Name: automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע האוסטרית (FWF) פרויקטים P30214-N36, P32307-B, ועל ידי קרן המדע והטכנולוגיה של וינה (WWTF) LS13-030.

<ol>
	<li>McKinney, S. A., D&#233;clais, A. -. C., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+individual+holliday+junctions.">Structural dynamics of individual holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).</li><li>Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+potassium-channel+gating+revealed+by+single-molecule+FRET.">Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).</li><li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks.">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), 235 (2018).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).</li><li>Wu, P. G., Brand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonance+energy+transfer:+Methods+and+applications.">Resonance energy transfer: Methods and applications.</a> Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).</li><li>Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecular+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+measurement+on+structures+and+interactions+of+biomolecules.">Single-molecular f&#246;rster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules.</a> Micromachines. 12 (5), 492 (2021).</li><li>Malkusch, N., D&#246;rfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=smFRET+experiments+of+the+RNA+polymerase+II+transcription+initiation+complex.">smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex.</a> Methods. 120, 115-124 (2017).</li><li>Lee, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+views+of+MutS+on+mismatched+DNA.">Single-molecule views of MutS on mismatched DNA.</a> DNA repair. 20, 82-93 (2014).</li><li>Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microsecond+single-molecule+FRET+to+determine+the+assembly+pathways+of+T4+ssDNA+binding+protein+onto+model+DNA+replication+forks.">Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).</li><li>Deindl, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+conformational+dynamics+with+single-molecule+fluorescence+energy+transfer:+Applications+in+nucleosome+remodeling.">Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling.</a> Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).</li><li>Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+colocalization+FRET+evidence+that+spliceosome+activation+precedes+stable+approach+of+5'+splice+site+and+branch+site.">Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).</li><li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations.">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li><li>Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+kinesin+waits+between+steps.">How kinesin waits between steps.</a> Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).</li><li>G&#246;hring, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+analysis+of+T-cell+receptor-imposed+forces+via+quantitative+single+molecule+FRET+measurements.">Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements.</a> Nature Communications. 12 (1), 2502 (2021).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669 (2018).</li><li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-aided+molecule+sorting:+Analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li><li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells.">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).</li><li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules.">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).</li><li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation.">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li><li>Asher, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+imaging+of+GPCR+dimers+in+living+cells.">Single-molecule FRET imaging of GPCR dimers in living cells.</a> Nature Methods. 18 (4), 397-405 (2021).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy. (12), 1223-1237 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(excitation)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (excitation) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1189-1191 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(emission)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (emission) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1192-1194 (2012).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., van der Wel, C. M., Dimiduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft-matter/pims: PIMS v0.5. , (2020).</li><li>Anaconda Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Miniconda. , (2021).</li><li>conda-forge community. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The conda-forge project: community-based software distribution built on the conda package format and ecosystem. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> JupyterLab Contributors Notebooks - JupyterLab documentation. , (2021).</li><li>Babcock, H., Sigal, Y. M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-density+3D+localization+algorithm+for+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">A high-density 3D localization algorithm for stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Optical Nanoscopy. 1 (6), (2012).</li><li>Gao, Y., Kilfoil, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+detection+and+complete+tracking+of+large+populations+of+features+in+three+dimensions.">Accurate detection and complete tracking of large populations of features in three dimensions.</a> Optics Express. 17 (6), 4685 (2009).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> sdt-python: Python library for fluorescence microscopy data analysis (v17.1). , (2021).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nature Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li><li>Bradski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OpenCV+library.">The OpenCV library.</a> Dr. Dobb's Journal: Software Tools for the Professional Programmer. 25 (11), 120-123 (2000).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft-matter/trackpy:+Trackpy+v0.5.0.">Soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0.</a> Zenodo. , 4682814 (2021).</li><li>Killick, R., Fearnhead, P., Eckley, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+detection+of+changepoints+with+a+linear+computational+cost.">Optimal detection of changepoints with a linear computational cost.</a> Journal of the American Statistical Association. 107 (500), 1590-1598 (2012).</li><li>Schrangl, L., G&#246;hring, J., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+single+molecule+FRET+transitions+without+trajectories.">Kinetic analysis of single molecule FRET transitions without trajectories.</a> The Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123328 (2018).</li><li>Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+single-molecule+FRET+dynamics+with+probability+distribution+analysis.">Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis.</a> ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+analysis+software+(3.0).">Single-molecule FRET analysis software (3.0).</a> Zenodo. , (2021).</li><li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers.">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li><li>Platzer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unscrambling+fluorophore+blinking+for+comprehensive+cluster+detection+via+photoactivated+localization+microscopy.">Unscrambling fluorophore blinking for comprehensive cluster detection via photoactivated localization microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4993 (2020).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The molecular probes handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies. , (2010).</li><li>Szalai, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+energy+transfer+by+intensity-based+STED-FRET.">Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET.</a> Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+two-photon+probe+for+in+vivo+tracking+of+pH+during+a+traumatic+brain+injury+process.">A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process.</a> New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

מאמר זה מפרט צינור להקלטות האוטומטיות וניתוח כמותי של נתוני smFRET שמקורם במולקולות בדיקה ניידות אך קשורות פני השטח. הוא משלים את שתי הגישות השולטות לניסויי smFRET, הכוללים בדיקות משותקות פני השטח או בדיקות המתפזרות בתמיסה לתוך ומחוץ לנפח עירור קונפוקלי17. הוא מספק את היעילות הנכונה FRET ואת העמדות המולקולריות כפונקציה של זמן. לכן זה יכול לשמש קלט עבור תוכניות ניתוח מיוחדות, למשל, כדי לכמת קינטיקה המעבר1, FRET היסטוגרמה39, או דיפוזיה דו ממדית22.
