13-030.

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Cet article détaille un pipeline pour les enregistrements automatisés et l’analyse quantitative des données smFRET provenant de molécules de sonde mobiles mais attachées à la surface. Il complète les deux approches prédominantes des expériences smFRET, impliquant soit des sondes immobilisées en surface, soit des sondes diffusant en solution dans et hors d’un volume d’excitation confocale17. Il fournit l’efficacité FRET correcte et les positions moléculaires en fonction du temps. Il peut donc être utilisé comme entrée pour des programmes d’analyse spécialisés, par exemple pour quantifier la cinétique de transition1, les histogrammes FRET39 ou la diffusion bidimensionnelle22.
Le logiciel est publié sous une licence libre et open-source approuvée par l’Open Source Initiative qui accorde à l’utilisateur le droit perpétuel à l’utilisation, à la modification et à la redistribution gratuites. Github a été choisi comme plate-forme de développement et de distribution pour faciliter au maximum l’obtention du logiciel et la participation au processus de développement en signalant des bogues ou en contribuant au code40. Écrit en Python, le logiciel ne dépend pas de composants propriétaires. Le choix des ordinateurs portables Jupyter comme interfaces utilisateur facilite l’inspection des données à chaque étape d’analyse et permet d’adapter et d’étendre le pipeline spécifiquement pour le système expérimental en question. La bibliothèque sdt-python32 sert de base et implémente des fonctionnalités pour évaluer les données de microscopie à fluorescence, telles que la localisation d’une seule molécule, l’analyse de diffusion, l’analyse de l’intensité de fluorescence, l’enregistrement des canaux de couleur, l’analyse de colocalisation et la gestion du retour sur investissement.
En principe, le suivi d’une seule particule peut être effectué dans des systèmes unidimensionnels, bidimensionnels ou tridimensionnels. Ici, le pipeline d’analyse monomoléculaire a été adapté à l’étude des systèmes mobiles 2D. Ce choix reflète la disponibilité de systèmes simples, tels que les bicouches lipidiques (SLB) à support planaire, pour présenter des sondes fluorescentes mobiles. Ces systèmes de bicouches lipidiques sont généralement composés de deux fractions de phospholipides ou plus, où la fraction en vrac détermine les paramètres physico-chimiques clés du SLB (tels que la phase et la viscosité), et la fraction mineure fournit des sites de fixation pour les biomolécules. Ces sites de fixation peuvent être des phospholipides biotinylés pour les plateformes protéiques à base d’avidine ou de streptavidine ou des phospholipides conjugués nickel-NTA pour les plateformes protéiques avec des marqueurs histidine41. Le choix de la plate-forme appropriée pour relier les protéines au SLB dépend de la question scientifique. Les lecteurs peuvent se référer à la littérature16,38,42 pour des exemples de stratégies utilisées avec succès. La densité des sondes dans l’échantillon doit être suffisamment faible pour éviter le chevauchement des fonctions d’étalement ponctuel; typiquement, moins de 0,1 molécule par μm2 sont recommandés. Voir la section des résultats représentatifs (en particulier, la figure 6) pour un exemple montrant une densité de sonde appropriée. La méthode d’analyse est également applicable aux molécules de protéines marquées par fluorescence qui diffusent dans la membrane plasmique des cellules vivantes.
Un aspect critique des expériences smFRET est la production et la caractérisation des sondes FRET elles-mêmes. Lors du choix des fluorophores pour une paire FRET, leur rayon de Förster doit correspondre aux distances inter-colorants attendues43. Les colorants résistants au photoblanchiment sont préférés car ils donnent de longues traces temporelles. Cependant, pour des taux de blanchiment élevés, une espèce de fluorophore peut être utilisée pour reconnaître les événements multi-émetteurs provenant de molécules colocalisées par analyse de photoblanchiment par étapes; voir l’étape 8.1.4 dans la section protocole. Les paires de fluorophores doivent être attachées de manière covalente et spécifique au site aux molécules d’intérêt, formant des paires FRET intra- ou intermoléculaires.
