Name: automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
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Questo lavoro è stato sostenuto dai progetti dell'Austrian Science Fund (FWF) P30214-N36, P32307-B e dal Vienna Science and Technology Fund (WWTF) LS13-030.

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Questo articolo descrive in dettaglio una pipeline per le registrazioni automatizzate e l'analisi quantitativa dei dati smFRET provenienti da molecole di sonda mobili ma legate alla superficie. Integra i due approcci predominanti agli esperimenti smFRET, coinvolgendo sonde immobilizzate in superficie o sonde che si diffondono in soluzione dentro e fuori da un volume di eccitazione confocale17. Fornisce la corretta efficienza FRET e le posizioni molecolari in funzione del tempo. Può quindi essere utilizzato come input per programmi di analisi specializzati, ad esempio per quantificare la cinetica di transizione1, gli istogrammi FRET39 o la diffusione bidimensionale22.
Il software è rilasciato sotto una licenza libera e open source approvata dalla Open Source Initiative che concede all'utente il diritto perpetuo all'utilizzo, alla modifica e alla ridistribuzione gratuiti. Github è stato scelto come piattaforma di sviluppo e distribuzione per rendere il più semplice possibile ottenere il software e partecipare al processo di sviluppo segnalando bug o contribuendo con code40. Scritto in Python, il software non dipende da componenti proprietari. La scelta dei notebook Jupyter come interfacce utente facilita l'ispezione dei dati in ogni fase di analisi e consente di personalizzare ed estendere la pipeline in modo specifico per il sistema sperimentale in questione. La libreria sdt-python32 funge da base e implementa funzionalità per valutare i dati della microscopia a fluorescenza, come la localizzazione di singole molecole, l'analisi della diffusione, l'analisi dell'intensità della fluorescenza, la registrazione del canale di colore, l'analisi della colocalizzazione e la gestione del ROI.
In linea di principio, il tracciamento di singole particelle può essere eseguito in sistemi monodimensionali, bidimensionali o tridimensionali. Qui, la pipeline di analisi a singola molecola è stata adattata allo studio di sistemi mobili 2D. Questa scelta rispecchia la disponibilità di sistemi semplici, come i doppi strati lipidici (SLB) supportati da planari, per presentare sonde fluorescenti mobili. Tali sistemi a doppio strato lipidico sono tipicamente composti da due o più porzioni di fosfolipidi, in cui la frazione di massa determina i parametri fisico-chimici chiave dell'SLB (come fase e viscosità) e la frazione minore fornisce siti di attacco per le biomolecole. Questi siti di attacco possono essere fosfolipidi biotinilati per piattaforme proteiche a base di avidina o streptavidina o fosfolipidi coniugati nichel-NTA per piattaforme proteiche con tag istidina41. La scelta della piattaforma appropriata per collegare le proteine all'SLB dipende dalla questione scientifica. I lettori possono fare riferimento alla letteratura16,38,42 per esempi di strategie impiegate con successo. La densità delle sonde nel campione deve essere sufficientemente bassa da evitare la sovrapposizione delle funzioni di diffusione del punto; in genere, si raccomandano meno di 0,1 molecole per μm2. Vedere la sezione dei risultati rappresentativi (in particolare, Figura 6) per un esempio che mostra una densità di sonda adatta. Il metodo di analisi è applicabile anche a singole molecole proteiche marcate fluorescentemente che si diffondono nella membrana plasmatica di cellule vive.
Un aspetto critico degli esperimenti smFRET è la produzione e la caratterizzazione delle sonde FRET stesse. Quando si scelgono i fluorofori per una coppia FRET, il loro raggio di Förster deve corrispondere alle distanze di inter-colorante previste43. I coloranti resistenti alla fotosbiancamento sono preferiti in quanto producono tracce a lungo termine. Tuttavia, per tassi di sbiancamento elevati, una specie di fluoroforo può essere utilizzata per riconoscere eventi multiemettitori originati da molecole colocalizzate tramite analisi di fotosbiancamento graduale; vedere il passaggio 8.1.4 nella sezione protocollo. Le coppie di fluorofori devono essere attaccate in modo sito specifico e covalente alle molecole di interesse, formando coppie FRET intra o intermolecolari.
