Name: automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
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Unterstützt wurde diese Arbeit durch die Projekte P30214-N36, P32307-B des Wissenschaftsfonds (FWF) und durch den Vienna Science and Technology Fund (WWTF) LS13-030.

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Dieser Artikel beschreibt eine Pipeline für die automatisierte Aufzeichnung und quantitative Analyse von smFRET-Daten, die von mobilen, aber oberflächengebundenen Sondenmolekülen stammen. Es ergänzt die beiden vorherrschenden Ansätze für smFRET-Experimente, an denen entweder oberflächenimmobilisierte Sonden oder sonden beteiligt sind, die in Lösung in ein konfokales Anregungsvolumen hinein und aus ihm heraus diffundieren17. Es liefert die richtige FRET-Effizienz und die molekularen Positionen als Funktion der Zeit. Es kann daher als Input für spezialisierte Analyseprogramme verwendet werden, z. B. zur Quantifizierung der Übergangskinetik1, der FRET-Histogramme39 oder der zweidimensionalen Diffusion22.
Die Software wird unter einer freien und Open-Source-Lizenz veröffentlicht, die von der Open Source Initiative genehmigt wurde und dem Benutzer das unbefristete Recht auf freie Nutzung, Änderung und Weiterverbreitung gewährt. Github wurde als Entwicklungs- und Distributionsplattform ausgewählt, um es so einfach wie möglich zu machen, die Software zu erhalten und am Entwicklungsprozess teilzunehmen, indem Fehler gemeldet oder Code40 beigetragen wird. In Python geschrieben, ist die Software nicht von proprietären Komponenten abhängig. Die Wahl der Jupyter Notebooks als Benutzeroberfläche erleichtert die Überprüfung der Daten bei jedem Analyseschritt und ermöglicht es, die Pipeline speziell auf das vorliegende Versuchssystem zuzuschneiden und zu erweitern. Die sdt-python library32 dient als Grundlage und implementiert Funktionen zur Auswertung von Fluoreszenzmikroskopiedaten, wie z. B. Einzelmoleküllokalisation, Diffusionsanalyse, Fluoreszenzintensitätsanalyse, Farbkanalregistrierung, Kolokalisierungsanalyse und ROI-Handling.
Prinzipiell kann die Einzelpartikelverfolgung in ein-, zwei- oder dreidimensionalen Systemen durchgeführt werden. Hier wurde die Einzelmolekül-Analyse-Pipeline auf die Untersuchung mobiler 2D-Systeme zugeschnitten. Diese Wahl spiegelt die Verfügbarkeit einfacher Systeme wie planar unterstützter Lipiddoppelschichten (SLBs) wider, um mobile Fluoreszenzsonden zu präsentieren. Solche Lipiddoppelschichtsysteme bestehen typischerweise aus zwei oder mehr Phospholipid-Einheiten, wobei die Bulk-Fraktion die wichtigsten physikalisch-chemischen Parameter des SLB (wie Phase und Viskosität) bestimmt und die Minor-Fraktion Anheftungsstellen für Biomoleküle bereitstellt. Diese Bindungsstellen können biotinylierte Phospholipide für Avidin- oder Streptavidin-basierte Proteinplattformen oder Nickel-NTA-konjugierte Phospholipide für Proteinplattformen mit Histidin-Tags41 sein. Die Wahl der geeigneten Plattform zur Verknüpfung von Proteinen mit dem SLB hängt von der wissenschaftlichen Fragestellung ab. Leser können sich auf die Literatur16,38,42 für Beispiele für erfolgreich eingesetzte Strategien beziehen. Die Dichte der Sonden in der Probe sollte ausreichend niedrig sein, um überlappende Punktspreizungsfunktionen zu vermeiden. Typischerweise werden weniger als 0,1 Moleküle pro μm2 empfohlen. Ein Beispiel für eine geeignete Sondendichte finden Sie im Abschnitt repräsentative Ergebnisse (insbesondere Abbildung 6). Die Analysemethode ist auch auf einzelne fluoreszenzmarkierte Proteinmoleküle anwendbar, die in der Plasmamembran lebender Zellen diffundieren.
Ein kritischer Aspekt der smFRET-Experimente ist die Herstellung und Charakterisierung der FRET-Sonden selbst. Bei der Auswahl von Fluorophoren für ein FRET-Paar sollte ihr Försterradius mit den erwarteten Interfarbstoffabständen übereinstimmen43. Farbstoffe, die gegen Photobleichen beständig sind, werden bevorzugt, da sie langzeitige Spuren ergeben. Für erhöhte Bleichraten kann jedoch eine Fluorophorspezies verwendet werden, um Multiemitter-Ereignisse zu erkennen, die von kolokalisierten Molekülen über eine schrittweise Photobleichanalyse ausgehen; Siehe Schritt 8.1.4 im Abschnitt Protokoll. Fluorophorpaare sollten ortsspezifisch und kovalent an die interessierenden Moleküle gebunden sein und intra- oder intermolekulare FRET-Paare bilden.