La combinaison de smFRET avec d’autres techniques facilement disponibles peut augmenter sa résolution spatiale au-delà de la limite de diffraction (via STED44). L’algorithme de suivi smFRET présenté ici élargit l’applicabilité de l’approche à de nouveaux paramètres expérimentaux et systèmes modèles. Cela comprend des études sur (i) les changements cinétiques dans la stœchiométrie des biomolécules mobiles, (ii) l’association dynamique des biomolécules mobiles, (iii) le taux de réactions enzymatiques des réactifs à diffusion libre, et (iv) la cinétique des changements conformationnels des biomolécules mobiles. Les deux premiers exemples nécessitent des systèmes modèles qui montrent fret intermoléculaire, c’est-à-dire que le donneur et l’accepteur sont conjugués à des entités biomoléculaires distinctes d’intérêt. Ces derniers exemples peuvent utiliser des biocapteurs transportant donneur et accepteur au sein de la même entité moléculaire (FRET intramoléculaire).
Les capteurs intramoléculaires à base de FRET peuvent fournir un aperçu des changements conformationnels intrinsèques des biomolécules1,2,3,4, des changements conformationnels causés par une charge de force endogène ou externe (capteurs de force moléculaire16) ou des concentrations d’ions dans le nano-environnement tels que le calcium45 et le pH46 . Selon le système de modèle et la plate-forme d’ancrage préférée, ces événements smFRET peuvent être suivis en 2D ou en 3D: (i) le suivi planaire des événements smFRET peut être utilisé pour la quantification des temps d’interaction récepteur-ligand dans une membrane plasmique, l’association de cascades d’amplification du signal ancré dans la membrane et les changements stœchiométriques des récepteurs de surface; (ii) le suivi volumique des événements smFRET peut être utilisé pour toutes les sondes FRET intra- ou intermoléculaires dans des cellules vivantes ou dans des systèmes reconstitués in vitro.
La méthode de suivi smFRET a été développée principalement avec des sondes FRET intramoléculaires à l’esprit. Ces sondes comportent un nombre fixe et bien connu d’étiquettes fluorescentes, un fait qui a été exploité pour rejeter les données de molécules agglomérées et mal synthétisées (par exemple, incomplètement marquées), ainsi que de sondes où l’un des fluorophores a été photoblanchi. Cependant, en ajustant les étapes de filtrage, la méthode peut également être appliquée aux sondes FRET intermoléculaires. Par exemple, au lieu d’accepter uniquement des molécules comportant un seul donneur et un seul fluorophore accepteur, on pourrait examiner les trajectoires spatiales des colorants donneur et accepteur et sélectionner, par exemple, pour la co-diffusion des trajectoires donneur-accepteur.
Comme l’algorithme 3D-DAOSTORM prend en charge la détermination de la position d’un signal le long de l’axe optique via l’astigmatisme dû à une lentille cylindrique dans le chemin du faisceau d’émission, les expériences 3D pourraient être facilement intégrées dans le pipeline d’analyse. Dans ce cas, le signal d’accepteur lors de l’excitation de l’accepteur servirait à déterminer la stœchiométrie et la position axiale. Le logiciel d’analyse peut également être utilisé pour évaluer les données d’expériences comportant des sondes immobilisées en utilisant son grand degré d’automatisation et de filtrage. En fait, les ensembles de données d’efficacité smFRET des jonctions Holliday immobilisées sur des bicouches en phase gel38 ont été analysés à l’aide d’une première version du logiciel.

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) a été un moteur majeur de la recherche en biologie moléculaire et biophysique, car il permet d’étudier les processus à une résolution inférieure au nanomètre. Comme l’efficacité du transfert d’énergie entre les fluorophores donneurs et accepteurs dépend fortement de la distance inter-colorants dans la gamme sub-nanométrique à nanomètre, il a été efficacement utilisé comme règle spectroscopique pour explorer la conformation statique et dynamique des biomolécules1,2,3,4. De plus, le phénomène FRET a été largement utilisé pour les études de colocalisation des protéines membranaires et intracellulaires à un niveau global5,6. Au cours des deux dernières décennies, la méthode a été adaptée pour surveiller les événements smFRET7, ce qui a permis d’augmenter considérablement la résolution temporelle et spatiale et de résoudre même des sous-populations rares dans des échantillons hétérogènes. Grâce à ces techniques, des connaissances uniques ont été acquises sur la dynamique de la machinerie moléculaire, telles que le taux de traitement des transcriptions de l’ARN polymérase II8, la vitesse de réplication des ADN polymérases9,10, le taux de translocation des nucléosomes11, le taux d’épissage et de décrochage des épissures de transcription des spliceosomes assemblés12, l’activité des sous-populations ribosomiques13 et la vitesse de marche des moteurs de kinésine14 , pour n’en nommer que quelques-uns. Les durées d’interaction récepteur-ligand15 et les forces moléculaires16 ont été quantifiées.