La combinazione di smFRET con altre tecniche prontamente disponibili può aumentare la sua risoluzione spaziale oltre il limite di diffrazione (tramite STED44). L'algoritmo di tracciamento smFRET qui presentato amplia l'applicabilità dell'approccio a nuove impostazioni sperimentali e sistemi di modelli. Ciò include studi di (i) cambiamenti cinetici nella stechiometria di biomolecole mobili, (ii) associazione dinamica di biomolecole mobili, (iii) il tasso di reazioni enzimatiche di reagenti liberamente diffusivi e (iv) la cinetica dei cambiamenti conformazionali di biomolecole mobili. I primi due esempi richiedono sistemi modello che mostrino FRET intermolecolare, cioè donatore e accettore sono coniugati a entità biomolecolari separate di interesse. Questi ultimi esempi possono fare uso di biosensori che trasportano donatore e accettore all'interno della stessa entità molecolare (FRET intramolecolare).
I sensori intramolecolari basati su FRET possono fornire informazioni sui cambiamenti conformazionali intrinseci delle biomolecole1,2,3,4, sui cambiamenti conformazionali causati dal carico di forza endogeno o esterno (sensori di forza molecolare16) o sulle concentrazioni di ioni nel nanoambiente come il calcio45 e il pH46 . A seconda del sistema modello e della piattaforma di ancoraggio preferita, tali eventi smFRET possono essere monitorati in 2D o 3D: (i) il tracciamento planare degli eventi smFRET può essere impiegato per la quantificazione dei tempi di interazione recettore-ligando all'interno di una membrana plasmatica, l'associazione di cascate di amplificazione del segnale ancorate alla membrana e i cambiamenti stechiometrici dei recettori di superficie; (ii) il monitoraggio del volume degli eventi smFRET può essere utilizzato per qualsiasi sonda FRET intra- o intermolecolare in cellule viventi o in sistemi ricostituiti in vitro.
Il metodo di tracciamento smFRET è stato sviluppato principalmente pensando alle sonde FRET intramolecolari. Queste sonde presentano un numero fisso e ben noto di etichette fluorescenti, un fatto che è stato sfruttato per rifiutare i dati da molecole agglomerate e sintetizzate in modo errato (ad esempio, etichettate in modo incompleto), nonché da sonde in cui uno dei fluorofori è stato fotosbiancato. Tuttavia, regolando le fasi di filtraggio, il metodo può essere applicato anche alle sonde FRET intermolecolari. Ad esempio, invece di accettare solo molecole con un singolo donatore e un singolo accettore fluoroforo, si potrebbero esaminare le traiettorie spaziali dei coloranti donatore e accettore e selezionare, ad esempio, per la co-diffusione delle traiettorie donatore-accettore.
Poiché l'algoritmo 3D-DAOSTORM ha il supporto per determinare la posizione di un segnale lungo l'asse ottico tramite l'astigmatismo dovuto a una lente cilindrica nel percorso del fascio di emissione, gli esperimenti 3D potrebbero essere facilmente integrati nella pipeline di analisi. In questo caso, il segnale dell'accettore all'eccitazione dell'accettore servirebbe a determinare la stechiometria e la posizione assiale. Il software di analisi può anche essere impiegato per valutare i dati degli esperimenti con sonde immobilizzate utilizzando il suo ampio grado di automazione e schemi di filtraggio. In effetti, i set di dati di efficienza smFRET delle giunzioni Holliday immobilizzate su doppi strati in fase gel38 sono stati analizzati utilizzando una versione iniziale del software.