Die Kombination von smFRET mit anderen leicht verfügbaren Techniken kann seine räumliche Auflösung über die Beugungsgrenze hinaus erhöhen (über STED44). Der hier vorgestellte smFRET-Tracking-Algorithmus erweitert die Anwendbarkeit des Ansatzes auf neue experimentelle Settings und Modellsysteme. Dazu gehören Untersuchungen (i) kinetischer Veränderungen in der Stöchiometrie mobiler Biomoleküle, (ii) der dynamischen Assoziation mobiler Biomoleküle, (iii) der Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen frei diffundierender Reaktanten und (iv) der Kinetik von Konformationsänderungen mobiler Biomoleküle. Die ersten beiden Beispiele erfordern Modellsysteme, die eine intermolekulare FRET zeigen, d.h. Donor und Akzeptor werden zu getrennten biomolekularen Entitäten von Interesse konjugiert. Die letzteren Beispiele können Biosensoren verwenden, die Donor und Akzeptor innerhalb derselben molekularen Einheit (intramolekulare FRET) tragen.
Intramolekulare FRET-basierte Sensoren können Einblicke in intrinsische Konformationsänderungen von Biomolekülen1,2,3,4, Konformationsänderungen durch endogene oder externe Kraftbelastung (molekulare Kraftsensoren16) oder Ionenkonzentrationen in der Nanoumgebung wie calcium45 und pH46 geben . Abhängig vom Modellsystem und der bevorzugten Verankerungsplattform können solche smFRET-Ereignisse entweder in 2D oder 3D verfolgt werden: (i) Planares Tracking von smFRET-Ereignissen kann zur Quantifizierung von Rezeptor-Liganden-Interaktionszeiten innerhalb einer Plasmamembran, der Assoziation von membranverankerten Signalverstärkungskaskaden und den stöchiometrischen Veränderungen von Oberflächenrezeptoren eingesetzt werden; ii) Die Volumenverfolgung von smFRET-Ereignissen kann für alle intra- oder intermolekularen FRET-Sonden in lebenden Zellen oder in in vitro rekonstituierten Systemen verwendet werden.
Die smFRET-Tracking-Methode wurde hauptsächlich mit Blick auf intramolekulare FRET-Sonden entwickelt. Diese Sonden weisen eine feste und bekannte Anzahl von fluoreszierenden Markierungen auf, eine Tatsache, die ausgenutzt wurde, um Daten von agglomerierten und falsch synthetisierten (z. B. unvollständig markierten) Molekülen sowie von Sonden, bei denen eines der Fluorophore photogebleicht wurde, abzulehnen. Durch die Einstellung der Filterschritte kann das Verfahren jedoch auch auf intermolekulare FRET-Sonden angewendet werden. Zum Beispiel könnte man, anstatt nur Moleküle mit einem einzelnen Donor- und einem einzelnen Akzeptorfluorophor zu akzeptieren, die räumlichen Trajektorien von Donor- und Akzeptorfarbstoffen untersuchen und beispielsweise für die Co-Diffusion von Donor-Akzeptor-Trajektorien auswählen.
Da der 3D-DAOSTORM-Algorithmus die Bestimmung der Position eines Signals entlang der optischen Achse über den Astigmatismus aufgrund einer zylindrischen Linse im Emissionsstrahlpfad unterstützt, könnten 3D-Experimente problemlos in die Analysepipeline integriert werden. In diesem Fall würde das Akzeptorsignal bei Akzeptoranregung dazu dienen, die Stöchiometrie und die axiale Position zu bestimmen. Die Analysesoftware kann auch verwendet werden, um Daten aus Experimenten mit immobilisierten Sonden auszuwerten, indem sie ihren hohen Automatisierungsgrad und filternde Schemata nutzt. Tatsächlich wurden smFRET-Effizienzdatensätze von Holliday-Übergängen, die auf Gelphasendoppelschichten immobilisiert wurden38 , mit einer frühen Version der Software analysiert.

Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein wichtiger Treiber in der molekularbiologischen und biophysikalischen Forschung, da er die Untersuchung von Prozessen mit Sub-Nanometer-Auflösung ermöglicht. Da die Effizienz des Energietransfers zwischen Donor- und Akzeptorfluorophoren stark vom Interfarbstoffabstand im Sub-Nanometer- bis Nanometer-Bereich abhängt, wurde es effektiv als spektroskopisches Lineal zur Untersuchung der statischen und dynamischen Konformation von Biomolekülen eingesetzt1,2,3,4. Darüber hinaus wurde das FRET-Phänomen in großem Umfang für Kolokalisationsstudien von membranassoziierten und intrazellulären Proteinen auf Bulk-Ebene verwendet5,6. In den letzten zwei Jahrzehnten wurde die Methode für die Überwachung von smFRET-Ereignissen7 angepasst, was dazu beitrug, die zeitliche und räumliche Auflösung erheblich zu erhöhen und selbst seltene Subpopulationen in heterogenen Proben aufzulösen. Ausgestattet mit diesen Techniken wurden einzigartige Einblicke in die Dynamik molekularer Maschinen gewonnen, wie die Transkriptverarbeitungsrate der RNA-Polymerase II8, die Replikationsgeschwindigkeit von DNA-Polymerasen9,10, die Nukleosomen-Translokationsrate11, die Transkript-Spleiß- und Stillstandsrate von zusammengesetzten Spleißosomen12, die Aktivität von ribosomalen Subpopulationen13 und die Gehgeschwindigkeit von Kinesinmotoren14 , um nur einige zu nennen. Die Dauer der Rezeptor-Liganden-Interaktion15 und die molekularen Kräfte16 wurden quantifiziert.