Les études smFRET basées sur l’intensité s’appuient généralement sur une émission sensibilisée pour mesurer l’efficacité fret : un séparateur de faisceau dans le chemin d’émission sépare spatialement la lumière provenant des fluorophores donneurs et accepteurs lors de l’excitation du donneur, ce qui permet de quantifier les intensités de fluorescence individuelles. L’efficacité peut ensuite être calculée comme la fraction de photons émise par l’accepteur par rapport au nombre total de photons17. En outre, l’excitation de l’accepteur après l’excitation du donneur (ALEX) permet de mesurer la stœchiométrie des événements FRET, ce qui contribue à la discrimination entre les signaux FRET faibles réels provenant de signaux provenant, par exemple, de sondes dotées d’un fluorophore accepteur photoblanchi18.
Les expériences FRET à molécule unique sont généralement menées de deux manières. Tout d’abord, une petite région du volume de l’échantillon est éclairée à l’aide d’un microscope confocal. Les molécules à sonde unique en solution sont excitées lorsqu’elles diffusent dans le volume focal. Avec cette technique, des détecteurs à comptage rapide de photons peuvent être utilisés, permettant une résolution temporelle inférieure à la microseconde. Deuxièmement, les sondes sont spécifiquement immobilisées sur les surfaces et surveillées par microscopie à grand champ, souvent en utilisant une configuration de réflexion interne totale (TIR) pour minimiser la fluorescence de fond. L’immobilisation de la sonde permet des temps d’enregistrement beaucoup plus longs que l’utilisation de la première approche. De plus, le plus grand champ de vision permet la surveillance de plusieurs sondes en parallèle. Le besoin d’une caméra rend cette méthode lente par rapport à celle décrite ci-dessus. La résolution temporelle est limitée à la plage de milliseconde à seconde.
Si de longues traces temporelles sont nécessaires, par exemple pour étudier des processus dynamiques sur une échelle de temps de milliseconde à seconde, la première méthode n’est pas applicable, car les sursauts de fluorescence sont généralement trop courts. La deuxième approche échoue lorsque l’immobilisation n’est pas possible, par exemple dans des expériences sur des cellules vivantes mettant en vedette des sondes diffusant dans la membrane cellulaire. En outre, il a été observé que les systèmes modèles biologiques peuvent varier considérablement leur réponse en fonction de la mobilité de la surface contactée16.
Bien que des expériences combinées de suivi smFRET et d’une seule particule enregistrant des sondes FRET mobiles aient été réalisées dans le passé19, il n’existe aucun logiciel accessible au public pour l’évaluation des données. Cela a incité au développement d’une nouvelle plate-forme d’analyse, qui permet de déterminer de multiples propriétés des sondes fluorescentes mobiles, y compris l’efficacité smFRET et la stœchiométrie, les positions avec une précision inférieure au pixel et les intensités de fluorescence en fonction du temps. Des méthodes de filtrage des traces résultantes en examinant le comportement de blanchiment par étapes, les distances du plus proche voisin, les intensités d’émission et d’autres traits ont été établies pour choisir exclusivement des molécules mono-sonde correctement synthétisées et fonctionnelles. Le logiciel prend également en charge les techniques expérimentales et analytiques récemment convenues dans le cadre d’une étude multilaboratoire visant à produire des données smFRET quantitatives fiables17. En particulier, la mise en œuvre respecte les procédures validées pour le calcul de l’efficacité FRET et de la stœchiométrie. Les intensités de fluorescence lors de l’excitation du donneur dans l’IDD du canal d’émission du donneur et le canal d’émission de l’accepteur IDA sont utilisées pour le calcul de l’efficacité FRET apparente Eapp en utilisant Eq (1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg"> (1)
À l’aide de l’intensité de fluorescence dans le canal d’émission de l’accepteur lors de l’excitation de l’accepteur IAA, la stœchiométrie apparente est calculée à l’aide de Eq (2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg"> (2)
L’efficacité FRET E et la stœchiométrie S peuvent être dérivées d’Eapp et de Sapp en tenant compte de quatre facteurs de correction.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg">
α décrit la fuite de fluorescence du donneur dans le canal d’émission de l’accepteur et peut être déterminée à l’aide d’un échantillon contenant uniquement des fluorophores donneurs ou en analysant des parties de trajectoires où l’accepteur a été blanchi. δ corrige l’excitation directe de l’accepteur par la source lumineuse d’excitation du donneur et peut être mesurée à l’aide d’un échantillon avec uniquement des fluorophores accepteurs ou en analysant des parties de trajectoires où le donneur a été blanchi.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg">.