התוכנה מופצת תחת רישיון קוד פתוח וחופשי שאושר על ידי יוזמת הקוד הפתוח המעניקה למשתמש את הזכות המתמדת לשימוש חופשי, שינוי והפצה מחדש. Github נבחרה כפלטפורמת פיתוח והפצה כדי להקל ככל האפשר על השגת התוכנה ולהשתתף בתהליך הפיתוח על ידי דיווח על באגים או תרומה של code40. כתוב בפייתון, התוכנה אינה תלויה ברכיבים קנייניים. הבחירה במחברות Jupyter כממשקי משתמש מקלה על בדיקת הנתונים בכל שלב ניתוח ומאפשרת להתאים ולהרחיב את הצינור במיוחד עבור המערכת הניסיונית בהישג יד. ספריית sdt-python32 משמשת כבסיס ומיישמת פונקציונליות להערכת נתוני מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, כגון לוקליזציה של מולקולה בודדת, ניתוח דיפוזיה, ניתוח עוצמת פלואורסצנטיות, רישום ערוץ צבע, ניתוח colocalization וטיפול ב- ROI.
באופן עקרוני, מעקב אחר חלקיקים בודדים יכול להתבצע במערכות חד-פעמיות, דו-ממדיות או תלת-ממדיות. כאן, צינור ניתוח מולקולה אחת הותאם לחקר מערכות ניידות דו-ממדיות. בחירה זו משקפת את הזמינות של מערכות פשוטות, כגון bilayers השומנים הנתמכים על ידי מישורים (SLBs), כדי להציג בדיקות פלואורסצנטיות ניידות. מערכות דו-שכבתיות כאלה של השומנים מורכבות בדרך כלל משני פוספוליפידים או יותר, כאשר השבר בתפזורת קובע את הפרמטרים הפיזיקוכימיים העיקריים של ה- SLB (כגון פאזה וצמיגות), והשבר המשני מספק אתרי התקשרות לביומולקולות. אתרי התקשרות אלה יכולים להיות פוספוליפידים ביו-טינילים עבור פלטפורמות חלבון מבוססות אבידין או סטרפטאבידין או פוספוליפידים מצומדים ניקל-NTA לפלטפורמות חלבון עם תגי היסטידין41. הבחירה בפלטפורמה המתאימה לחיבור חלבונים ל- SLB תלויה בשאלה המדעית. הקוראים יכולים להתייחס לספרות16,38,42 לדוגמאות של אסטרטגיות שהועסקו בהצלחה. צפיפות הבדיקות במדגם צריכה להיות נמוכה מספיק כדי למנוע פונקציות התפשטות נקודת חפיפה; בדרך כלל, פחות מ 0.1 מולקולות לכל μm2 מומלץ. עיין בסעיף התוצאות הייצוגיות (בפרט, איור 6) לדוגמה המציג צפיפות בדיקה מתאימה. שיטת הניתוח חלה גם על מולקולות חלבון המסומנות בפלואורסצנטיות בודדות המתפזרות בקרום הפלזמה של תאים חיים.
היבט קריטי אחד של ניסויי smFRET הוא הייצור והאפיון של בדיקות FRET עצמן. בעת בחירת פלואורופורים עבור זוג FRET, רדיוס Förster שלהם צריך להתאים את המרחקים הבין-צבעיים הצפויים43. צבעים עמידים בפני הלבנת פוטו-אקונומיקה עדיפים מכיוון שהם מניבים עקבות זמן רב. עם זאת, עבור שיעורי הלבנה גבוהים, ניתן להשתמש במין פלואורופור אחד כדי לזהות אירועים רב-תכליתיים שמקורם במולקולות colocalized באמצעות ניתוח צילום צעדים; ראה שלב 8.1.4 בסעיף הפרוטוקול. זוגות פלואורופור צריכים להיות מחוברים באופן ספציפי וקובאלי למולקולות של עניין, ויוצרים זוגות FRET פנים-או מולקולריים.
שילוב smFRET עם טכניקות זמינות אחרות יכול להגדיל את הרזולוציה המרחבית שלו מעבר למגבלת העקיפה (באמצעות STED44). אלגוריתם המעקב smFRET המוצג כאן מרחיב את תחולת הגישה להגדרות ניסיוניות חדשות ולמערכות מודל. זה כולל מחקרים של (i) שינויים קינטיים בסטואיכיומטריה של ביומולקולות ניידות, (ii) אסוציאציה דינמית של ביומולקולות ניידות, (iii) שיעור התגובות אנזימטיות של מגיבים מפוזרים בחופשיות, ו- (iv) הקינטיקה של שינויים קונפורמציה של ביומולקולות ניידות. שתי הדוגמאות הראשונות דורשות מערכות מודל המציגות FRET בין-מולקולרי, כלומר, תורם ומקבל מצומדים יחד כדי להפריד בין ישויות ביו-מולקולריות של עניין. הדוגמאות האחרונות עשויות לעשות שימוש בביו-סנסורים הנושאים תורם ומקבל באותה ישות מולקולרית (FRET תוך מולקולרית).