Intensitätsbasierte smFRET-Studien stützen sich typischerweise auf sensibilisierte Emissionen, um die FRET-Effizienz zu messen: Ein Strahlteiler im Emissionspfad trennt bei Donoranregung räumlich Licht, das von Donor- und Akzeptorfluorophoren stammt, was die Quantifizierung einzelner Fluoreszenzintensitäten ermöglicht. Der Wirkungsgrad kann anschließend als Bruchteil der vom Akzeptor emittierten Photonen in Bezug auf die Gesamtphotonenzahl berechnet werden17. Darüber hinaus ermöglicht die Akzeptoranregung nach Donoranregung (ALEX) die Messung der Stöchiometrie der FRET-Ereignisse, was die Unterscheidung zwischen echten low FRET-Signalen von Signalen unterstützt, die z.B. von Sonden mit einem photogebleichten Akzeptor fluorophor18 auftreten.
Einzelmolekül-FRET-Experimente werden üblicherweise auf eine von zwei Arten durchgeführt. Zunächst wird ein kleiner Bereich im Probenvolumen mit einem konfokalen Mikroskop beleuchtet. Einzelne Sondenmoleküle in Lösung werden angeregt, wenn sie innerhalb des Brennvolumens diffundieren. Mit dieser Technik können schnelle Photonenzähldetektoren verwendet werden, die eine Zeitauflösung im Submikrosekundenbereich ermöglichen. Zweitens werden Sonden speziell auf Oberflächen immobilisiert und über die Weitfeldmikroskopie überwacht, wobei häufig eine TIR-Konfiguration (Total Internal Reflection) verwendet wird, um die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren. Die Sondenimmobilisierung ermöglicht viel längere Aufnahmezeiten als mit dem ersten Ansatz. Zudem erlaubt das größere Sichtfeld die parallele Überwachung mehrerer Sonden. Die Notwendigkeit einer Kamera macht diese Methode im Vergleich zu der oben beschriebenen langsam. Die Zeitauflösung ist auf den Millisekunden- bis Sekundenbereich beschränkt.
Werden Langzeitspuren benötigt, z.B. um dynamische Prozesse auf einer Millisekunden- bis Sekundenskala zu untersuchen, ist die erste Methode nicht anwendbar, da die Fluoreszenzausbrüche typischerweise zu kurz sind. Der zweite Ansatz scheitert immer dann, wenn eine Immobilisierung nicht möglich ist, z.B. in Lebendzellexperimenten mit Sonden, die innerhalb der Zellmembran diffundieren. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass biologische Modellsysteme ihre Reaktion in Abhängigkeit von der Mobilität der kontaktierten Oberfläche dramatisch variieren können16.
Während in der Vergangenheit kombinierte smFRET- und Einzelpartikel-Tracking-Experimente zur Aufzeichnung mobiler FRET-Sonden durchgeführt wurden19, gibt es keine öffentlich verfügbare Software für die Auswertung der Daten. Dies führte zur Entwicklung einer neuen Analyseplattform, die die Bestimmung mehrerer Eigenschaften mobiler Fluoreszenzsonden ermöglicht, einschließlich smFRET-Effizienz und Stöchiometrie, Positionen mit Subpixelgenauigkeit und Fluoreszenzintensitäten als Zeitfunktionen. Methoden zur Filterung der resultierenden Spuren durch untersuchung des schrittweisen Bleichverhaltens, der Abstände des nächsten Nachbarn, der Emissionsintensitäten und anderer Merkmale wurden etabliert, um ausschließlich korrekt synthetisierte und funktionelle Einzelsondenmoleküle auszuwählen. Die Software unterstützt auch experimentelle und analytische Techniken, die kürzlich in einer Mehrlaborstudie vereinbart wurden, um zuverlässige, quantitative smFRET-Daten zu produzieren17. Insbesondere hält sich die Implementierung an die validierten Verfahren zur Berechnung der FRET-Effizienz und Stöchiometrie. Für die Berechnung des scheinbaren FRET-Wirkungsgrades Eapp mit Eq (1) werden Fluoreszenzintensitäten bei Donoranregung im Donoremissionskanal IDD und Akzeptor-Emissionskanal IDA verwendet.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg"> (1)
Mit Hilfe der Fluoreszenzintensität im Akzeptoremissionskanal bei Akzeptoranregung IAA wird die scheinbare Stöchiometrie mit Eq (2) berechnet.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg"> (2)
Der FRET-Wirkungsgrad E und die Stöchiometrie S können aus Eapp und Sapp unter Berücksichtigung von vier Korrekturfaktoren abgeleitet werden.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg">
α beschreibt das Austreten der Donorfluoreszenz in den Akzeptoremissionskanal und kann unter Verwendung einer Probe, die nur Donorfluorophore enthält, oder durch Analyse von Teilen von Trajektorien, in denen der Akzeptor gebleicht wurde, bestimmt werden. δ korrigiert die direkte Anregung des Akzeptors durch die Donoranregungslichtquelle und kann mit einer Probe mit nur Akzeptorfluorophoren oder durch Analyse von Teilen von Trajektorien, in denen der Spender gebleicht wurde, gemessen werden.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg">.