γ met à l’échelle l’IDD pour rectifier les rendements de détection divergents dans les canaux d’émission donneur et accepteur et les différentes efficacités quantiques des fluorophores. Le facteur peut être calculé en analysant l’augmentation de l’intensité du donneur lors du blanchiment de l’accepteur dans des trajectoires à haut rendement FRET20 ou en étudiant un échantillon présentant plusieurs états FRET discrets.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg">
β met à l’échelle l’IAA pour corriger les efficacités disparates de l’excitation du donneur et de l’accepteur. Si γ était déterminée par une analyse de blanchiment de l’accepteur, β pouvait être calculée à partir d’un échantillon de rapport donneur-accepteur connu21. Sinon, l’échantillon FRET multi-états donne également β.
Ensemble, les corrections permettent de calculer l’efficacité FRET corrigée à l’aide de Eq (3).
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg"> (3)
et la stœchiométrie corrigée à l’aide de Eq (4).
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg"> (4)
Idéalement, la stœchiométrie corrigée pour un rapport donneur-accepteur de 1:1 donne S = 0,5. En pratique, un rapport signal/bruit réduit produit une répartition des valeurs mesurées de S, ce qui entrave la discrimination entre les signaux du donneur uniquement (S = 1) et les signaux de l’accepteur uniquement (S = 0). Les traces temporelles résultantes peuvent être utilisées comme entrée pour une analyse plus détaillée des trajectoires d’une seule molécule afin d’obtenir des informations telles que les profils de force spatio-temporelle16, la mobilité des événements à molécule unique22 ou la cinétique de transition entre différents états1.
Le protocole suivant décrit les paramètres expérimentaux et les procédures pour les expériences de suivi smFRET, ainsi que le principe de fonctionnement de l’analyse des données à l’aide de la suite logicielle nouvellement développée. Pour l’acquisition de données expérimentales, il est recommandé d’utiliser une installation de microscopie répondant aux exigences suivantes: i) capacité de détecter l’émission de molécules de colorant uniques; ii) éclairage grand champ: en particulier pour les expériences sur cellules vivantes, la configuration par réflexion interne totale (TIR23,24,25) est recommandée; iii) séparation spatiale de la lumière d’émission en fonction de la longueur d’onde telle que la fluorescence du donneur et de l’accepteur soit projetée sur différentes régions de la même puce de caméra25 ou sur différentes caméras; iv) modulation des sources lumineuses pour l’excitation du donneur et de l’accepteur avec une précision de l’ordre de la milliseconde, par exemple, à l’aide de lasers directement modulables ou modulation via des modulateurs acousto-optiques. Cela permet un éclairage stroboscopique pour minimiser le photoblanchiment des fluorophores ainsi qu’une excitation alternée pour déterminer les stœchiométries; v) sortie d’un fichier par séquence d’images enregistrée dans un format qui peut être lu par le package Python PIMS26. En particulier, les fichiers TIFF multipages sont pris en charge.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790404P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945; Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1084-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer microscope body</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET570/60m</td>
			<td>donor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET675/50m</td>
			<td>acceptor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conda-forge</td>
			<td>conda-forge community</td>
			<td></td>
			<td>community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td>
			<td>MENZEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>FF640-FDi01-25&#215;36</td>
			<td>separation of donor and acceptor emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (quad band)</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>Di01-R405/488/532/635-25&#215;36</td>
			<td>separation of excitation and emission light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fret-analysis</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python package for smFRET data analysis; version 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11524766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBeam Smart 405-S 405 nm laser</td>
			<td>Toptica Photonics AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek chambers (8 wells)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177402PK</td>
			<td>for sample preparation and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenia Prime 532 nm laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniconda</td>
			<td>Anaconda Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Python 3 distribution. Min. version: 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20860 &#38; 20859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBIS 640 nm laser</td>
