Name: automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
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इस काम को ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (एफडब्ल्यूएफ) परियोजनाओं P30214-N36, P32307-B, और वियना विज्ञान और प्रौद्योगिकी कोष (WWTF) LS13-030 द्वारा समर्थित किया गया था।

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	<li>McKinney, S. A., D&#233;clais, A. -. C., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+individual+holliday+junctions.">Structural dynamics of individual holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).</li><li>Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. 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लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

यह लेख स्वचालित रिकॉर्डिंग और smFRET डेटा के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक पाइपलाइन का विवरण देता है जो मोबाइल अभी तक सतह-टेदर जांच अणुओं से उत्पन्न होता है। यह smFRET प्रयोगों के लिए दो प्रमुख दृष्टिकोणों को पूरक करता है, जिसमें या तो सतह-स्थिर जांच या एक confocal उत्तेजना वॉल्यूम 17 के अंदर और बाहर समाधान में diffusing जांच शामिल है। यह सही FRET दक्षता और समय के एक समारोह के रूप में आणविक पदों प्रदान करता है. इसलिए इसका उपयोग विशेष विश्लेषण कार्यक्रमों के लिए इनपुट के रूप में किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, संक्रमण कैनेटीक्स 1, FRET हिस्टोग्राम 39, या दो-आयामी प्रसार 22 को मापने के लिए।
सॉफ्टवेयर को ओपन सोर्स इनिशिएटिव द्वारा अनुमोदित एक मुक्त और ओपन-सोर्स लाइसेंस के तहत जारी किया गया है जो उपयोगकर्ता को मुफ्त उपयोग, संशोधन और पुनर्वितरण का निरंतर अधिकार प्रदान करता है। गिथब को एक विकास और वितरण मंच के रूप में चुना गया था ताकि सॉफ़्टवेयर प्राप्त करने और बग की रिपोर्टिंग या code40 का योगदान करके विकास प्रक्रिया में भाग लेने के लिए जितना संभव हो सके उतना आसान हो सके। पायथन में लिखा गया, सॉफ़्टवेयर मालिकाना घटकों पर निर्भर नहीं करता है। उपयोगकर्ता इंटरफेस के रूप में Jupyter नोटबुक की पसंद हर विश्लेषण चरण में डेटा के निरीक्षण की सुविधा प्रदान करता है और हाथ में प्रयोगात्मक प्रणाली के लिए विशेष रूप से पाइपलाइन को सिलाई और विस्तारित करने की अनुमति देता है। एसडीटी-पायथन लाइब्रेरी 32 नींव के रूप में कार्य करता है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी डेटा का मूल्यांकन करने के लिए कार्यक्षमता को लागू करता है, जैसे कि एकल-अणु स्थानीयकरण, प्रसार विश्लेषण, प्रतिदीप्ति तीव्रता विश्लेषण, रंग चैनल पंजीकरण, सहस्थानीयकरण विश्लेषण और आरओआई हैंडलिंग।
सिद्धांत रूप में, एकल-कण ट्रैकिंग को एक-, दो- या तीन-आयामी प्रणालियों में किया जा सकता है। यहां, एकल-अणु विश्लेषण पाइपलाइन को 2 डी मोबाइल सिस्टम के अध्ययन के अनुरूप बनाया गया था। यह विकल्प मोबाइल फ्लोरोसेंट जांच पेश करने के लिए सरल प्रणालियों की उपलब्धता को प्रतिबिंबित करता है, जैसे कि प्लानर-समर्थित लिपिड बाईलेयर (एसएलबी)। इस तरह के लिपिड बाईलेयर सिस्टम आमतौर पर दो या दो से अधिक फॉस्फोलिपिड्स moieties से बने होते हैं, जहां थोक अंश एसएलबी (जैसे चरण और चिपचिपाहट) के प्रमुख भौतिक-रासायनिक मापदंडों को निर्धारित करता है, और मामूली अंश बायोमोलेक्यूल्स के लिए अनुलग्नक साइटें प्रदान करता है। इन अनुलग्नक साइटों को एविडिन के लिए बायोटिनिलेटेड फॉस्फोलिपिड्स- या स्ट्रेप्टाविडिन-आधारित प्रोटीन प्लेटफार्मों या हिस्टिडीन टैग 41 के साथ प्रोटीन प्लेटफार्मों के लिए निकल-एनटीए संयुग्मित फॉस्फोलिपिड्स हो सकते हैं। एसएलबी के लिए प्रोटीन को जोड़ने के लिए उपयुक्त मंच का विकल्प वैज्ञानिक प्रश्न पर निर्भर करता है। पाठक सफलतापूर्वक नियोजित रणनीतियों के उदाहरणों के लिए साहित्य 16,38,42 का उल्लेख कर सकते हैं। ओवरलैपिंग बिंदु प्रसार कार्यों से बचने के लिए नमूने में जांच का घनत्व पर्याप्त रूप से कम होना चाहिए; आमतौर पर, प्रति μm2 0.1 अणुओं से कम की सिफारिश की जाती है। एक उपयुक्त जांच घनत्व दिखाने वाले उदाहरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग (विशेष रूप से, चित्रा 6) देखें। विश्लेषण विधि एकल फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन अणुओं पर भी लागू होती है जो जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में अलग हो जाती है।
SMFRET प्रयोगों का एक महत्वपूर्ण पहलू FRET जांच का उत्पादन और लक्षण वर्णन स्वयं है। एक FRET जोड़ी के लिए fluorophores का चयन करते समय, उनके Förster त्रिज्या अपेक्षित अंतर डाई दूरी 43 से मेल खाना चाहिए. फोटोब्लीचिंग के लिए प्रतिरोधी रंजक को पसंद किया जाता है क्योंकि वे लंबे समय तक निशान प्राप्त करते हैं। हालांकि, उन्नत ब्लीचिंग दरों के लिए, एक फ्लोरोफोर प्रजातियों का उपयोग स्टेपवाइज फोटोब्लीचिंग विश्लेषण के माध्यम से कोलोकलाइज्ड अणुओं से उत्पन्न होने वाली मल्टीएमिटर घटनाओं को पहचानने के लिए किया जा सकता है; प्रोटोकॉल अनुभाग में चरण 8.1.4 देखें। फ्लोरोफोर जोड़े साइट-विशेष रूप से और सहसंयोजक रूप से ब्याज के अणुओं से जुड़े होने चाहिए, इंट्रा- या इंटरमॉलिक्युलर फ्रेट जोड़े बनाते हैं।
अन्य आसानी से उपलब्ध तकनीकों के साथ smFRET के संयोजन से विवर्तन सीमा (STED44 के माध्यम से) से परे अपने स्थानिक संकल्प को बढ़ाया जा सकता है। यहां प्रस्तुत smFRET ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म नए प्रयोगात्मक सेटिंग्स और मॉडल सिस्टम के लिए दृष्टिकोण की प्रयोज्यता को चौड़ा करता है। इसमें (i) मोबाइल बायोमोलेक्यूल्स के स्टोइकोमेट्री में गतिज परिवर्तन, (ii) मोबाइल बायोमोलेक्यूल्स का गतिशील संबंध, (iii) स्वतंत्र रूप से अलग-अलग अभिकारकों की एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं की दर, और (iv) मोबाइल बायोमोलेक्यूल्स के संरचनात्मक परिवर्तनों के कैनेटीक्स का अध्ययन शामिल है। पहले दो उदाहरणों के लिए मॉडल सिस्टम की आवश्यकता होती है जो इंटरमॉलिक्युलर फ्रेट दिखाते हैं, यानी, दाता और स्वीकर्ता को ब्याज की बायोमोलेक्यूलर संस्थाओं को अलग करने के लिए संयुग्मित किया जाता है। उत्तरार्द्ध उदाहरण एक ही आणविक इकाई (इंट्रामोलेक्यूलर फ्रेट) के भीतर दाता और स्वीकर्ता को ले जाने वाले बायोसेंसर का उपयोग कर सकते हैं।