γ Skaliert IDD, um divergierende Detektionseffizienzen in Donor- und Akzeptoremissionskanälen und unterschiedliche Quantenwirkungsgrade der Fluorophore zu korrigieren. Der Faktor kann berechnet werden, indem die Zunahme der Donorintensität beim Akzeptorbleichen in Trajektorien mit hoher FRET-Effizienz20 analysiert wird oder indem eine Probe mit mehreren diskreten FRET-Zuständen untersucht wird.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg">
β skaliert IAA, um unterschiedliche Wirkungsgrade der Donor- und Akzeptorerregung zu korrigieren. Wenn γ mittels Akzeptorbleichanalyse bestimmt würde, könnte β aus einer Stichprobe des bekannten Donor-zu-Akzeptor-Verhältnisses berechnet werden21. Andernfalls liefert die Mehrzustands-FRET-Probe auch β.
Zusammen ermöglichen die Korrekturen die Berechnung des korrigierten FRET-Wirkungsgrades mit Eq (3).
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg"> (3)
und die korrigierte Stöchiometrie mit Eq (4).
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg"> (4)
Idealerweise ergibt die korrigierte Stöchiometrie für ein Donor-zu-Akzeptor-Verhältnis von 1:1 S = 0,5. In der Praxis erzeugt ein reduziertes Signal-Rausch-Verhältnis eine Streuung der Messwerte von S, was die Unterscheidung von reinen Donorsignalen (S = 1) und reinen Akzeptorsignalen (S = 0) behindert. Die resultierenden Zeitspuren können als Eingabe für eine detailliertere Analyse der Einzelmolekültrajektorien verwendet werden, um Informationen wie raumzeitliche Kraftprofile16, die Mobilität der Einzelmolekülereignisse22 oder die Übergangskinetik zwischen verschiedenen Zuständen1 zu erhalten.
Das folgende Protokoll beschreibt experimentelle Parameter und Verfahren für smFRET-Tracking-Experimente sowie das Arbeitsprinzip der Datenanalyse mit der neu entwickelten Software-Suite. Für die Erfassung experimenteller Daten wird empfohlen, einen Mikroskopieaufbau zu verwenden, der die folgenden Anforderungen erfüllt: i) Fähigkeit, die Emission einzelner Farbstoffmoleküle nachzuweisen; ii) Weitfeldbeleuchtung: Insbesondere für Experimente mit lebenden Zellen wird die Konfiguration der inneren Totalreflexion (TIR23,24,25) empfohlen; iii) räumliche Trennung des Emissionslichts nach Wellenlänge, so dass die Donor- und Akzeptorfluoreszenz auf verschiedene Bereiche desselben Kamerachips25 oder verschiedener Kameras projiziert wird; iv) Modulation von Lichtquellen zur Donor- und Akzeptoranregung mit Millisekundengenauigkeit, z.B. mit direkt modulierbaren Lasern oder Modulation über akusto-optische Modulatoren. Dies ermöglicht eine stroboskopische Beleuchtung, um das Photobleichen von Fluorophoren sowie die abwechselnde Anregung zur Bestimmung von Stöchiometrien zu minimieren. v) Ausgabe einer Datei pro aufgezeichneter Bildsequenz in einem Format, das vom PIMS-Python-Paket gelesen werden kann26. Insbesondere werden mehrseitige TIFF-Dateien unterstützt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790404P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945; Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1084-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer microscope body</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET570/60m</td>
			<td>donor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET675/50m</td>
			<td>acceptor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conda-forge</td>
			<td>conda-forge community</td>
			<td></td>
			<td>community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td>
			<td>MENZEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>FF640-FDi01-25&#215;36</td>
			<td>separation of donor and acceptor emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (quad band)</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>Di01-R405/488/532/635-25&#215;36</td>
			<td>separation of excitation and emission light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fret-analysis</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python package for smFRET data analysis; version 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11524766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBeam Smart 405-S 405 nm laser</td>
			<td>Toptica Photonics AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek chambers (8 wells)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177402PK</td>
			<td>for sample preparation and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenia Prime 532 nm laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniconda</td>
			<td>Anaconda Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Python 3 distribution. Min. version: 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20860 &#38; 20859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBIS 640 nm laser</td>