חיישנים תוך-מולקולריים מבוססי FRET יכולים לספק תובנה על שינויים קונפורמצונליים מהותיים של ביומולקולות1,2,3,3,4, שינויים קונפורמציה הנגרמים על ידי עומס כוח אנדוגני או חיצוני (חיישני כוח מולקולריים16), או ריכוזי יונים בסביבת הננו כגון סידן45 ו- pH46 . בהתאם למערכת המודל ולפלטפורמת העיגון המועדפת, ניתן לעקוב אחר אירועי smFRET כאלה בדו-ממד או בתלת-ממד: (i) מעקב מישורי אחר אירועי smFRET יכול להיות מועסק לכימות זמני אינטראקציה קולטן-ליגנד בתוך קרום פלזמה, הקשר של מפלי הגברת אותות מעוגנים בממברנה, ושינויי הסטואיכיומטריה של קולטני פני השטח; (ii) מעקב אחר נפח של אירועי smFRET יכול לשמש עבור כל בדיקות FRET פנים או intermolecular בתאים חיים או במערכות משוחזרות במבחנה.
שיטת המעקב smFRET פותחה בעיקר עם בדיקות FRET תוך מולקולריות בראש. בדיקות אלה כוללות מספר קבוע וידוע של תוויות פלואורסצנטיות, עובדה שנוצלה כדי לדחות נתונים ממולקולות מגולגלות ומסונתזות באופן שגוי (למשל, מתויגות באופן חלקי), כמו גם מבדיקות שבהן אחד הפלואורופורים כבר photoletached. עם זאת, על ידי התאמת שלבי הסינון, ניתן להחיל את השיטה גם על בדיקות FRET בין מולקולריות. לדוגמה, במקום לקבל רק מולקולות הכוללות תורם יחיד ופלואורופור מקבל יחיד, ניתן היה לבחון את המסלולים המרחביים של צבעי התורם והקבלה ולבחור, למשל, עבור פיזור משותף של מסלולים של תורמים-מקבלים.
מכיוון שלאלגוריתם 3D-DAOSTORM יש תמיכה בקביעת מיקום האות לאורך הציר האופטי באמצעות האסטיגמציה עקב עדשה גלילית בנתיב קרן הפליטה, ניתן לשלב בקלות ניסויים תלת-ממדיים בצינור הניתוח. במקרה זה, אות הקבלה על עירור מקבל ישמש כדי לקבוע את stoichiometry ואת המיקום הצירי. תוכנת הניתוח יכולה לשמש גם להערכת נתונים מניסויים הכוללים בדיקות משותקות על ידי שימוש במידה הגדולה של אוטומציה וערכות סינון. למעשה, ערכות נתוני יעילות smFRET מצמתים הולידיי משותקים על bilayers שלב ג'ל38 נותחו באמצעות גרסה מוקדמת של התוכנה.

העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) הייתה מניע מרכזי במחקר ביולוגי וביופיזי מולקולרי, שכן היא מאפשרת לחקור תהליכים ברזולוציה תת-ננומטרית. מכיוון שהיעילות של העברת אנרגיה בין פלואורופורים תורמים ומקבלים תלויה מאוד במרחק הבין-צבע בטווח תת-ננומטר לננומטר, הוא שימש ביעילות כשליט ספקטרוסקופי לחקור קונפורמציה סטטית ודינמית של ביומולקולות1,2,3,4. בנוסף, תופעת FRET כבר בשימוש נרחב עבור מחקרי colocalization של חלבונים הקשורים ממברנה תאית ברמה בתפזורת 5,6. בשני העשורים האחרונים, השיטה הותאמה לניטור אירועי smFRET7, אשר סייע להגדיל באופן משמעותי רזולוציה זמנית ומרחבית ופתר אפילו תת-אוכלוסיות נדירות בדגימות הטרוגניות. מצוידים בטכניקות אלה, תובנות ייחודיות הושגו לתוך הדינמיקה של מכונות מולקולריות כגון קצב עיבוד התמלילים של RNA פולימראז II8, מהירות השכפול של DNA פולימראזס9,10, שיעור טרנסלוקציה נוקלאוזום11, חיבור תעתיק וקצב השתהות של spliceosomes מורכב12, הפעילות של תת-אוכלוסיות ריבוזומליות13, ומהירות ההליכה של מנועי קינסין14 אם להזכיר כמה., משכי אינטראקציה קולטן-ליגנד15 וכוחות מולקולריים16 כבר כימתו.
מחקרי smFRET מבוססי עוצמה מסתמכים בדרך כלל על פליטה רגישה כדי למדוד את יעילות FRET: מפצל קרן בנתיב הפליטה מפריד באופן מרחבי אור שמקורו בפלואורופורים תורמים ומקבלים על עירור התורם, ומאפשר כימות של עוצמות פלואורסצנטיות בודדות. לאחר מכן ניתן לחשב את היעילות כשבר הפוטונים הנפלטים מהמקבל ביחס לספירת הפוטונים הכוללת17. בנוסף, עירור מקבל בעקבות עירור התורם (ALEX) מתיר מדידה של הסטואיכיומטריה של אירועי FRET, ומסייע באפליה בין אותות FRET נמוכים אמיתיים מאותות הנובעים, למשל, מבדיקות הכוללות פלואורופור של מקבל פוטו מולבן18.