			<td>Coherent Inc</td>
			<td>1185055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optosplit II</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5253</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sdt-python</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python library for data analysis; version 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpek bead size kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T14792</td>
			<td>Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USC500TH Ultrasound bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>for SUV formation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes

Le transfert d’énergie par résonance Förster à molécule unique (smFRET) est une technique polyvalente qui rend compte des distances de l’ordre du nanomètre au nanomètre. Il a été utilisé dans un large éventail d’expériences biophysiques et de biologie moléculaire, y compris la mesure des forces moléculaires, la caractérisation de la dynamique conformationnelle des biomolécules, l’observation de la colocalisation intracellulaire des protéines et la détermination des temps d’interaction récepteur-ligand. Dans une configuration de microscopie à grand champ, les expériences sont généralement effectuées à l’aide de sondes immobilisées en surface. Ici, une méthode combinant le suivi d’une seule molécule avec des expériences smFRET à excitation alternée (ALEX) est présentée, permettant l’acquisition de traces temporelles smFRET de sondes liées à la surface, mais mobiles dans des membranes plasmiques ou des bicouches lipidiques supportées par du verre. Pour l’analyse des données enregistrées, une collection logicielle automatisée et open source a été développée pour soutenir (i) la localisation des signaux fluorescents, (ii) le suivi des particules uniques, (iii) la détermination des quantités liées aux FRET, y compris les facteurs de correction, (iv) la vérification rigoureuse des traces smFRET et (v) la présentation intuitive des résultats. Les données générées peuvent facilement être utilisées comme entrée pour une exploration ultérieure via un logiciel spécialisé, par exemple pour l’évaluation du comportement de diffusion des sondes ou l’étude des transitions FRET.

Une variété d’informations de bas et de haut niveau peuvent être extraites des pistes smFRET en fonction de la question scientifique de l’expérience. Ici, des exemples de pipelines d’analyse avec des sondes analogiques et numériques sont présentés: un capteur de force moléculaire à base de peptide16 et une sonde à ADN avec commutation stochastique de sa conformation38, respectivement. Reportez-vous à la Figure 5 pour connaître la conception et le principe de fonctionnement de ces sondes.
Une fois les algorithmes de localisation et de suivi exécutés comme décrit dans le protocole, le package offre plusieurs outils de visualisation de données pour optimiser les paramètres initiaux et les étapes de filtrage suivantes: (i) visualisation des événements smFRET individuels, (ii) segmentation d’image facultative pour analyser les données dans certaines régions d’intérêt, (iii) surveillance des étapes de filtrage via des graphiques d’efficacité FRET vs stœchiométrie (E-S). La visualisation des données d’une seule molécule est présentée à la figure 6.
Enfin, les événements FRET filtrés sont représentés par un diagramme E-S et un histogramme d’efficacité FRET (Figure 4). Le tracé E-S est un outil utile pour optimiser les étapes de filtrage susmentionnées et étudier le résultat final. Les capteurs FRET partiellement blanchis ou incomplètement étiquetés peuvent être exclus par leur valeur stœchiométrique. Les paramètres de mobilité peuvent être étudiés en traçant une trajectoire individuelle dans un diagramme x-y (figure 6) ou un diagramme de déplacement carré moyen (MSD) (figure 4). La première méthode est particulièrement utile pour distinguer les événements mobiles des événements immobilisés, tandis que la seconde est utilisée pour calculer le coefficient de diffusion.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> Figure 4 : Rendement exemplaire. (A) L’efficacité FRET est tracée par rapport à la stœchiométrie (diagramme E-S) pour une population du capteur de force moléculaire (panneau de gauche) décorant une bicouche lipidique supportée par du verre et tendue par une cellule T. Un seul nuage de population est visible. L’histogramme respectif des efficacités FRET illustre la différence entre une population de capteurs de force en présence et en l’absence de cellules (panneau du milieu). Aucun changement vers des rendements FRET plus faibles de la population de capteurs en présence de lymphocytes T ne peut être observé, ce qui indique peu ou pas d’étirement dépendant de la force du module de capteur. Le diagramme MSD de ces conditions