			<td>Coherent Inc</td>
			<td>1185055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optosplit II</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5253</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sdt-python</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python library for data analysis; version 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpek bead size kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T14792</td>
			<td>Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USC500TH Ultrasound bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>for SUV formation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes

Der Einzelmolekül-Förster-Resonanz-Energietransfer (smFRET) ist eine vielseitige Technik, die Entfernungen im Sub-Nanometer- bis Nanometer-Bereich meldet. Es wurde in einer Vielzahl von biophysikalischen und molekularbiologischen Experimenten eingesetzt, einschließlich der Messung molekularer Kräfte, der Charakterisierung der Konformationsdynamik von Biomolekülen, der Beobachtung der intrazellulären Kolokalisierung von Proteinen und der Bestimmung von Rezeptor-Liganden-Interaktionszeiten. In einer Weitfeldmikroskopiekonfiguration werden Experimente typischerweise mit oberflächenimmobilisierten Sonden durchgeführt. Hier wird eine Methode vorgestellt, die Einzelmolekül-Tracking mit alternierenden Anregungsexperimenten (ALEX) smFRET-Experimenten kombiniert und die Erfassung von smFRET-Zeitspuren von oberflächengebundenen, aber mobilen Sonden in Plasmamembranen oder glasgestützten Lipiddoppelschichten ermöglicht. Für die Analyse der aufgezeichneten Daten wurde eine automatisierte Open-Source-Softwaresammlung entwickelt, die (i) die Lokalisierung von Fluoreszenzsignalen, (ii) die Verfolgung einzelner Partikel, (iii) die Bestimmung von FRET-bezogenen Größen einschließlich Korrekturfaktoren, (iv) die strenge Verifizierung von smFRET-Spuren und (v) die intuitive Darstellung der Ergebnisse unterstützt. Die generierten Daten können bequem als Input für die weitere Exploration über spezielle Software verwendet werden, z.B. zur Beurteilung des Diffusionsverhaltens von Sonden oder zur Untersuchung von FRET-Übergängen.

Eine Vielzahl von Low- und High-Level-Informationen kann aus smFRET-Tracks extrahiert werden, abhängig von der wissenschaftlichen Fragestellung des Experiments. Hier werden Beispiele für Analysepipelines mit analogen und digitalen Sonden vorgestellt: ein peptidbasierter molekularer Kraftsensor16 bzw. eine DNA-Sonde mit stochastischer Umschaltung ihrer Konformation38. In Abbildung 5 sind das Design und das Funktionsprinzip dieser Sonden dargestellt.
Nachdem die Lokalisierungs- und Tracking-Algorithmen wie im Protokoll beschrieben ausgeführt wurden, bietet das Paket mehrere Datenvisualisierungswerkzeuge zur Optimierung der Anfangsparameter und nachfolgenden Filterschritte: (i) Visualisierung einzelner smFRET-Ereignisse, (ii) optionale Bildsegmentierung zur Analyse von Daten in bestimmten Interessenbereichen, (iii) Überwachung von Filterschritten über FRET-Effizienz vs. Stöchiometrie (E-S) -Diagramme. Die Visualisierung der Einzelmoleküldaten ist in Abbildung 6 dargestellt.
Schließlich werden die gefilterten FRET-Ereignisse durch ein E-S-Diagramm und ein FRET-Effizienzhistogramm dargestellt (Abbildung 4). Das E-S-Diagramm ist ein nützliches Werkzeug, um die oben genannten Filterschritte zu optimieren und das Endergebnis zu untersuchen. Teilweise gebleichte oder unvollständig gekennzeichnete FRET-Sensoren können durch ihren Stöchiometriewert ausgeschlossen werden. Mobilitätsparameter können untersucht werden, indem ein einzelner Trajektorienpfad in einem x-y-Diagramm (Abbildung 6) oder einem mittleren quadratischen Verschiebungsdiagramm (MSD) (Abbildung 4) dargestellt wird. Die erste Methode ist besonders nützlich, um mobile von immobilisierten Ereignissen zu unterscheiden, während die letztere zur Berechnung des Diffusionskoeffizienten verwendet wird.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> Abbildung 4: Beispielhafte Ausgabe. (A) Die FRET-Effizienz wird im Vergleich zur Stöchiometrie (E-S-Diagramm) für eine Population des Molekularkraftsensors (linkes Feld) aufgetragen, das eine glasgestützte Lipiddoppelschicht schmückt und durch eine T-Zelle belastet wird. Nur eine Bevölkerungswolke ist sichtbar. Das jeweilige Histogramm der FRET-Wirkungsgrade veranschaulicht den Unterschied zwischen einer Kraftsensorpopulation in Anwesenheit und Abwesenheit von Zellen (mittleres Feld). Es kann keine Verschiebung zu niedrigeren FRET-Wirkungsgraden der Sensorpopulation in Gegenwart von T-Zellen beobachtet werden, was auf eine geringe bis gar keine kraftabhängige Dehnung des Sensormoduls