इंट्रामोलेक्यूलर FRET-आधारित सेंसर बायोमोलेक्यूल्स 1,2,3,4 के आंतरिक संरचनात्मक परिवर्तनों, अंतर्जात या बाहरी बल लोड (आणविक बल सेंसर 16) के कारण होने वाले संरचनात्मक परिवर्तनों, या नैनो-पर्यावरण में आयन सांद्रता जैसे कैल्शियम 45 और पीएच 46 में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। . मॉडल प्रणाली और पसंदीदा एंकरिंग प्लेटफ़ॉर्म के आधार पर, इस तरह की smFRET घटनाओं को या तो 2D या 3D में ट्रैक किया जा सकता है: (i) smFRET घटनाओं के प्लानर ट्रैकिंग को प्लाज्मा झिल्ली के भीतर रिसेप्टर-लिगैंड इंटरैक्शन समय के परिमाणीकरण के लिए नियोजित किया जा सकता है, झिल्ली-लंगर वाले सिग्नल प्रवर्धन कैस्केड का संबंध, और सतह रिसेप्टर्स के स्टोइकोमेट्री परिवर्तन; (ii) एसएमएफआरईटी घटनाओं की मात्रा ट्रैकिंग का उपयोग जीवित कोशिकाओं या इन विट्रो पुनर्गठित प्रणालियों में किसी भी इंट्रा- या इंटरमॉलिक्युलर फ्रेट जांच के लिए किया जा सकता है।
smFRET ट्रैकिंग विधि मुख्य रूप से दिमाग में intramolecular FRET जांच के साथ विकसित किया गया था। इन जांचों में फ्लोरोसेंट लेबल की एक निश्चित और अच्छी तरह से ज्ञात संख्या होती है, एक तथ्य जो समूहीकृत और गलत तरीके से संश्लेषित (जैसे, अपूर्ण रूप से लेबल किए गए) अणुओं से डेटा को अस्वीकार करने के लिए शोषण किया गया था, साथ ही साथ जांच से जहां फ्लोरोफोर में से एक को फोटोब्लीच किया गया है। हालांकि, फ़िल्टरिंग चरणों को समायोजित करके, विधि को इंटरमॉलिक्युलर FRET जांच पर भी लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, केवल एक ही दाता और एक एकल स्वीकर्ता फ्लोरोफोर की विशेषता वाले अणुओं को स्वीकार करने के बजाय, कोई भी दाता और स्वीकर्ता रंजक के स्थानिक प्रक्षेपवक्रों की जांच कर सकता है और उदाहरण के लिए, दाता-स्वीकर्ता प्रक्षेपवक्रों को सह-अलग करने के लिए चुन सकता है।
चूंकि 3D-DAOSTORM एल्गोरिथ्म में उत्सर्जन बीम पथ में एक बेलनाकार लेंस के कारण अस्थिरता के माध्यम से ऑप्टिकल अक्ष के साथ सिग्नल की स्थिति का निर्धारण करने के लिए समर्थन है, 3 डी प्रयोगों को आसानी से विश्लेषण पाइपलाइन में एकीकृत किया जा सकता है। इस मामले में, स्वीकर्ता उत्तेजना पर स्वीकर्ता संकेत स्टोइकोइमेट्री और अक्षीय स्थिति को निर्धारित करने के लिए काम करेगा। विश्लेषण सॉफ़्टवेयर को स्वचालन और फ़िल्टरिंग योजनाओं की अपनी बड़ी डिग्री का उपयोग करके स्थिर जांच की विशेषता वाले प्रयोगों से डेटा का मूल्यांकन करने के लिए भी नियोजित किया जा सकता है। वास्तव में, जेल-चरण बाईलेयर 38 पर स्थिर होलिडे जंक्शनों से smFRET दक्षता डेटासेट का विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के शुरुआती संस्करण का उपयोग करके किया गया था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790404P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945; Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1084-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer microscope body</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET570/60m</td>
			<td>donor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET675/50m</td>
			<td>acceptor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conda-forge</td>
			<td>conda-forge community</td>
			<td></td>
			<td>community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td>
			<td>MENZEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>FF640-FDi01-25&#215;36</td>
			<td>separation of donor and acceptor emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (quad band)</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>Di01-R405/488/532/635-25&#215;36</td>
			<td>separation of excitation and emission light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fret-analysis</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python package for smFRET data analysis; version 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11524766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBeam Smart 405-S 405 nm laser</td>
			<td>Toptica Photonics AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek chambers (8 wells)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177402PK</td>
			<td>for sample preparation and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenia Prime 532 nm laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniconda</td>
			<td>Anaconda Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Python 3 distribution. Min. version: 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20860 &#38; 20859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBIS 640 nm laser</td>
			<td>Coherent Inc</td>
			<td>1185055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optosplit II</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5253</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sdt-python</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python library for data analysis; version 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpek bead size kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T14792</td>
			<td>Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USC500TH Ultrasound bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>for SUV formation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes

एकल-अणु Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (smFRET) एक बहुमुखी तकनीक नैनोमीटर रेंज के लिए उप-नैनोमीटर में दूरी पर रिपोर्टिंग है। इसका उपयोग बायोफिजिकल और आणविक जैविक प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में किया गया है, जिसमें आणविक बलों का माप, बायोमोलेक्यूल्स की संरचनात्मक गतिशीलता का लक्षण वर्णन, प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर कोलोकलाइजेशन का अवलोकन और रिसेप्टर-लिगैंड इंटरैक्शन समय का निर्धारण शामिल है। एक वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी कॉन्फ़िगरेशन में, प्रयोग आमतौर पर सतह-स्थिर जांच का उपयोग करके किए जाते हैं। यहां, वैकल्पिक उत्तेजना (एलेक्स) smFRET प्रयोगों के साथ एकल-अणु ट्रैकिंग के संयोजन की एक विधि प्रस्तुत की जाती है, जो प्लाज्मा झिल्ली या ग्लास-समर्थित लिपिड बाईलेयर में सतह-बाध्य, फिर भी मोबाइल जांच के smFRET समय के निशान के अधिग्रहण की अनुमति देती है। रिकॉर्ड किए गए डेटा के विश्लेषण के लिए, एक स्वचालित, ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर संग्रह विकसित किया गया था जो (i) फ्लोरोसेंट संकेतों का स्थानीयकरण, (ii) एकल-कण ट्रैकिंग, (iii) सुधार कारकों सहित FRET-संबंधित मात्राओं का निर्धारण, (iv) smFRET निशान का कठोर सत्यापन, और (v) परिणामों की सहज ज्ञान युक्त प्रस्तुति का समर्थन करता है। उत्पन्न डेटा को विशेष सॉफ़्टवेयर के माध्यम से आगे की खोज के लिए इनपुट के रूप में आसानी से उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, जांच के प्रसार व्यवहार के मूल्यांकन या FRET संक्रमण की जांच के लिए।