ניסויי FRET במולקולה אחת מתבצעים בדרך כלל באחת משתי דרכים. ראשית, אזור קטן בנפח המדגם מואר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. מולקולות בדיקה בודדות בתמיסה מתרגשות כאשר הן במקרה מפוזרות בתוך נפח המוקד. באמצעות טכניקה זו, ניתן להשתמש בגלאי ספירת פוטונים מהירה, המאפשרים רזולוציית זמן תת-מיקרו-שנייה. שנית, בדיקות משותקות במיוחד על משטחים ומנוטרות באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה, לעתים קרובות באמצעות תצורת השתקפות פנימית כוללת (TIR) כדי למזער פלואורסצנטיות ברקע. אימוביליזציה בדיקה מאפשרת זמני הקלטה ארוכים בהרבה מאשר שימוש בגישה הראשונה. בנוסף, שדה הראייה הגדול יותר מאפשר ניטור של בדיקות מרובות במקביל. הצורך במצלמה הופך שיטה זו לאיטית בהשוואה לזו שתוארה לעיל. רזולוציית הזמן מוגבלת לאלפית השנייה לטווח השני.
אם נדרשים מעקבים ארוכים, למשל, לחקר תהליכים דינמיים בקנה מידה של אלפית שנייה עד שנייה, השיטה הראשונה אינה ישימה, שכן התפרצויות הפלואורסצנטיות הן בדרך כלל קצרות מדי. הגישה השנייה נכשלת בכל פעם שהשתקה אינה ריאלית, למשל, בניסויים בתאים חיים הכוללים בדיקות המתפזרות בתוך קרום התא. יתר על כן, זה נצפתה כי מערכות מודל ביולוגי יכול לשנות את התגובה שלהם באופן דרמטי בהתאם לניידות של פני השטח במגע16.
בעוד ש- smFRET משולב וניסויי מעקב חלקיקים בודדים המתעדים בדיקות FRET ניידות בוצעו ב- 19 האחרונות, אין תוכנה זמינה לציבור להערכת הנתונים. זה הניע את הפיתוח של פלטפורמת ניתוח חדשה, המאפשרת לקבוע תכונות מרובות של בדיקות פלואורסצנטיות ניידות, כולל יעילות smFRET ו stoichiometry, עמדות עם דיוק תת פיקסלים, ועוצמות פלואורסצנטיות כפונקציות של זמן. שיטות לסינון העקבות המתקבלות על ידי בחינת התנהגות הלבנה צעדית, מרחקי שכנים קרובים, עוצמות פליטה ותכונות אחרות הוקמו כדי לבחור באופן בלעדי מולקולות מסונתזות ופונקציונליות של בדיקה אחת. התוכנה תומכת גם בטכניקות ניסיוניות ואנליטיות שהוסכמו לאחרונה במחקר רב-תחומי כדי לייצר נתוני smFRET אמינים וכמותיים17. בפרט, היישום דבק בהליכים המאומתים לחישוב של יעילות FRET ו stoichiometry. עוצמות פלואורסצנטיות בעת עירור התורם בתעודת הזהות של ערוץ הפליטה התורם ובערוץ הפליטה של מקבל IDA משמשות לחישוב היעילות לכאורה של FRET Eapp באמצעות Eq (1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg"> (1)
בעזרת עוצמת הפלואורסצנטיות בערוץ פליטת המקבלים עם עירור הקבלה IAA, הסטואיכיומטריה לכאורה מחושבת באמצעות Eq (2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg"> (2)
יעילות FRET E ואת stoichiometry S ניתן לגזור Eapp ו Sapp על ידי התחשבות ארבעה גורמי תיקון.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg">
α מתאר את הדליפה של פלואורסצנטיות תורמת לתוך ערוץ פליטת המקבל וניתן לקבוע אותו באמצעות מדגם המכיל רק פלואורופורים תורמים או על ידי ניתוח חלקים של מסלולים שבהם הקבלה מולבן. δ מתקן את עירור ישיר של המקבל על ידי מקור אור עירור התורם וניתן למדוד באמצעות מדגם עם פלואורופורים מקבלים בלבד או על ידי ניתוח חלקים של מסלולים שבהם התורם כבר מולבן.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg">.
γ מדרגת את הזיהוי כדי לתקן את יעילות הזיהוי המתפצלת בערוצי פליטת תורמים ומקבלים ויעילות קוונטית שונה של הפלורופורים. ניתן לחשב את הגורם על ידי ניתוח העלייה בעוצמת התורם בעת הלבנת קבילות במסלולים עם יעילות FRET גבוהה20 או על ידי לימוד מדגם הכולל מצבי FRET נפרדים מרובים.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg">
β מדרגת את רשות העתיקות כדי לתקן ליעילות שונה של עירור תורמים ומקבלים. אם γ נקבעה באמצעות ניתוח הלבנת קבילות, ניתן היה לחשב β ממדגם של יחס ידוע בין תורם למקבל21. אחרת, מדגם FRET מרובה מצבים גם מניב β.
יחד, התיקונים מאפשרים חישוב של יעילות FRET המתוקנת באמצעות Eq (3).
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg"> (3)
ואת stoichiometry מתוקן באמצעות Eq (4).
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg"> (4)
באופן אידיאלי, הסטואיכיומטריה המתוקנת עבור יחס תורם למקבלה של 1:1 מעניקה S = 0.5. בפועל, יחס אות לרעש מופחת מייצר התפשטות של הערכים הנמדדים של S, ומעכב את האפליה מאותות תורמים בלבד (S = 1) ואותות קבלה בלבד (S = 0). מעקבי הזמן המתקבלים יכולים לשמש כקלט לניתוח מפורט יותר של מסלולי המולקולה הבודדת כדי לקבל מידע כגון פרופילי כוח מרחבי16, הניידות של אירועי המולקולה הבודדת22, או קינטיקת מעבר בין מצבים שונים1.