hinweist. Das MSD-Diagramm dieser experimentellen Bedingungen bestätigt, dass sich die Kraftsensorpopulation unter einer T-Zelle erheblich langsamer bewegt als ihre ungebundenen Gegenstücke (rechtes Bild). (B) Die gleiche Analyse wurde mit einem Holliday-Junction-DNA-Sensor durchgeführt, der eine glasgestützte Flüssigelipiddoppelschicht verzierte. Das E-S-Diagramm zeigt deutlich zwei Populationen, die auch im FRET-Effizienzhistogramm ersichtlich sind. Das MSD-Diagramm zeigt das Vorhandensein einer sich schnell bewegenden Sensorpopulation an. Abkürzungen: FRET = Förster Resonanzenergieübertragung; MSD = mittlere quadratische Verschiebung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> Abbildung 5: Aufbau und Funktionsprinzip intramolekularer FRET-Sonden. (A) Analoger Peptidsensor zur Quantifizierung mechanischer Molekülkräfte. Die Donor- und Akzeptorfluorophore sind kovalent an beide Enden des Peptidrückgrats gebunden. Das Sensormodul ist ortsspezifisch an einen bestimmten Liganden gebunden, der wiederum einen zellresidenten Oberflächenrezeptor von Interesse bindet (hier ein Antikörperfragment, das die Betakette des T-Zell-Rezeptors spezifisch erkennt). Bei der Rezeptor-Liganden-Bindung wird Kraft ausgeübt, und das Sensormodul dehnt sich aus und stößt schließlich nach der Bindungsspaltung zurück. Dieses Panel wurde von 16 geändert. (B) Digitaler DNA-Sensor zur Quantifizierung von FRET-Übergängen. Der FRET-Sensor besteht aus vier DNA-Strängen, die einen Holliday-Übergang bilden. Der Donor und der Akzeptorfluorophor sind kovalent an zwei Stränge gebunden. Holliday-Übergänge wechseln häufig ihre Konformation in Abhängigkeit von den umgebenden Pufferbedingungen. Das stochastische Schalten dieser Konformationen kann durch Quantifizierung der FRET-Effizienz einzelner Sonden überwacht werden. Abkürzungen: TCR = T-Zell-Rezeptor; FRET = Förster Resonanzenergieübertragung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> Abbildung 6: Beispiele für die Lokalisierung und Verfolgung von FRET-Sonden. (A) Die FRET-Effizienz und Stöchiometrie einzelner Ereignisse werden berechnet, indem die Intensität des Donorfluorophors bei Donoranregung (D → D), des Akzeptorfluorophors bei Donoranregung (D → A) und des Akzeptorfluorophors bei Akzeptorerregung (A → A) quantifiziert wird. Die Filterung des nächsten Nachbarn verhindert Verzerrungen durch überlappende Punktspreizungsfunktionen von Close Emittern. Die Bildsegmentierung ermöglicht es dem Benutzer, bestimmte smFRET-Ereignisse auszuwählen, die in einem Interessengebiet lokalisiert sind (z. B. eine Zelle oder ein Mikromuster). Als Beispiel für die Bildsegmentierung wurden T-Zellen mit Fura-2 (links dargestellt) gefärbt und einem adaptiven Schwellenwert unterzogen, um die Zellränder zu identifizieren (orange gepunktete Linie). Maßstabsbalken = 5 μm. (B) smFRET-Trajektorien mit dem Molekularkraftsensor. Einzelne Trajektorien können in der x-y-Ebene dargestellt werden, wobei ihr Diffusionsverhalten und ihre Lokalisierung visualisiert werden (linkes Feld). Darüber hinaus können die Intensitäten jeder Trajektorie im Laufe der Zeit dargestellt werden, um FRET-Übergänge oder Bleichschritte zu identifizieren (das mittlere Feld zeigt die rote Trajektorie aus dem linken Bereich). Der resultierende FRET-Wirkungsgrad und die Stöchiometrie können ähnlich visualisiert werden (rechtes Feld). (C) smFRET-Trajektorien unter Verwendung des Holliday-Junction-DNA-Sensors. HBSS + 12 mM MgCl2 wurde während der Messungen als Puffer verwendet. Abgesehen von dem scheinbaren Akzeptor-Bleichschritt in der Nähe des Sequenzendes dieser Beispiele kann die Häufigkeit der FRET-Übergänge für jeden Sensor bestimmt werden. Die Holliday-Übergänge schalten ihre Konformation mit einer hohen Frequenz, während der Molekularkraftsensor keine FRET-Übergänge aufweist. Diese Informationen ermöglichen es, die experimentellen Bedingungen, wie z.B. die Verzögerung zwischen den Frames, anzupassen, um die Anzahl der beobachteten Übergänge zu erhöhen oder zu reduzieren. Abkürzungen: FRET = Förster Resonanzenergieübertragung; smFRET = Einzelmolekül-FRET; HBSS = Hanks ausgewogene Salzlösung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Informationen: Lokalisierung und Verfolgung einzelner Moleküle (01. Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Dieser Artikel stellt eine Methode zur raumzeitlichen Analyse von mobilen, einzelmolekularen Förster-Resonanz-Energietransfer-basierten (smFRET)-basierten Sonden mittels Weitfeldfluoreszenzmikroskopie vor. Das neu entwickelte Software-Toolkit ermöglicht die Bestimmung von smFRET-Zeitspuren bewegter Sonden, einschließlich der korrekten FRET-Effizienz und der molekularen Positionen, als Funktionen der Zeit.