प्रयोग के वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर smFRET पटरियों से विभिन्न प्रकार की निम्न और उच्च-स्तरीय जानकारी निकाली जा सकती है। यहां, एनालॉग और डिजिटल जांच के साथ विश्लेषण पाइपलाइनों के उदाहरण प्रस्तुत किए गए हैं: एक पेप्टाइड-आधारित आणविक बल सेंसर 16 और क्रमशः इसकी संरचना 38 के स्टोकेस्टिक स्विचिंग के साथ एक डीएनए जांच। इन जांचों के डिजाइन और कार्य सिद्धांत के लिए चित्रा 5 देखें।
प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में स्थानीयकरण और ट्रैकिंग एल्गोरिदम निष्पादित किए जाने के बाद, पैकेज प्रारंभिक मापदंडों और बाद के फ़िल्टर चरणों को अनुकूलित करने के लिए कई डेटा विज़ुअलाइज़ेशन टूल प्रदान करता है: (i) व्यक्तिगत smFRET घटनाओं का विज़ुअलाइज़ेशन, (ii) हितों के कुछ क्षेत्रों में डेटा का विश्लेषण करने के लिए वैकल्पिक छवि विभाजन, (iii) FRET दक्षता बनाम स्टोइकोइमेट्री (ई-एस) भूखंडों के माध्यम से फ़िल्टर चरणों की निगरानी। एकल-अणु डेटा का विज़ुअलाइज़ेशन चित्र 6 में प्रस्तुत किया गया है।
अंत में, फ़िल्टर किए गए FRET ईवेंट को एक E-S प्लॉट और एक FRET दक्षता हिस्टोग्राम (चित्रा 4) द्वारा दर्शाया जाता है। ई-एस प्लॉट उपर्युक्त फ़िल्टरिंग चरणों को अनुकूलित करने और अंतिम परिणाम की जांच करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। आंशिक रूप से ब्लीच किए गए या अपूर्ण रूप से लेबल किए गए FRET सेंसर को उनके स्टोइकोमेट्री मूल्य द्वारा बाहर रखा जा सकता है। गतिशीलता पैरामीटर की जांच एक एक्स-वाई प्लॉट (चित्रा 6) या एक माध्य वर्ग विस्थापन (एमएसडी) प्लॉट (चित्रा 4) में एक व्यक्तिगत प्रक्षेपवक्र पथ की साजिश करके की जा सकती है। पहली विधि विशेष रूप से immobilized घटनाओं से मोबाइल भेदभाव के लिए उपयोगी है, जबकि उत्तरार्द्ध प्रसार गुणांक की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है।
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> चित्रा 4: अनुकरणीय आउटपुट. (ए) FRET दक्षता को आणविक बल सेंसर (बाएं पैनल) की आबादी के लिए स्टोइकोमेट्री (ई-एस प्लॉट) बनाम प्लॉट किया जाता है जो एक ग्लास-समर्थित लिपिड बाईलेयर को सजाता है और एक टी सेल द्वारा तनावपूर्ण होता है। केवल एक जनसंख्या बादल दिखाई दे रहा है। FRET दक्षताओं का संबंधित हिस्टोग्राम कोशिकाओं (मध्य पैनल) की उपस्थिति और अनुपस्थिति में एक बल सेंसर आबादी के बीच के अंतर का उदाहरण देता है। टी कोशिकाओं की उपस्थिति में सेंसर आबादी की कम FRET दक्षताओं के लिए कोई बदलाव नहीं देखा जा सकता है, सेंसर मॉड्यूल के कोई बल-निर्भर खिंचाव के लिए बहुत कम संकेत देता है। इन प्रयोगात्मक स्थितियों का एमएसडी प्लॉट इस बात की पुष्टि करता है कि टी सेल के नीचे बल सेंसर आबादी उनके अनबाउंड समकक्षों (दाएं पैनल) की तुलना में काफी धीमी गति से चलती है। (बी) एक ही विश्लेषण Holliday जंक्शन डीएनए सेंसर के साथ एक ग्लास समर्थित तरल पदार्थ लिपिड बाईलेयर सजाने के साथ किया गया था। ई-एस प्लॉट स्पष्ट रूप से दो आबादी को दिखाता है, जो FRET दक्षता हिस्टोग्राम में भी स्पष्ट हैं। एमएसडी प्लॉट एक तेजी से आगे बढ़ने वाली सेंसर आबादी की उपस्थिति को इंगित करता है। संक्षेप: FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; MSD = मतलब वर्ग विस्थापन. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> चित्रा 5: इंट्रामॉलिक्युलर FRET जांच का डिजाइन और काम करने का सिद्धांत( A) यांत्रिक आणविक बलों के परिमाणीकरण के लिए एनालॉग पेप्टाइड सेंसर। दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोरस पेप्टाइड बैकबोन के दोनों छोर से सहसंयोजक रूप से जुड़े होते हैं। सेंसर मॉड्यूल साइट-विशेष रूप से एक विशिष्ट लिगैंड से जुड़ा हुआ है, जो बदले में ब्याज के एक सेल-निवासी सतह रिसेप्टर को बांधता है (यहां, एक एंटीबॉडी टुकड़ा विशेष रूप से टी सेल रिसेप्टर की बीटा श्रृंखला को पहचानता है)। रिसेप्टर-लिगैंड बाइंडिंग पर, बल लगाया जाता है, और सेंसर मॉड्यूल फैलता है और अंततः बॉन्ड क्लीवेज के बाद पीछे हट जाता है। इस पैनल को 16 से संशोधित किया गया है। (बी) फ्रेट संक्रमणों के परिमाणीकरण के लिए डिजिटल डीएनए सेंसर। FRET सेंसर चार डीएनए किस्में एक Holliday जंक्शन बनाने से बना है. दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोर सहसंयोजक रूप से दो किस्में से जुड़े होते हैं। Holliday जंक्शनों अक्सर आसपास के बफर स्थितियों के आधार पर अपनी संरचना स्विच. इन संरचनाओं के स्टोकेस्टिक स्विचिंग की निगरानी व्यक्तिगत जांच की FRET दक्षता को परिमाणित करके की जा सकती है। संक्षिप्त रूप: TCR = T सेल रिसेप्टर; FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> चित्रा 6: स्थानीयकरण और FRET जांच की ट्रैकिंग के उदाहरण. (ए) व्यक्तिगत घटनाओं की FRET दक्षता और स्टोइकोइमेट्री की गणना दाता उत्तेजना (डी → डी), दाता उत्तेजना (डी → ए) पर स्वीकर्ता फ्लोरोफोर और स्वीकर्ता उत्तेजना (ए → ए) पर स्वीकर्ता फ्लोरोफोर की तीव्रता को निर्धारित करके की जाती है। निकटतम पड़ोसी फ़िल्टरिंग बंद emitters के अतिव्यापी बिंदु प्रसार कार्यों द्वारा पूर्वाग्रह को रोकता है। छवि विभाजन उपयोगकर्ता को ब्याज के क्षेत्र के भीतर स्थानीयकृत कुछ smFRET घटनाओं को चुनने की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, एक सेल या एक माइक्रोपैटर्न)। छवि विभाजन के एक उदाहरण के रूप में, टी कोशिकाओं को फुरा -2 (बाईं ओर प्रदर्शित) के साथ दाग दिया गया था और सेल किनारों (नारंगी बिंदीदार रेखा) की पहचान करने के लिए अनुकूली थ्रेशोल्डिंग के अधीन किया गया था। स्केल सलाखों = 5 μm. (बी) smFRET trajectories आणविक बल सेंसर का उपयोग कर. अलग-अलग प्रक्षेपवक्रों को एक्स-वाई विमान में प्लॉट किया जा सकता है, उनके प्रसार व्यवहार और स्थानीयकरण (बाएं पैनल) की कल्पना की जा सकती है। इसके अलावा, प्रत्येक प्रक्षेपवक्र की तीव्रता को समय के साथ फ्रेट संक्रमण या ब्लीचिंग चरणों की पहचान करने के लिए प्लॉट किया जा सकता है (मध्य पैनल बाएं पैनल से लाल प्रक्षेपवक्र दिखाता है)। परिणामी FRET दक्षता और stoichiometry इसी तरह (सही पैनल) कल्पना की जा सकती है। (सी) होलिडे जंक्शन डीएनए सेंसर का उपयोग करके smFRET trajectories। HBSS + 12 mM MgCl2 का उपयोग माप के दौरान एक बफर के रूप में किया गया था। इन उदाहरणों के अनुक्रम अंत के पास स्पष्ट स्वीकर्ता ब्लीचिंग चरण के अलावा, प्रत्येक सेंसर के लिए FRET संक्रमण की आवृत्ति निर्धारित की जा सकती है। Holliday जंक्शनएक उच्च आवृत्ति के साथ अपनी संरचना स्विच, जबकि आणविक बल सेंसर FRET संक्रमण प्रदर्शित नहीं करता है. यह जानकारी प्रयोगात्मक स्थितियों को समायोजित करना संभव बनाती है, जैसे कि फ्रेम के बीच देरी, मनाया संक्रमण की संख्या को बढ़ाने या कम करने के लिए। संक्षेप: FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; smFRET = एकल अणु FRET; HBSS = हांक का संतुलित नमक समाधान। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
पूरक जानकारी: एकल अणुओं का स्थानीयकरण और ट्रैकिंग (01). Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।</a>