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è stato uno dei principali motori della ricerca biologica e biofisica molecolare, in quanto consente lo studio di processi a risoluzione sub-nanometrica. Poiché l'efficienza del trasferimento di energia tra fluorofori donatore e accettore dipende fortemente dalla distanza inter-colorante nell'intervallo da sub-nanometro a nanometro, è stato efficacemente utilizzato come righello spettroscopico per esplorare la conformazione statica e dinamica delle biomolecole1,2,3,4. Inoltre, il fenomeno FRET è stato ampiamente utilizzato per studi di colocalizzazione di proteine associate alla membrana e intracellulari a livello di massa5,6. Negli ultimi due decenni, il metodo è stato adattato per il monitoraggio degli eventi smFRET7, il che ha contribuito ad aumentare sostanzialmente la risoluzione temporale e spaziale e ha risolto anche sottopopolazioni rare in campioni eterogenei. Equipaggiati con queste tecniche, sono state acquisite informazioni uniche sulla dinamica dei macchinari molecolari come la velocità di elaborazione del trascritto della RNA polimerasi II8, la velocità di replicazione delle DNA polimerasi9,10, la velocità di traslocazione del nucleosoma11, la velocità di splicing del trascritto e di stallo degli spliceosomi assemblati12, l'attività delle sottopopolazioni ribosomiali13 e la velocità di camminata dei motori kinesin14 , per citarne alcuni. Le durate di interazione recettore-ligando15 e le forze molecolari16 sono state quantificate.
Gli studi smFRET basati sull'intensità si basano tipicamente sull'emissione sensibilizzata per misurare l'efficienza FRET: uno splitter a fascio nel percorso di emissione separa spazialmente la luce proveniente dai fluorofori donatore e accettore all'eccitazione del donatore, consentendo la quantificazione delle singole intensità di fluorescenza. L'efficienza può essere successivamente calcolata come la frazione di fotoni emessa dall'accettore rispetto al conteggio totale dei fotoni17. Inoltre, l'eccitazione dell'accettore dopo l'eccitazione del donatore (ALEX) consente la misurazione della stechiometria degli eventi FRET, contribuendo alla discriminazione tra i veri segnali FRET bassi provenienti da segnali derivanti, ad esempio, da sonde dotate di un fluoroforo accettore fotosacchettato18.
Gli esperimenti FRET a singola molecola sono comunemente condotti in uno dei due modi. In primo luogo, una piccola regione nel volume del campione viene illuminata utilizzando un microscopio confocale. Le singole molecole di sonda in soluzione sono eccitate quando si diffondono all'interno del volume focale. Con questa tecnica, è possibile utilizzare rilevatori veloci di conteggio dei fotoni, consentendo una risoluzione temporale inferiore al microsecondo. In secondo luogo, le sonde sono specificamente immobilizzate sulle superfici e monitorate tramite microscopia a campo largo, spesso utilizzando la configurazione a riflessione interna totale (TIR) per ridurre al minimo la fluorescenza di fondo. L'immobilizzazione della sonda consente tempi di registrazione molto più lunghi rispetto all'utilizzo del primo approccio. Inoltre, il campo visivo più ampio consente il monitoraggio di più sonde in parallelo. La necessità di una fotocamera rende questo metodo lento rispetto a quello sopra descritto. La risoluzione temporale è limitata al millisecondo al secondo intervallo.
Se sono necessarie tracce di tempo lunghe, ad esempio per studiare processi dinamici su una scala temporale da millisecondo a secondo, il primo metodo non è applicabile, poiché i burst di fluorescenza sono in genere troppo brevi. Il secondo approccio fallisce ogni volta che l'immobilizzazione non è fattibile, ad esempio in esperimenti di cellule vive con sonde che si diffondono all'interno della membrana cellulare. Inoltre, è stato osservato che i sistemi modello biologico possono variare notevolmente la loro risposta a seconda della mobilità della superficie contattata16.