expérimentales confirme que la population de capteurs de force sous une cellule T se déplace considérablement plus lentement que leurs homologues non liés (panneau de droite). (B) La même analyse a été effectuée avec un capteur d’ADN de jonction Holliday décorant une bicouche lipidique fluide supportée par du verre. Le graphique E-S montre clairement deux populations, qui sont également apparentes dans l’histogramme d’efficacité FRET. Le diagramme MSD indique la présence d’une population de capteurs en mouvement rapide. Abréviations : FRET = transfert d’énergie de résonance de Förster ; MSD = déplacement carré moyen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> Figure 5: Conception et principe de fonctionnement des sondes FRET intramoléculaires. (A) Capteur peptidique analogique pour la quantification des forces moléculaires mécaniques. Les fluorophores donneurs et accepteurs sont attachés de manière covalente à chaque extrémité de l’épine dorsale peptidique. Le module de capteur est spécifiquement attaché à un ligand spécifique, qui à son tour lie un récepteur de surface résident dans la cellule d’intérêt (ici, un fragment d’anticorps reconnaissant spécifiquement la chaîne bêta du récepteur des cellules T). Lors de la liaison récepteur-ligand, une force est exercée et le module de capteur s’étend et finit par reculer après le clivage de la liaison. Ce panneau est modifié à partir de 16. (B) Capteur d’ADN numérique pour la quantification des transitions FRET. Le capteur FRET est composé de quatre brins d’ADN formant une jonction Holliday. Le fluorophore donneur et l’accepteur sont attachés de manière covalente à deux brins. Les jonctions Holliday changent fréquemment de conformation en fonction des conditions tampons environnantes. La commutation stochastique de ces conformations peut être surveillée en quantifiant l’efficacité FRET des sondes individuelles. Abréviations : TCR = récepteur des lymphocytes T; FRET = Transfert d’énergie de résonance de Förster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> Figure 6 : Exemples de localisation et de suivi des sondes FRET. (A) L’efficacité FRET et la stœchiométrie des événements individuels sont calculées en quantifiant l’intensité du fluorophore donneur lors de l’excitation du donneur (D → D), du fluorophore accepteur lors de l’excitation du donneur (D → A) et du fluorophore accepteur lors de l’excitation de l’accepteur (A → A). Le filtrage du plus proche voisin empêche les biais en chevauchant les fonctions d’étalement ponctuel des émetteurs proches. La segmentation d’image permet à l’utilisateur de choisir certains événements smFRET localisés dans une zone d’intérêt (par exemple, une cellule ou un micromotif). À titre d’exemple de segmentation d’image, les lymphocytes T ont été colorés avec Fura-2 (affiché à gauche) et soumis à un seuil adaptatif pour identifier les bords de la cellule (ligne pointillée orange). Barres d’échelle = 5 μm. (B) trajectoires smFRET à l’aide du capteur de force moléculaire. Les trajectoires individuelles peuvent être tracées dans le plan x-y, en visualisant leur comportement de diffusion et leur localisation (panneau de gauche). De plus, les intensités de chaque trajectoire peuvent être tracées au fil du temps pour identifier les transitions FRET ou les étapes de blanchiment (le panneau du milieu montre la trajectoire rouge à partir du panneau de gauche). L’efficacité FRET et la stœchiométrie résultantes peuvent être visualisées de la même manière (panneau de droite). (C) trajectoires smFRET à l’aide du capteur d’ADN de jonction Holliday. HBSS + 12 mM MgCl2 a été utilisé comme tampon pendant les mesures. Outre l’étape apparente de blanchiment de l’accepteur vers la fin de la séquence de ces exemples, la fréquence des transitions FRET pour chaque capteur peut être déterminée. Les jonctions Holliday changent leur conformation avec une fréquence élevée, tandis que le capteur de force moléculaire ne présente pas de transitions FRET. Ces informations permettent d’ajuster les conditions expérimentales, comme le délai entre les trames, pour augmenter ou réduire le nombre de transitions observées. Abréviations : FRET = transfert d’énergie de résonance de Förster ; smFRET = FRET monomoléculaire; HBSS = solution saline équilibrée de Hank. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Informations supplémentaires : Localisation et suivi de molécules uniques (01. Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Cet article présente une méthode d’analyse spatio-temporelle de sondes mobiles à transfert d’énergie de résonance de Förster (smFRET) à molécule unique utilisant la microscopie à fluorescence à grand champ. La boîte à outils logicielle nouvellement développée permet de déterminer les traces temporelles smFRET des sondes en mouvement, y compris l’efficacité FRET correcte et les positions moléculaires, en tant que fonctions du temps.