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Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

यह लेख मोबाइल, एकल-अणु Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (smFRET) के spatiotemporal विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है- वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके आधारित जांच। नव विकसित सॉफ्टवेयर टूलकिट समय के कार्यों के रूप में सही FRET दक्षता और आणविक पदों सहित चलती जांच के smFRET समय के निशान के निर्धारण की अनुमति देता है।

मोबाइल एकल अणु FRET जांच के स्वचालित दो आयामी Spatiotemporal विश्लेषण

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

सतह-बाध्य जांच का उपयोग करके एकल-अणु FRET प्रयोगों को अतीत में स्थिर अणुओं पर लगभग विशेष रूप से किया गया है। हालांकि, कई biomolecules फैलाना और हमारी विधि के साथ विश्लेषण किया जा सकता है। ट्रैकिंग के साथ एकल-अणु FRET का संयोजन न केवल चलती जांच के FRET की कमी के समय के निशान का विश्लेषण करना संभव बनाता है, बल्कि प्रसार व्यवहार जैसे spatiotemporal पहलुओं की जांच करने के लिए भी संभव बनाता है।हमारी विधि विभिन्न FRET-आधारित जांच की एक किस्म के साथ संगत है. उदाहरण के लिए, यह लाइव सेल प्रयोगों में आणविक बलों, संरचनात्मक गतिशीलता और बाध्यकारी कैनेटीक्स से संबंधित अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। उच्च गुणवत्ता वाले एकल-अणु FRET प्रयोगों को प्रदर्शन करना कुख्यात रूप से कठिन है।विश्वसनीय परिमाणीकरण के लिए, एक अच्छे सिग्नल-टू-शोर अनुपात और पर्याप्त लंबाई के एकल-अणु पटरियों पर डेटा रिकॉर्ड करना महत्वपूर्ण है। नमूना माप शुरू करने के लिए, कैमरे को ट्रिगर करते समय एक उपयुक्त रोशनी समय के लिए दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोरस को उत्तेजित करें और कैमरा रीडआउट सक्षम होने तक प्रतीक्षा करें। दाता और स्वीकारकर्ता fluorophores वैकल्पिक रूप से की उत्तेजना को दोहराएँ.पुनरावृत्तियों की संख्या चुनें जो पर्याप्त रूप से बड़ी हो ताकि दृश्य के क्षेत्र में प्रति जांच कम से कम एक फ्लोरोफोर की फोटोब्लीचिंग सुनिश्चित की जा सके, जिससे समुच्चय से एकल-अणु संकेतों को भेदभाव करने के लिए चरणबद्ध फोटोब्लीचिंग विश्लेषण की अनुमति मिल सके। दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना फ्रेम के चयन के साथ-साथ रिकॉर्ड किए गए छवि अनुक्रमों से छवि विभाजन के लिए फ्रेम की अनुमति देने के लिए रोशनी अनुक्रम निर्दिष्ट करें। साथ ही, एक ही रोशनी सेटिंग्स का उपयोग करके रिकॉर्ड किए गए डेटासेट का विश्लेषण करें।इस अंत में, एक पहचानकर्ता और एक पैटर्न असाइन करें जो प्रत्येक डेटासेट के लिए संबंधित छवि अनुक्रम फ़ाइल नामों से मेल खाता है। इसके अतिरिक्त, विशेष उद्देश्यों के लिए विशिष्ट डेटासेट को परिभाषित करें जैसे कि छवि पंजीकरण के लिए फिड्यूशियल मार्करों की रिकॉर्डिंग, फ्लैट फ़ील्ड सुधार के लिए उत्तेजना प्रकाश प्रोफाइल, और वैकल्पिक रूप से दाता-केवल और स्वीकारकर्ता-केवल नमूने सुधार कारकों को निर्धारित करने के लिए। इसके बाद, उत्सर्जन चैनलों और कच्ची छवियों का चयन करें यदि दोनों चैनलों को एक ही कैमरे का उपयोग करके रिकॉर्ड किया जाता है।इसके लिए, दाता और स्वीकर्ता उत्सर्जन के लिए उपयुक्त क्षेत्रों का चयन करने के लिए उपयुक्त ग्राफिकल विजेट का उपयोग करें, फिर दोनों उत्सर्जन चैनलों में फिड्यूशियल मार्करों को स्थानीयकृत करें और छवि पंजीकरण करें। दाता और स्वीकर्ता उत्सर्जन चैनलों दोनों के लिए स्थानीयकरण एल्गोरिथ्म के लिए उपयुक्त पैरामीटर खोजने के लिए प्रदान किए गए उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस का उपयोग करें। इसके बाद, दाता और स्वीकर्ता उत्सर्जन से प्राप्त छवियों के योग में दाता उत्तेजना पर FRET जांच के लिए एकल-अणु स्थानीयकरण पैरामीटर सेट करें, फिर स्वीकर्ता उत्सर्जन चैनल में स्वीकर्ता उत्तेजना पर जांच के लिए स्थानीयकरण पैरामीटर सेट करें।सभी फ्रेम में स्वतंत्र रूप से दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना पर FRET जांच स्थानीयकरण. परिणाम एक तालिका में मर्ज किए जाते हैं जिसमें मूल फ़्रेम संख्या, दो-आयामी निर्देशांक और स्रोत छवि फ़ाइल का उल्लेख करने वाला पहचानकर्ता होता है. प्रतिदीप्ति तीव्रता को ट्रैक करने और मापने के लिए, प्रक्षेपवक्र में FRET जांच स्थानीयकरण को लिंक करने के लिए Trackpy एल्गोरिथ्म के लिए उपयुक्त विकल्प चुनें।