Automatisierte zweidimensionale raumzeitliche Analyse mobiler Einzelmolekül-FRET-Sonden

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Einzelmolekül-FRET-Experimente mit oberflächengebundenen Sonden wurden in der Vergangenheit fast ausschließlich an immobilisierten Molekülen durchgeführt. Viele Biomoleküle diffundieren jedoch und können mit unserer Methode analysiert werden. Die Kombination von Einzelmolekül-FRET mit Tracking ermöglicht es, nicht nur FRET-Mangelzeitspuren von bewegten Sonden zu analysieren, sondern auch raumzeitliche Aspekte wie das Diffusionsverhalten zu untersuchen.Unsere Methode ist mit einer Vielzahl von verschiedenen FRET-basierten Sonden kompatibel. Zum Beispiel könnte es Einblicke in molekulare Kräfte, Konformationsdynamik und Bindungskinetik in Lebendzellexperimenten liefern. Hochwertige Einzelmolekül-FRET-Experimente sind notorisch schwer durchzuführen.Für eine zuverlässige Quantifizierung ist es wichtig, Daten mit einem guten Signal-Rausch-Verhältnis und Einzelmolekülspuren von ausreichender Länge aufzuzeichnen. Um mit der Probenmessung zu beginnen, regen Sie die Donor- und Akzeptorfluorophore für eine angemessene Beleuchtungszeit an, während Sie die Kamera auslösen, und warten Sie, bis die Kameraanzeige aktiviert ist. Wiederholen Sie alternativ die Anregung der Donor- und Akzeptorfluorophore.Wählen Sie die Anzahl der Wiederholungen, die groß genug ist, um das Photobleichen von mindestens einem Fluorophor pro Sonde innerhalb des Sichtfelds sicherzustellen, was eine schrittweise Photobleichanalyse ermöglicht, um Einzelmolekülsignale von Aggregaten zu unterscheiden. Geben Sie die Beleuchtungssequenz an, um die Auswahl von Donor- und Akzeptor-Anregungsrahmen sowie Rahmen für die Bildsegmentierung aus aufgezeichneten Bildsequenzen zu ermöglichen. Analysieren Sie gleichzeitig die Datensätze, die mit den gleichen Beleuchtungseinstellungen aufgezeichnet wurden.Ordnen Sie dazu jedem Datensatz einen Bezeichner und ein Muster zu, das den jeweiligen Dateinamen der Bildsequenz entspricht. Definieren Sie zusätzlich spezifische Datensätze für spezielle Zwecke, z. B. Aufzeichnungen von Fiducialmarkern für die Bildregistrierung, Anregungslichtprofile für die Flachfeldkorrektur und optional nur Spender- und Akzeptorproben zur Bestimmung von Korrekturfaktoren. Wählen Sie als Nächstes Emissionskanäle und Rohbilder aus, wenn beide Kanäle mit einer einzigen Kamera aufgezeichnet wurden.Verwenden Sie dazu das entsprechende grafische Widget, um geeignete Regionen für die Spender- und Akzeptoremission auszuwählen, dann Fiducialmarker in beiden Emissionskanälen zu lokalisieren und die Bildregistrierung durchzuführen. Verwenden Sie die bereitgestellte Benutzeroberfläche, um die geeigneten Parameter für den Lokalisierungsalgorithmus für Donor- und Akzeptor-Emissionskanäle zu finden. Als nächstes legen Sie Einzelmolekül-Lokalisierungsparameter für FRET-Sonden bei Donoranregung in der Summe der Bilder fest, die aus Donor- und Akzeptoremissionen erhalten wurden, und legen Sie dann Lokalisierungsparameter für Sonden bei Akzeptoranregung im Akzeptoremissionskanal fest.Lokalisieren Sie die FRET-Sonden bei Donor- und Akzeptoranregung unabhängig voneinander in allen Frames. Die Ergebnisse werden in einer Tabelle zusammengeführt, die die ursprüngliche Rahmennummer, zweidimensionale Koordinaten und einen Bezeichner enthält, der sich auf die Quellbilddatei bezieht. Um die Fluoreszenzintensität zu verfolgen und zu messen, wählen Sie geeignete Optionen für den Trackpy-Algorithmus aus, um FRET-Sondenlokalisationen mit Trajektorien zu verknüpfen.Als nächstes verarbeiten Sie mithilfe der Analysesoftware-Funktionalität zusätzliche Bilddaten aus Bildsequenzen. Extrahieren Sie zusätzliche Bilder, die aufgezeichnet wurden, um die durch S markierte Segmentierung in der Anregungssequenz zu erleichtern. Bestimmen Sie schließlich die Anregungslichtprofile von Donor und Akzeptor über das Sichtfeld aus Bildern, die auf einer dicht markierten Probe aufgezeichnet wurden.Für die ersten Filterschritte werden Rückwurfsignale mit überlappenden Punktspreizfunktionen verworfen, da es schwierig ist, ihre Fluoreszenzintensitäten zuverlässig zu bestimmen. Akzeptieren Sie bei inhomogener Beleuchtung nur Signale, die sich in gut beleuchteten Bereichen innerhalb des