הפרוטוקול הבא מתאר פרמטרים ונהלים ניסיוניים לניסויי מעקב smFRET, כמו גם את עקרון העבודה מאחורי ניתוח נתונים באמצעות חבילת התוכנה שפותחה לאחרונה. לרכישת נתונים ניסיוניים, מומלץ להשתמש במערך מיקרוסקופיה העונה על הדרישות הבאות: i) יכולת לזהות פליטה של מולקולות צבע בודדות; ii) תאורת שדה רחב: במיוחד עבור ניסויים בתא חי, השתקפות פנימית כוללת (TIR23,24,25) תצורה מומלץ; iii) הפרדה מרחבית של אור פליטה על פי אורך גל, כך שפלואורסצנטיות של תורם ומקבל מוקרן על אזורים שונים של אותו שבב מצלמה25 או מצלמות שונות; iv) אפנון של מקורות אור עבור עירור תורם ומקבל עם דיוק אלפית שנייה, למשל, באמצעות לייזרים מווסתים ישירות או אפנון באמצעות אפננים אקוסטו-אופטיים. זה מאפשר תאורה סטרובוסקופית כדי למזער את ההלבנה פוטואורופורים של פלואורופורים, כמו גם עירור לסירוגין כדי לקבוע סטויצ'יומטריה; v) פלט של קובץ אחד לכל רצף תמונות מוקלט בתבנית שניתן לקרוא על-ידי חבילת PIMS Python26. בפרט, קבצי TIFF מרובי עמודים נתמכים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790404P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945; Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1084-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer microscope body</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET570/60m</td>
			<td>donor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET675/50m</td>
			<td>acceptor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conda-forge</td>
			<td>conda-forge community</td>
			<td></td>
			<td>community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td>
			<td>MENZEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>FF640-FDi01-25&#215;36</td>
			<td>separation of donor and acceptor emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (quad band)</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>Di01-R405/488/532/635-25&#215;36</td>
			<td>separation of excitation and emission light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fret-analysis</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python package for smFRET data analysis; version 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11524766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBeam Smart 405-S 405 nm laser</td>
			<td>Toptica Photonics AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek chambers (8 wells)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177402PK</td>
			<td>for sample preparation and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenia Prime 532 nm laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniconda</td>
			<td>Anaconda Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Python 3 distribution. Min. version: 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20860 &#38; 20859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBIS 640 nm laser</td>
			<td>Coherent Inc</td>
			<td>1185055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optosplit II</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5253</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sdt-python</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python library for data analysis; version 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpek bead size kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T14792</td>
			<td>Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USC500TH Ultrasound bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>for SUV formation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes

העברת אנרגיית תהודה Förster בעלת מולקולה אחת (smFRET) היא טכניקה רב-תכליתית המדווחת על מרחקים בטווח תת-ננומטר לננומטר. הוא שימש במגוון רחב של ניסויים ביולוגיים ביופיסיים ומולקולריים, כולל מדידת כוחות מולקולריים, אפיון הדינמיקה הקונפורמציה של ביומולקולות, תצפית על colocalization תאי של חלבונים, וקביעה של זמני אינטראקציה קולטן-ליגנד. בתצורת מיקרוסקופיה רחבת היקף, ניסויים מבוצעים בדרך כלל באמצעות בדיקות משותקות על פני השטח. כאן, מוצגת שיטה המשלבת מעקב אחר מולקולה אחת עם ניסויי smFRET עירור לסירוגין (ALEX), המאפשרת רכישה של עקבות זמן smFRET של בדיקות קשורות פני השטח, אך ניידות בממברנות פלזמה או bilayers השומנים הנתמכים בזכוכית. לצורך ניתוח נתונים מוקלטים, פותח אוסף אוטומטי בקוד פתוח התומך (i) בלוקליזציה של אותות פלואורסצנטיים, (ii) מעקב אחר חלקיקים בודדים, (iii) קביעת כמויות הקשורות ל- FRET כולל גורמי תיקון, (iv) אימות מחמיר של עקבות smFRET ו- (v) מצגת אינטואיטיבית של התוצאות. הנתונים שנוצרו יכולים לשמש בנוחות כקלט לחקירה נוספת באמצעות תוכנה מיוחדת, למשל, להערכת ההתנהגות הדיפוזית של בדיקות או לחקירה של מעברי FRET.

ניתן לחלץ מגוון של מידע ברמה נמוכה וגבוהה ממסלולי smFRET בהתאם לשאלה המדעית של הניסוי. כאן מוצגות דוגמאות של צינורות ניתוח עם בדיקות אנלוגיות ודיגיטליות: חיישן כוח מולקולרי מבוסס פפטיד16 ובדיקת DNA עם מיתוג סטוכסטי של הקונפורמציה שלו38, בהתאמה. עיין באיור 5 לקבלת עיקרון העיצוב והעבודה של בדיקות אלה.