अगला, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर कार्यक्षमता का उपयोग करके, छवि अनुक्रमों से सहायक छवि डेटा को संसाधित करें। उत्तेजना अनुक्रम में एस द्वारा चिह्नित विभाजन की सुविधा के लिए दर्ज अतिरिक्त छवियों को निकालें। अंत में, एक घनी लेबल वाले नमूने पर दर्ज की गई छवियों से दृश्य के क्षेत्र में दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना प्रकाश प्रोफाइल निर्धारित करें।प्रारंभिक फ़िल्टरिंग चरणों के लिए, ओवरलैपिंग पॉइंट स्प्रेड फ़ंक्शंस के साथ संकेतों को छोड़ दें क्योंकि उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता को मज़बूती से निर्धारित करना मुश्किल है। असंगत रोशनी के मामले में, अच्छे सिग्नल-टू-शोर अनुपात को सुनिश्चित करने के लिए दृश्य के क्षेत्र के भीतर अच्छी तरह से प्रबुद्ध क्षेत्रों में स्थित केवल संकेतों को स्वीकार करें। यदि इंट्रामॉलिक्युलर FRET का अध्ययन कर रहे हैं, तो विश्लेषण को छवि अनुक्रम की शुरुआत से मौजूद उन प्रक्षेपवक्रों तक सीमित करें।इसके बाद, फ्लैट फील्ड सुधार को निष्पादित करें, जो पहले प्राप्त उत्तेजना प्रकाश स्रोत प्रोफाइल का उपयोग करता है ताकि असमान रोशनी के कारण होने वाली स्थिति-निर्भर प्रतिदीप्ति तीव्रता भिन्नताओं को उलट दिया जा सके, फिर स्पष्ट FRET दक्षता और स्पष्ट स्टोइकोमेट्री की गणना की जा सके। एकल आणविक जांच और समुच्चय के बीच भेदभाव के लिए फोटोब्लीचिंग का चरणबद्ध विश्लेषण करने के लिए, दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना पर स्वतंत्र रूप से परिवर्तन बिंदु का पता लगाने वाले एल्गोरिथ्म के लिए उपयुक्त पैरामीटर ढूंढें। फिर परिवर्तन बिंदु का पता लगाने एल्गोरिथ्म निष्पादित करें।अस्पष्ट फोटोब्लीचिंग व्यवहार दिखाने वाले ट्रैक को हटाने के लिए, तीव्रता थ्रेसहोल्ड को परिभाषित करें जिसके नीचे एक फ्लोरोफोर को ब्लीच किया गया माना जाता है, फिर निम्नलिखित विकल्पों में से किसी एक का चयन करें। विकल्प एक जिसमें स्वीकर्ता फ्लोरोफोर एक ही चरण में ब्लीच करता है जबकि दाता कोई आंशिक ब्लीचिंग नहीं दिखाता है। विकल्प दो जिसमें दाता एक ही चरण में ब्लीच करता है जबकि कोई आंशिक स्वीकर्ता ब्लीचिंग नहीं है।विकल्प तीन जिसमें या तो फ्लोरोफोर एक ही चरण में ब्लीच करता है जबकि दूसरा आंशिक रूप से ब्लीच नहीं करता है। और विकल्प चार जिसमें दाता और स्वीकर्ता fluorophores एकल कदम photobleaching या कोई photobleaching बिल्कुल नहीं दिखाते हैं. फिर स्वीकर्ता चैनल, प्रत्यक्ष स्वीकर्ता उत्तेजना, पता लगाने की क्षमता और उत्तेजना क्षमता में दाता उत्सर्जन रिसाव के लिए सुधार कारकों की गणना करें।इसके बाद, स्पष्ट दक्षता से FRET दक्षता की गणना करने के लिए सुधार कारकों का उपयोग करें और स्पष्ट stoichiometry से stoichiometry। आगे फ़िल्टरिंग के लिए, प्रत्येक प्रक्षेपवक्र में पहले ब्लीचिंग ईवेंट से पहले से केवल डेटा बिंदुओं का चयन करें। इसके अतिरिक्त, विश्लेषण को एकल-अणु जांच तक सीमित करने के लिए, उचित स्टोइकोमेट्री सीमाओं के भीतर कम से कम 75% डेटा बिंदुओं के साथ केवल प्रक्षेपवक्र स्वीकार करें।फिर दृश्य के क्षेत्र में अलग-अलग क्षेत्रों में विश्लेषण को सीमित करने के लिए उचित सहायक छवियों पर वैश्विक या अनुकूली थ्रेशोल्डिंग विधियों के माध्यम से छवि विभाजन करें। यह सत्यापित करने के लिए दक्षता बनाम स्टोइकोइमेट्री प्लॉट बनाएं कि गलत स्टोइकोइमेट्री के संकेतों को सही ढंग से पहचाना गया है और हटा दिया गया है। फिर FRET दक्षता वितरण की एक अच्छी तरह से स्थापित सिंहावलोकन प्रदान करने के लिए FRET दक्षता के हिस्टोग्राम की साजिश और विभिन्न प्रयोगों से परिणामों की सुविधाजनक तुलना के लिए हिस्टोग्राम समूह।वैज्ञानिक पायथन पुस्तकालयों का लाभ उठाते हुए, नोटबुक के भीतर डेटा का मूल्यांकन करना संभव है, उदाहरण के लिए, प्रसार विश्लेषण का प्रदर्शन करना। विज़ुअलाइज़ेशन और एकल-अणु FRET घटना की ट्रैकिंग यहाँ दिखाए गए हैं। फ़िल्टर किए गए FRET घटनाओं को एक FRET दक्षता हिस्टोग्राम में दक्षता बनाम stoichiometry भूखंडों द्वारा दर्शाया जाता है।इसके अलावा, गतिशीलता मापदंडों की जांच XY प्लॉट या एक माध्य वर्ग विस्थापन भूखंड में एक व्यक्तिगत प्रक्षेपवक्र पथ की साजिश करके की जा सकती है। हमारे प्लेटफ़ॉर्म का आउटपुट हमें मोबाइल जांच के FRET दक्षता समय के निशान में संक्रमण की पहचान करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, बायोमोलेक्यूल्स के संरचनात्मक परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए।एक FRET-आधारित बल सेंसर का उपयोग करते हुए, विश्लेषण मंच ने हमें शुरुआती टी-सेल सिग्नलिंग के दौरान इम्यूनोलॉजिकल सिनैप्स के भीतर एकल-अणु बल की घटनाओं को मापने की अनुमति दी।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