Sichtfelds befinden, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu gewährleisten. Wenn Sie intramolekulare FRET untersuchen, beschränken Sie die Analyse auf die Trajektorien, die seit Beginn der Bildsequenz vorhanden sind.Führen Sie als Nächstes die Flachfeldkorrektur aus, die die zuvor erhaltenen Anregungslichtquellenprofile verwendet, um die positionsabhängigen Fluoreszenzintensitätsschwankungen umzukehren, die durch inhomogene Beleuchtung verursacht werden, und berechnen Sie dann die scheinbare FRET-Effizienz und die scheinbare Stöchiometrie. Um eine schrittweise Analyse der Photobleichung zur Unterscheidung zwischen einzelnen molekularen Sonden und Aggregaten durchzuführen, finden Sie geeignete Parameter für den Änderungspunkterkennungsalgorithmus bei Donor- und Akzeptoranregung unabhängig voneinander. Führen Sie dann den Änderungspunkterkennungsalgorithmus aus.Um spurenloses Photobleichverhalten zu entfernen, definieren Sie Intensitätsschwellenwerte, unterhalb derer ein Fluorophor als gebleicht gilt, und wählen Sie dann eine der folgenden Optionen aus. Option eins, bei der der Akzeptor Fluorophor in einem einzigen Schritt bleiicht, während der Spender keine partielle Bleiche zeigt. Option zwei, bei der der Spender in einem einzigen Schritt bleiicht, während es keine partielle Akzeptorbleiche gibt.Option drei, wobei entweder Fluorophor in einem einzigen Schritt bleicht, während der andere nicht teilweise bleicht. Und Option vier, bei der Donor- und Akzeptorfluorophore einstufiges Photobleichen oder gar kein Photobleichen zeigen. Berechnen Sie dann die Korrekturfaktoren für die Donoremissionsleckage in den Akzeptorkanal, die direkte Akzeptoranregung, die Detektionseffizienz und die Anregungseffizienzen.Verwenden Sie als Nächstes die Korrekturfaktoren, um die FRET-Effizienz aus der scheinbaren Effizienz und die Stöchiometrie aus der scheinbaren Stöchiometrie zu berechnen. Wählen Sie zur weiteren Filterung nur Datenpunkte vor dem ersten Bleichereignis in jeder Leitkurve aus. Um die Analyse auf Einzelmolekülsonden zu beschränken, akzeptieren Sie außerdem nur Trajektorien mit mindestens 75% der Datenpunkte innerhalb der entsprechenden Stöchiometriegrenzen.Führen Sie dann eine Bildsegmentierung über globale oder adaptive Schwellenwertmethoden für die entsprechenden Hilfsbilder durch, um die Analyse auf verschiedene Bereiche innerhalb des Sichtfelds zu beschränken. Erstellen Sie Effizienz- und Stöchiometriediagramme, um sicherzustellen, dass Signale falscher Stöchiometrie korrekt identifiziert und entfernt wurden. Zeichnen Sie dann Histogramme der FRET-Effizienzen auf, um einen fundierten Überblick über die FRET-Effizienzverteilungen zu erhalten, und gruppieren Sie die Histogramme für einen bequemen Vergleich der Ergebnisse aus verschiedenen Experimenten.Mit wissenschaftlichen Python-Bibliotheken ist es möglich, die Daten innerhalb des Notebooks weiter auszuwerten und beispielsweise Diffusionsanalysen durchzuführen. Die Visualisierung und Verfolgung des Einzelmolekül-FRET-Ereignisses wird hier gezeigt. Gefilterte FRET-Ereignisse werden durch Effizienz- und Stöchiometriediagramme in einem FRET-Effizienzhistogramm dargestellt.Darüber hinaus können Mobilitätsparameter untersucht werden, indem ein einzelner Trajektorienpfad in einem XY-Diagramm oder einem mittleren quadratischen Verschiebungsdiagramm dargestellt wird. Das Ergebnis unserer Plattform ermöglicht es uns, Übergänge in FRET-Effizienzzeitspuren mobiler Sonden weiter zu identifizieren. Zum Beispiel, um Konformationsänderungen der Biomoleküle zu bewerten.Mit einem FRET-basierten Kraftsensor ermöglichte uns die Analyseplattform, Einzelmolekül-Kraftereignisse innerhalb der immunologischen Synapse während der frühen T-Zell-Signalisierung zu quantifizieren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Forschung

Biotechnik

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse für SENP1 Protease Kinetics Bestimmung

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Sensitive Detection von Proteopathic Seeding Aktivität mit FRET Durchflusszytometrie

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescence Recovery nach der Zusammenführung ein Droplet, um die zweidimensionale Diffusion eines Phospholipidschicht Messen

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...