Mentre in passato sono stati eseguiti esperimenti combinati di smFRET e di tracciamento di singole particelle che registrano sonde FRET mobili19, non esiste un software disponibile pubblicamente per la valutazione dei dati. Ciò ha spinto lo sviluppo di una nuova piattaforma di analisi, che consente la determinazione di molteplici proprietà delle sonde fluorescenti mobili, tra cui l'efficienza smFRET e la stechiometria, le posizioni con precisione sub-pixel e le intensità di fluorescenza come funzioni del tempo. Sono stati stabiliti metodi per filtrare le tracce risultanti esaminando il comportamento di sbiancamento graduale, le distanze vicine, le intensità di emissione e altri tratti per scegliere esclusivamente molecole a sonda singola correttamente sintetizzate e funzionali. Il software supporta anche tecniche sperimentali e analitiche recentemente concordate in uno studio multilaboratorio per produrre dati smFRET affidabili e quantitativi17. In particolare, l'implementazione aderisce alle procedure validate per il calcolo dell'efficienza FRET e della stechiometria. Le intensità di fluorescenza all'eccitazione del donatore nel canale di emissione del donatore IDD e nel canale di emissione dell'accettore IDA sono utilizzate per il calcolo dell'efficienza FRET apparente Eapp utilizzando Eq (1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg"> (1)
Con l'aiuto dell'intensità di fluorescenza nel canale di emissione dell'accettore all'eccitazione dell'accettore IAA, la stechiometria apparente viene calcolata usando Eq (2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg"> (2)
L'efficienza FRET E e la stechiometria S possono essere derivate da Eapp e Sapp considerando quattro fattori di correzione.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg">
α descrive la fuoriuscita di fluorescenza del donatore nel canale di emissione dell'accettore e può essere determinato utilizzando un campione contenente solo fluorofori donatori o analizzando parti di traiettorie in cui l'accettore è stato sbiancato. δ corregge l'eccitazione diretta dell'accettore da parte della sorgente luminosa di eccitazione del donatore e può essere misurata utilizzando un campione con solo fluorofori accettori o analizzando parti di traiettorie in cui il donatore è stato sbiancato.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg">.
γ scala l'IDD per correggere le efficienze di rilevamento divergenti nei canali di emissione del donatore e dell'accettore e le diverse efficienze quantistiche dei fluorofori. Il fattore può essere calcolato analizzando l'aumento dell'intensità del donatore dopo lo sbiancamento dell'accettore in traiettorie con elevate efficienze FRET20 o studiando un campione con più stati FRET discreti.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg">
β scala L'IAA per correggere le disparate efficienze dell'eccitazione del donatore e dell'accettore. Se γ è stato determinato tramite l'analisi dello sbiancamento degli accettori, β potrebbe essere calcolato da un campione di rapporto donatore-accettore noto21. In caso contrario, il campione FRET multistato produce anche β.
Insieme, le correzioni consentono il calcolo dell'efficienza FRET corretta utilizzando Eq (3).
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg"> (3)
e la stechiometria corretta usando Eq (4).
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg"> (4)
Idealmente, la stechiometria corretta per un rapporto donatore-accettore 1:1 dà S = 0,5. In pratica, un rapporto segnale-rumore ridotto produce una diffusione dei valori misurati di S, ostacolando la discriminazione dai segnali solo donatore (S = 1) e dai segnali solo accettore (S = 0). Le tracce temporali risultanti possono essere utilizzate come input per un'analisi più dettagliata delle traiettorie a singola molecola per ottenere informazioni quali profili di forza spaziotemporale16, la mobilità degli eventi a singola molecola22 o la cinetica di transizione tra diversi stati1.