प्रोटीन और सेल बन्दिश के लिए दो आयामी नमूनों Substrates बनाना

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

मल्टिप्लेक्स एकल अणु सेना proteolysis चुंबकीय चिमटी का उपयोग माप

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

SENP1 Protease कैनेटीक्स निर्धारण के लिए मात्रात्मक झल्लाहट विश्लेषण (Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण)

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

AFM आधारित एकल अणु शक्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ Cellulosome के रिसेप्टर ligand सिस्टम की जांच कर

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा रिसेप्टर गतिशीलता के उच्च संकल्प Spatiotemporal विश्लेषण

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Planar पर एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी bilayers समर्थित

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Microtoroid ऑप्टिकल Resonators का उपयोग लेबल मुक्त एकल अणु का पता लगाने

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

झल्लाहट फ्लो के साथ Proteopathic सीडिंग गतिविधि के संवेदनशील पता लगाने

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

एक छोटी बूंद विलय प्रतिदीप्ति वसूली के बाद एक फॉस्फोलिपिड monolayer के दो आयामी प्रसार करने के लिए उपाय

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

कार्डिएक औषधि सुरक्षा स्क्रीनिंग के लिए मानव इंजीनियर हृदय के ऊतकों की स्वचालित संकुचन विश्लेषण

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...