לאחר שאלגוריתמי הלוקליזציה והמעקב בוצעו כמתואר בפרוטוקול, החבילה מציעה כלים מרובים להדמיית נתונים כדי למטב את הפרמטרים הראשוניים ואת שלבי הסינון הבאים: (i) הדמיה של אירועי smFRET בודדים, (ii) פילוח תמונה אופציונלי לניתוח נתונים באזורי עניין מסוימים, (iii) ניטור שלבי סינון באמצעות יעילות FRET לעומת התוויות stoichiometry (E-S). ההדמיה של נתוני המולקולה הבודדת מוצגת באיור 6.
לבסוף, אירועי FRET המסוננים מיוצגים על ידי עלילה E-S והיסטוגרמת יעילות FRET (איור 4). עלילת E-S היא כלי שימושי למיטוב שלבי הסינון הנ"ל ולחקירת התוצאה הסופית. חיישני FRET מולבנים חלקית או שאינם מסומנים במלואם יכולים להיות מוחרגים על ידי ערך הסטיוכיומטריה שלהם. ניתן לחקור פרמטרי ניידות על-ידי התוויית נתיב מסלול בודד בעלילת x-y (איור 6) או בהתוויית תזוזה מרובעת ממוצעת (MSD) (איור 4). השיטה הראשונה שימושית במיוחד להפלת הנייד מאירועים משותקים, ואילו האחרונה משמשת לחישוב מקדם הדיפוזיה.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> איור 4: פלט למופת. (A) היעילות FRET הוא שרטט לעומת stoichiometry (E-S חלקה) עבור אוכלוסייה של חיישן כוח מולקולרי (פאנל שמאלי) לקשט bilayer שומנים נתמך זכוכית מתוח על ידי תא T. רק ענן אוכלוסיה אחד נראה לעין. ההיסטוגרמה המתאימה של יעילות FRET מדגימה את ההבדל בין אוכלוסיית חיישני כוח בנוכחות והיעדר תאים (פאנל אמצעי). לא ניתן לראות מעבר ליעילות FRET נמוכה יותר של אוכלוסיית החיישנים בנוכחות תאי T, מה שמצביע על מתיחה מועטה עד אפסית של מודול החיישן. עלילת MSD של תנאים ניסיוניים אלה מאשרת כי אוכלוסיית חיישני הכוח מתחת לתא T נעה הרבה יותר לאט מאשר עמיתיהם הלא מאוגדים (פאנל ימני). (B) אותו ניתוח בוצע עם חיישן DNA צומת הולידיי לקשט bilayer נוזל נתמך זכוכית. העלילה E-S מראה בבירור שתי אוכלוסיות, אשר ניכרים גם בהיסטוגרמת יעילות FRET. תרשים MSD מציין את נוכחותה של אוכלוסיית חיישנים אחת הנעה במהירות. קיצורים: FRET = העברת אנרגיה תהודה Förster; MSD = תזוזה מרובעת ממוצעת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> איור 5: תכנון ועקרון עבודה של בדיקות FRET תוך מולקולריות. (A) חיישן פפטיד אנלוגי לכימות כוחות מולקולריים מכניים. פלואורופורים התורמים והמקבלים מחוברים באופן קוולנטי לשני קצותיו של עמוד השדרה הפפטיד. מודול החיישן מחובר במיוחד לליגנד מסוים, אשר בתורו קושר קולטן פני שטח תושב תא של עניין (כאן, שבר נוגדן המזהה במיוחד את שרשרת הבטא של קולטן תא T). בעת כריכת קולטן-ליגנד, מופעל כוח, ומודול החיישן מתרחב ובסופו של דבר נרתע לאחר מחשוף הקשר. לוח זה משתנה מ - 16. (ב) חיישן DNA דיגיטלי לכימות מעברי FRET. חיישן FRET מורכב מארבעה גדילי DNA היוצרים צומת הולידיי. פלואורופור התורם והמקבל מחוברים באופן קוולנטי לשני גדילים. צמתים הולידיי מחליפים לעתים קרובות את הקונפורמציה שלהם בהתאם לתנאי החיץ שמסביב. ניתן לפקח על המיתוג הסטוצ'סטי של קונפורמציות אלה על ידי כימות יעילות FRET של בדיקות בודדות. קיצורים: TCR = קולטן תא T; FRET = העברת אנרגיית תהודה של Förster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> איור 6: דוגמאות לוקליזציה ומעקב אחר בדיקות FRET. (א) היעילות של FRET והסטויכיומטריה של אירועים בודדים מחושבים על ידי כימות עוצמת הפלואורופור התורם בעת עירור התורם (D → D), הפלואורופור המקבל בעת עירור התורם (D → A), ופלואורופור המקבל על עירור מקבל (A → A). הסינון השכן הקרוב ביותר מונע הטיה על-ידי חפיפה של פונקציות של פריסת נקודות של פולטים קרובים. פילוח תמונות מאפשר למשתמש לבחור אירועי smFRET מסוימים המותאמים לשפות אחרות בתוך אזור מעניין (לדוגמה, תא או מיקרופטרן). כדוגמה לפילוח תמונות, תאי T הוכתמו ב- Fura-2 (מוצג משמאל) ונחשפו לסף אדפטיבי כדי לזהות את קצות התא (קו מנוקד כתום). סרגלי קנה מידה = 5 מיקרומטר. (B) מסלולי smFRET באמצעות חיישן הכוח המולקולרי. מסלולים בודדים ניתן לשרטט במישור x-y , לדמיין את התנהגות הדיפוזיה שלהם לוקליזציה (לוח שמאלי). יתר על כן, ניתן להתוות את האינטנסיביות של כל מסלול לאורך זמן כדי לזהות מעברי FRET או שלבי הלבנה (החלונית האמצעית מציגה את המסלול האדום מהלוח השמאלי). ניתן לדמיין את היעילות והסטיוקיומטריה של FRET המתקבלות באופן דומה (החלונית הימנית). (C) מסלולי smFRET באמצעות חיישן ה- DNA של צומת הולידיי. HBSS + 12 mM MgCl2 שימש כחוצץ במהלך המדידות. מלבד שלב הלבנת הקבלה לכאורה ליד סוף הרצף של דוגמאות אלה, ניתן לקבוע את התדירות של מעברי FRET עבור כל חיישן. צמתים הולידיי מחליפים את הקונפורמציה שלהם בתדר גבוה, בעוד שחיישן הכוח המולקולרי אינו מציג מעברי FRET. מידע זה מאפשר להתאים את התנאים הניסיוניים, כגון ההשהיה בין המסגרות, כדי להגדיל או להפחית את מספר המעברים שנצפו. קיצורים: FRET = העברת אנרגיה תהודה Förster; smFRET = מולקולה אחת FRET; HBSS = תמיסת המלח המאוזנת של האנק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
מידע משלים: לוקליזציה ומעקב אחר מולקולות בודדות (01. Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

מאמר זה מציג שיטה לניתוח spatiotemporal של נייד, מולקולה אחת Förster העברת אנרגיה תהודה (smFRET) מבוסס בדיקות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה. ערכת הכלים החדשה שפותחה מאפשרת לקבוע עקבות זמן smFRET של בדיקות נעות, כולל היעילות הנכונה של FRET ואת העמדות המולקולריות, כפונקציות של זמן.

ניתוח ספטיוטמפורלי דו-ממדי אוטומטי של בדיקות FRET ניידות בעלות מולקולה אחת

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

ניסויי FRET בעלי מולקולה אחת באמצעות גשושיות הקשורות לפני השטח בוצעו כמעט אך ורק על מולקולות משותקות בעבר. עם זאת, ביומולקולות רבות מפוזרות וניתן לנתח אותן בשיטה שלנו. שילוב של FRET מולקולה אחת עם מעקב מאפשר לנתח לא רק עקבות זמן חוסר FRET של בדיקות נעות, אלא גם לחקור היבטים מרחביים כגון התנהגות מפוזרת.השיטה שלנו תואמת למגוון בדיקות שונות המבוססות על FRET. לדוגמה, הוא יכול לספק תובנות לגבי כוחות מולקולריים, דינמיקה קונפורמציה וקינטיקה מחייבת בניסויים בתאים חיים. ניסויי FRET באיכות גבוהה של מולקולה אחת ידועים לשמצה כקשים לביצוע.לכימות אמין, חשוב להקליט נתונים ביחס אות לרעש טוב ומסלולי מולקולה אחת באורך מספיק. כדי להתחיל במדידה מדגמית, רגש את פלואורופורים התורם והמקבל לזמן תאורה מתאים תוך הפעלת המצלמה והמתן עד לקריאת המצלמה. חזור על עירור של התורם ומקבל פלואורופורים לחילופין.בחר את מספר החזרות להיות גדול מספיק כדי להבטיח צילום של לפחות פלואורופור אחד לכל בדיקה בתוך שדה הראייה המאפשר ניתוח צילום צעדים כדי להפלות אותות מולקולה אחת מצרגטים. ציין את רצף התאורה כדי לאפשר את בחירת מסגרות עירור התורם והמקבל וכן מסגרות לפילוח תמונות מתוך רצפי תמונות מוקלטים. בו-זמנית, נתח את ערכות הנתונים שנרשמו באמצעות אותן הגדרות תאורה.לשם כך, הקצה מזהה ותבנית התואמים לשמות הקבצים המתאימים של רצף התמונות לכל ערכת נתונים. בנוסף, הגדר ערכות נתונים ספציפיות למטרות מיוחדות כגון הקלטות של סמנים fiducial לרישום תמונה, פרופילי תאורת עירור לתיקון שדה שטוח, ודוגמאות אופציונליות לתורם בלבד ומקבל בלבד כדי לקבוע גורמי תיקון. לאחר מכן, בחר ערוצי פליטה ותמונות גולמיות אם שני הערוצים מוקלטים באמצעות מצלמה אחת.לשם כך, השתמש בווידג'ט הגרפי המתאים כדי לבחור אזורים מתאימים לפליטת תורמים ומקבלים, ולאחר מכן הפוך סמנים פימודיים לשפות אחרות בשני ערוצי הפליטה ולבצע רישום תמונה. השתמש בממשק המשתמש שסופק כדי למצוא את הפרמטרים המתאימים עבור אלגוריתם הלוקליזציה עבור ערוצי פליטת התורם והמקבל. לאחר מכן, הגדר פרמטרים של לוקליזציה של מולקולה אחת עבור בדיקות FRET בעת עירור התורם בסכום התמונות המתקבלות מפליטות תורמים ומקבלים, ולאחר מכן הגדר פרמטרים של לוקליזציה לבדיקות בעת עירור מקבל בערוץ פליטת המקבלים.