Il seguente protocollo descrive i parametri e le procedure sperimentali per gli esperimenti di tracciamento smFRET, nonché il principio di funzionamento alla base dell'analisi dei dati utilizzando la suite software di nuova concezione. Per l'acquisizione di dati sperimentali, si consiglia di utilizzare un setup di microscopia rispondente ai seguenti requisiti: i) capacità di rilevare l'emissione di singole molecole coloranti; ii) illuminazione a campo largo: in particolare per gli esperimenti su cellule vive, si raccomanda la configurazione a riflessione interna totale (TIR23,24,25); iii) separazione spaziale della luce di emissione in base alla lunghezza d'onda in modo tale che la fluorescenza del donatore e dell'accettore sia proiettata su regioni diverse dello stesso chip della telecamera25 o su telecamere diverse; iv) modulazione di sorgenti luminose per eccitazione di donatori e accettori con precisione al millisecondo, ad esempio utilizzando laser direttamente modulabili o modulazione tramite modulatori acusto-ottici. Ciò consente l'illuminazione stroboscopica per ridurre al minimo il fotosbiancamento dei fluorofori e l'eccitazione alternata per determinare le stechiometrie; v) output di un file per sequenza di immagini registrate in un formato leggibile dal pacchetto PimS Python26. In particolare, sono supportati i file TIFF multipagina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790404P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945; Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1084-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer microscope body</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET570/60m</td>
			<td>donor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET675/50m</td>
			<td>acceptor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conda-forge</td>
			<td>conda-forge community</td>
			<td></td>
			<td>community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td>
			<td>MENZEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>FF640-FDi01-25&#215;36</td>
			<td>separation of donor and acceptor emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (quad band)</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>Di01-R405/488/532/635-25&#215;36</td>
			<td>separation of excitation and emission light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fret-analysis</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python package for smFRET data analysis; version 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11524766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBeam Smart 405-S 405 nm laser</td>
			<td>Toptica Photonics AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek chambers (8 wells)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177402PK</td>
			<td>for sample preparation and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenia Prime 532 nm laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniconda</td>
			<td>Anaconda Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Python 3 distribution. Min. version: 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20860 &#38; 20859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBIS 640 nm laser</td>
			<td>Coherent Inc</td>
			<td>1185055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optosplit II</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5253</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sdt-python</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python library for data analysis; version 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpek bead size kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T14792</td>
			<td>Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USC500TH Ultrasound bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>for SUV formation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes

Il trasferimento di energia di risonanza Förster a singola molecola (smFRET) è una tecnica versatile che riporta le distanze nell'intervallo da sub-nanometro a nanometro. È stato utilizzato in una vasta gamma di esperimenti biofisici e biologici molecolari, tra cui la misurazione delle forze molecolari, la caratterizzazione della dinamica conformazionale delle biomolecole, l'osservazione della colocalizzazione intracellulare delle proteine e la determinazione dei tempi di interazione recettore-ligando. In una configurazione di microscopia a campo largo, gli esperimenti vengono in genere eseguiti utilizzando sonde immobilizzate in superficie. Qui viene presentato un metodo che combina il tracciamento di singole molecole con esperimenti smFRET di eccitazione alternata (ALEX), consentendo l'acquisizione di tracce temporali smFRET di sonde mobili legate alla superficie in membrane plasmatiche o doppi strati lipidici supportati da vetro. Per l'analisi dei dati registrati, è stata sviluppata una raccolta software automatizzata e open source che supporta (i) la localizzazione di segnali fluorescenti, (ii) il tracciamento di singole particelle, (iii) la determinazione delle quantità relative a FRET compresi i fattori di correzione, (iv) la verifica rigorosa delle tracce smFRET e (v) la presentazione intuitiva dei risultati. I dati generati possono essere comodamente utilizzati come input per ulteriori esplorazioni tramite software specializzato, ad esempio per la valutazione del comportamento diffusionale delle sonde o l'indagine delle transizioni FRET.

Una varietà di informazioni di basso e alto livello può essere estratta dalle tracce smFRET a seconda della questione scientifica dell'esperimento. Qui vengono presentati esempi di pipeline di analisi con sonde analogiche e digitali: un sensore di forza molecolare a base di peptidi16 e una sonda di DNA con commutazione stocastica della sua conformazione38, rispettivamente. Fare riferimento alla Figura 5 per la progettazione e il principio di funzionamento di queste sonde.
Dopo che gli algoritmi di localizzazione e tracciamento sono stati eseguiti come descritto nel protocollo, il pacchetto offre più strumenti di visualizzazione dei dati per ottimizzare i parametri iniziali e le successive fasi di filtro: (i) visualizzazione di singoli eventi smFRET, (ii) segmentazione opzionale delle immagini per analizzare i dati in determinate regioni di interesse, (iii) monitoraggio delle fasi del filtro tramite efficienza FRET rispetto ai grafici di stechiometria (E-S). La visualizzazione dei dati a singola molecola è presentata nella Figura 6.