Analyse spatio-temporelle bidimensionnelle automatisée de sondes FRET mobiles à molécule unique

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Des expériences FRET à molécule unique utilisant des sondes liées à la surface ont été réalisées presque exclusivement sur des molécules immobilisées dans le passé. Cependant, de nombreuses biomolécules diffusent et peuvent être analysées avec notre méthode. La combinaison de FRET à molécule unique avec le suivi permet d’analyser non seulement les traces temporelles de déficit FRET des sondes en mouvement, mais également d’étudier les aspects spatio-temporels tels que le comportement de diffusion.Notre méthode est compatible avec une variété de sondes à base de FRET. Par exemple, il pourrait fournir des informations sur les forces moléculaires, la dynamique conformationnelle et la cinétique de liaison dans les expériences sur des cellules vivantes. Les expériences FRET monomoléculaires de haute qualité sont notoirement difficiles à réaliser.Pour une quantification fiable, il est important d’enregistrer les données à un bon rapport signal/bruit et des pistes à molécule unique d’une longueur suffisante. Pour commencer la mesure de l’échantillon, excitez le donneur et acceptez les fluorophores pendant un temps d’éclairage approprié tout en déclenchant la caméra et attendez que la lecture de la caméra soit activée. Répétez l’excitation du donneur et acceptez les fluorophores alternativement.Choisissez le nombre de répétitions suffisamment important pour assurer le photoblanchiment d’au moins un fluorophore par sonde dans le champ de vision, ce qui permet une analyse de photoblanchiment par étapes pour distinguer les signaux d’une seule molécule des agrégats. Spécifiez la séquence d’éclairage pour permettre la sélection des images d’excitation du donneur et de l’accepteur ainsi que des images pour la segmentation d’image à partir de séquences d’images enregistrées. Simultanément, analysez les jeux de données enregistrés en utilisant les mêmes paramètres d’éclairage.À cette fin, attribuez un identificateur et un modèle qui correspondent aux noms de fichiers de séquence d’images respectifs à chaque jeu de données. En outre, définissez des ensembles de données spécifiques à des fins spéciales, telles que des enregistrements de marqueurs fiducaux pour l’enregistrement d’images, des profils lumineux d’excitation pour la correction de champ plat et, éventuellement, des échantillons de donneur uniquement et d’acceptation uniquement pour déterminer les facteurs de correction. Ensuite, sélectionnez les canaux d’émission et les images brutes si les deux canaux sont enregistrés à l’aide d’une seule caméra.Pour cela, utilisez le widget graphique approprié pour sélectionner les régions appropriées pour l’émission du donneur et de l’accepteur, puis localisez les marqueurs fiduciaires dans les deux canaux d’émission et effectuez l’enregistrement de l’image. Utilisez l’interface utilisateur fournie pour trouver les paramètres appropriés pour l’algorithme de localisation des canaux d’émission donneur et accepteur. Ensuite, définissez les paramètres de localisation d’une seule molécule pour les sondes FRET lors de l’excitation du donneur dans la somme des images obtenues à partir des émissions du donneur et de l’accepteur, puis définissez les paramètres de localisation des sondes lors de l’excitation de l’accepteur dans le canal d’émission de l’accepteur.Localisez les sondes FRET sur l’excitation du donneur et de l’accepteur indépendamment dans toutes les trames. Les résultats sont fusionnés en un seul tableau qui contient le numéro d’image d’origine, les coordonnées bidimensionnelles et un identificateur faisant référence au fichier image source. Pour suivre et mesurer l’intensité de fluorescence, choisissez les options appropriées pour l’algorithme Trackpy afin de lier les localisations de sonde FRET aux trajectoires.Ensuite, à l’aide de la fonctionnalité du logiciel d’analyse, traitez les données d’image auxiliaires à partir de séquences d’images. Extrayez des images supplémentaires enregistrées pour faciliter la segmentation marquée par S dans la séquence d’excitation. Enfin, déterminez les profils lumineux d’excitation du donneur et de l’accepteur dans le champ de vision à partir d’images enregistrées sur un échantillon densément étiqueté.Pour les étapes initiales de filtrage, éliminez les signaux dont les fonctions