לוקליזציה של בדיקות ה- FRET על עירור תורמים ומקבלים באופן עצמאי בכל המסגרות. התוצאות ממוזגות לטבלה אחת המכילה את מספר המסגרת המקורי, קואורדינטות דו-ממדיות ומזהה המפנה לקובץ תמונת המקור. כדי לעקוב ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות, בחר באפשרויות המתאימות עבור אלגוריתם Trackpy כדי לקשר לוקליזציה של בדיקות FRET למסלולים.לאחר מכן, באמצעות הפונקציונליות של תוכנת הניתוח, עבד נתוני תמונה עזר מרצף תמונות. חלץ תמונות נוספות שנרשמו כדי להקל על פילוח המסומן על-ידי S ברצף העירור. לבסוף, קבעו את פרופילי אורות עירור התורם והמקבלים ברחבי שדה הראייה מתמונות שנרשמו במדגם בעל תווית צפופה.עבור שלבי הסינון הראשוניים, מחק אותות עם פונקציות של התפשטות נקודות חופפות מכיוון שקשה לקבוע את עוצמות הפלואורסצנטיות שלהם באופן אמין. במקרה של תאורה לאהומוגנית, קבל רק אותות הממוקמים באזורים מוארים היטב בתוך שדה הראייה כדי להבטיח יחס אות לרעש טוב. אם אתה לומד FRET תוך גולגולתי, הגבל את הניתוח למסלולים הקיימים מתחילת רצף התמונות.לאחר מכן, בצע את תיקון השדה השטוח, המשתמש בפרופילי מקור אור עירור שהושגו קודם לכן כדי להפוך את וריאציות עוצמת הפלואורסצנטיות התלויות במיקום הנגרמות על ידי תאורה לא הומוגנית, ולאחר מכן לחשב את יעילות FRET לכאורה ואת stoichiometry לכאורה. כדי לבצע ניתוח צעדי של הלבנת פוטוקלור להפלות בין בדיקות מולקולריות בודדות לבין אגרגטים, מצא פרמטרים מתאימים לאלגוריתם זיהוי נקודת השינוי על עירור התורם והמקבל באופן עצמאי. לאחר מכן בצע את אלגוריתם זיהוי נקודת השינוי.כדי להסיר רצועה המציגה אופן פעולה רב-משמעי של הלבנת פוטו,הגדר סף עוצמה שמתחתיו פלואורופור נחשב מולבן, ולאחר מכן בחר אחת מהאפשרויות הבאות. אפשרות ראשונה שבה הפלואורופור מקבל מלבין בצעד אחד בעוד התורם אינו מראה הלבנה חלקית. אפשרות שנייה שבה התורם מלבין בצעד אחד בזמן שאין הלבנת קבלה חלקית.אפשרות שלישית שבה כל הפלואורופור מלבין בצעד אחד בעוד השני אינו אקונומיקה חלקית. ואפשרות 4 שבה פלואורופורים של תורמים ומקבלים מראים צילום חד-שלבי או בלי הלבנת תמונות כלל. לאחר מכן חשב את גורמי התיקון עבור דליפת פליטת תורמים לערוץ המקובל, עירור קבל ישיר, יעילות זיהוי ויעילות עירור.לאחר מכן, השתמש בגורמי התיקון כדי לחשב את יעילות FRET מיעילות לכאורה וסטואיכיומטריה מסטויצ'ומטריה לכאורה. לסינון נוסף, בחר רק נקודות נתונים מלפני אירוע ההלבנה הראשון בכל מסלול. בנוסף, כדי להגביל את הניתוח לבדיקות מולקולה אחת, לקבל רק מסלולים עם לפחות 75% של נקודות נתונים בתוך גבולות stoichiometry המתאימים.לאחר מכן בצעו פילוח תמונות באמצעות שיטות סף כלליות או אדפטיביות בתמונות העזר המתאימות כדי להגביל את הניתוח לאזורים נפרדים בתוך שדה הראייה. צור יעילות לעומת התוויות סטויצ'ומטריה כדי לוודא שאותות של סטויצ'ומטריה שגויה זוהו והוסרו כראוי. לאחר מכן התווה היסטוגרמה של יעילות FRET כדי לספק סקירה מבוססת היטב של הפצות יעילות FRET ולקבץ את ההיסטוגרמות להשוואה נוחה של תוצאות מניסויים שונים.תוך ניצול ספריות פייתון מדעיות, ניתן להעריך עוד יותר את הנתונים בתוך המחברת, ולבצע, למשל, ניתוח דיפוזיה. הדמיה ומעקב אחר אירוע FRET של מולקולה אחת מוצגים כאן. אירועי FRET מסוננים מיוצגים על-ידי יעילות לעומת התוויות סטויצ'ומטריה בהיסטוגרמת יעילות FRET.יתר על כן, ניתן לחקור פרמטרי ניידות על-ידי התוויית נתיב מסלול בודד בעלילת XY או עלילת תזוזה מרובעת ממוצעת. הפלט של הפלטפורמה שלנו מאפשר לנו לזהות עוד יותר מעברים בעקבות זמן היעילות של FRET של בדיקות ניידות. לדוגמה, כדי להעריך שינויים קונפורמציה של ביומולקולות.באמצעות חיישן כוח מבוסס FRET, פלטפורמת הניתוח אפשרה לנו לכמת אירועי כוח של מולקולה אחת בתוך הסינפסה החיסונית במהלך איתות תאי T מוקדם.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

כמותית סריג ניתוח (תהודת העברת אנרגית פורסטר) לקביעת SENP1 פרוטאז קינטיקס

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

ניתוח התכווצות האוטומטי של רקמת לב Engineered האנוש להקרנת בטיחות תרופת לב

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...