Infine, gli eventi FRET filtrati sono rappresentati da un grafico E-S e da un istogramma di efficienza FRET (Figura 4). Il grafico E-S è uno strumento utile per ottimizzare le suddette fasi di filtraggio e indagare il risultato finale. I sensori FRET parzialmente sbiancati o etichettati in modo incompleto possono essere esclusi dal loro valore stechiometrico. I parametri di mobilità possono essere studiati tracciando un singolo percorso di traiettoria in un grafico x-y (Figura 6) o un grafico a spostamento quadrato medio (MSD) (Figura 4). Il primo metodo è particolarmente utile per discriminare gli eventi mobili da quelli immobilizzati, mentre il secondo viene utilizzato per calcolare il coefficiente di diffusione.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> Figura 4: Output esemplare. (A) L'efficienza FRET è tracciata rispetto alla stechiometria (grafico E-S) per una popolazione del sensore di forza molecolare (pannello di sinistra) che decora un doppio strato lipidico supportato da vetro e filtrato da una cellula T. È visibile un solo cloud di popolazione. Il rispettivo istogramma delle efficienze FRET esemplifica la differenza tra una popolazione di sensori di forza in presenza e l'assenza di cellule (pannello centrale). Non si può osservare alcun passaggio a minori efficienze FRET della popolazione di sensori in presenza di cellule T, indicando un allungamento poco o nulla dipendente dalla forza del modulo sensore. Il grafico MSD di queste condizioni sperimentali conferma che la popolazione di sensori di forza sotto una cellula T si muove considerevolmente più lentamente rispetto alle loro controparti non legate (pannello di destra). (B) La stessa analisi è stata eseguita con il sensore di DNA a giunzione Holliday che decora un doppio strato lipidico fluido supportato dal vetro. Il grafico E-S mostra chiaramente due popolazioni, che sono anche evidenti nell'istogramma dell'efficienza FRET. Il grafico MSD indica la presenza di una popolazione di sensori in rapido movimento. Abbreviazioni: FRET = Förster resonance energy transfer; MSD = spostamento quadrato medio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> Figura 5: Progettazione e principio di funzionamento delle sonde FRET intramolecolari. (A) Sensore peptidico analogico per la quantificazione delle forze molecolari meccaniche. I fluorofori donatore e accettore sono attaccati covalentemente a entrambe le estremità della spina dorsale peptidica. Il modulo sensore è attaccato in modo site-specific a un ligando specifico, che a sua volta lega un recettore di superficie residente in cellule di interesse (qui, un frammento di anticorpo che riconosce specificamente la catena beta del recettore delle cellule T). Dopo il legame recettore-ligando, viene esercitata la forza e il modulo sensore si estende e alla fine rincula dopo la scissione del legame. Questo pannello è stato modificato da 16. (B) Sensore digitale di DNA per la quantificazione delle transizioni FRET. Il sensore FRET è composto da quattro filamenti di DNA che formano una giunzione Holliday. Il fluoroforo donatore e accettore sono attaccati covalentemente a due filamenti. Le giunzioni Holliday cambiano spesso la loro conformazione a seconda delle condizioni del buffer circostante. La commutazione stocastica di queste conformazioni può essere monitorata quantificando l'efficienza FRET delle singole sonde. Abbreviazioni: TCR = recettore delle cellule T; FRET = Trasferimento di energia di risonanza di Förster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> Figura 6: Esempi di localizzazione e tracciamento delle sonde FRET. (A) L'efficienza FRET e la stechiometria dei singoli eventi sono calcolate quantificando l'intensità del fluoroforo del donatore all'eccitazione del donatore (D → D), del fluoroforo dell'accettore all'eccitazione del donatore (D → A) e del fluoroforo dell'accettore all'eccitazione dell'accettore (A → A). Il filtraggio del vicino più vicino previene la distorsione sovrapponendo le funzioni di diffusione dei punti degli emettitori vicini. La segmentazione delle immagini consente all'utente di scegliere determinati eventi smFRET localizzati all'interno di