d’étalement ponctuel se chevauchent, car il est difficile de déterminer de manière fiable leurs intensités de fluorescence. Dans le cas d’un éclairage inhomogène, n’acceptez que les signaux situés dans des régions bien éclairées du champ de vision afin d’assurer un bon rapport signal/bruit. Si vous étudiez le FRET intramoléculaire, limitez l’analyse aux trajectoires présentes dès le début de la séquence d’images.Ensuite, exécutez la correction de champ plat, qui utilise les profils de source lumineuse d’excitation obtenus précédemment pour inverser les variations d’intensité de fluorescence dépendantes de la position causées par un éclairage inhomogène, puis calculez l’efficacité FRET apparente et la stœchiométrie apparente. Pour effectuer une analyse par étapes du photoblanchiment pour discriminer entre les sondes moléculaires uniques et les agrégats, trouver des paramètres appropriés pour l’algorithme de détection du point de changement sur l’excitation du donneur et de l’accepteur indépendamment. Exécutez ensuite l’algorithme de détection des points de changement.Pour supprimer la trace montrant un comportement ambigu de photoblanchiment, définissez des seuils d’intensité en dessous desquels un fluorophore est considéré comme blanchi, puis sélectionnez l’une des options suivantes. Première option dans laquelle l’accepteur fluorophore blanchit en une seule étape tandis que le donneur ne montre aucun blanchiment partiel. Deuxième option dans laquelle le donneur blanchit en une seule étape alors qu’il n’y a pas de blanchiment partiel de l’accepteur.Troisième option dans laquelle l’un ou l’autre fluorophore blanchit en une seule étape tandis que l’autre ne blanchit pas partiellement. Et la quatrième option dans laquelle les fluorophores donneurs et accepteurs montrent un photoblanchiment en une seule étape ou pas de photoblanchiment du tout. Calculez ensuite les facteurs de correction pour la fuite d’émission du donneur dans le canal accepteur, l’excitation directe de l’accepteur, les efficacités de détection et les efficacités d’excitation.Ensuite, utilisez les facteurs de correction pour calculer l’efficacité FRET à partir de l’efficacité apparente et la stœchiométrie à partir de la stœchiométrie apparente. Pour un filtrage plus poussé, sélectionnez uniquement les points de données avant le premier événement de blanchiment dans chaque trajectoire. De plus, pour limiter l’analyse aux sondes à molécule unique, n’acceptez que les trajectoires avec au moins 75% des points de données dans les limites de stœchiométrie appropriées.Effectuez ensuite une segmentation d’image via des méthodes de seuilage globales ou adaptatives sur les images auxiliaires appropriées pour limiter l’analyse à des régions distinctes dans le champ de vision. Créez des diagrammes d’efficacité par rapport à la stœchiométrie pour vérifier que les signaux de stœchiométrie incorrecte ont été correctement identifiés et supprimés. Ensuite, tracez les histogrammes des efficacités FRET pour fournir une vue d’ensemble bien établie des distributions d’efficacité FRET et regroupez les histogrammes pour une comparaison pratique des résultats de différentes expériences.En tirant parti des bibliothèques python scientifiques, il est possible d’évaluer davantage les données dans le bloc-notes, en effectuant, par exemple, une analyse de diffusion. La visualisation et le suivi de l’événement FRET à molécule unique sont présentés ici. Les événements FRET filtrés sont représentés par des diagrammes d’efficacité par rapport aux stœchiométries dans un histogramme d’efficacité FRET.En outre, les paramètres de mobilité peuvent être étudiés en traçant un chemin de trajectoire individuel dans un diagramme XY ou un diagramme de déplacement carré moyen. La sortie de notre plate-forme nous permet d’identifier davantage les transitions dans les traces temporelles d’efficacité FRET des sondes mobiles. Par exemple, pour évaluer les changements conformationnels des biomolécules.À l’aide d’un capteur de force basé sur FRET, la plate-forme d’analyse nous a permis de quantifier les événements de force d’une seule molécule dans la synapse immunologique au cours de la signalisation précoce des lymphocytes T.

Research

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Bioengineering

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Bio-ingénierie

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