un'area di interesse (ad esempio, una cella o un micropattern). Come esempio di segmentazione dell'immagine, le cellule T sono state colorate con Fura-2 (visualizzate a sinistra) e sottoposte a soglia adattiva per identificare i bordi delle celle (linea tratteggiata arancione). Barre di scala = 5 μm. (B) traiettorie smFRET utilizzando il sensore di forza molecolare. Le singole traiettorie possono essere tracciate nel piano x-y , visualizzando il loro comportamento di diffusione e localizzazione (pannello di sinistra). Inoltre, le intensità di ogni traiettoria possono essere tracciate nel tempo per identificare le transizioni FRET o i passaggi di sbiancamento (il pannello centrale mostra la traiettoria rossa dal pannello di sinistra). L'efficienza FRET e la stechiometria risultanti possono essere visualizzate in modo simile (pannello di destra). (C) traiettorie smFRET utilizzando il sensore di DNA di giunzione holliday. HBSS + 12 mM MgCl2 è stato utilizzato come tampone durante le misurazioni. A parte l'apparente fase di sbiancamento dell'accettore vicino alla fine della sequenza di questi esempi, è possibile determinare la frequenza delle transizioni FRET per ciascun sensore. Le giunzioni Holliday commutano la loro conformazione con un'alta frequenza, mentre il sensore di forza molecolare non presenta transizioni FRET. Queste informazioni consentono di regolare le condizioni sperimentali, come il ritardo tra i fotogrammi, per aumentare o ridurre il numero di transizioni osservate. Abbreviazioni: FRET = Förster resonance energy transfer; smFRET = FRET a singola molecola; HBSS = soluzione salina bilanciata di Hank. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Informazioni supplementari: Localizzazione e tracciamento di singole molecole (01. Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Questo articolo presenta un metodo per l'analisi spaziotemporale di sonde mobili a singola molecola basate sul trasferimento di energia di risonanza di Förster (smFRET) utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo. Il toolkit software di nuova concezione consente la determinazione delle tracce temporali smFRET delle sonde in movimento, compresa la corretta efficienza FRET e le posizioni molecolari, come funzioni del tempo.

Analisi spaziotemporale bidimensionale automatizzata di sonde FRET mobili a singola molecola

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Esperimenti FRET a singola molecola utilizzando sonde legate alla superficie sono stati eseguiti quasi esclusivamente su molecole immobilizzate in passato. Tuttavia, molte biomolecole si diffondono e possono essere analizzate con il nostro metodo. La combinazione di FRET a singola molecola con il tracking consente di analizzare non solo le tracce temporali di deficit fret delle sonde in movimento, ma anche di indagare aspetti spaziotemporali come il comportamento diffusionale.Il nostro metodo è compatibile con una varietà di sonde basate su FRET. Ad esempio, potrebbe fornire approfondimenti riguardanti le forze molecolari, le dinamiche conformazionali e la cinetica di legame negli esperimenti sulle cellule vive. Gli esperimenti FRET a singola molecola di alta qualità sono notoriamente difficili da eseguire.Per una quantificazione affidabile, è importante registrare i dati con un buon rapporto segnale-rumore e tracce a singola molecola di lunghezza sufficiente. Per iniziare la misurazione del campione, eccitare i fluorofori del donatore e dell'accettore per un tempo di illuminazione appropriato durante l'attivazione della fotocamera e attendere che la lettura della fotocamera sia abilitata. Ripetere l'eccitazione del donatore e accettare fluorofori alternativamente.Scegli il numero di ripetizioni in modo che sia abbastanza grande da garantire la fotosbiancamento di almeno un fluoroforo per sonda all'interno del campo visivo consentendo l'analisi graduale del fotosbiancamento per discriminare i segnali a singola molecola dagli aggregati. Specificate la sequenza di illuminazione per consentire la selezione dei fotogrammi di eccitazione del donatore e dell'accettore, nonché dei fotogrammi per la segmentazione delle immagini dalle sequenze di immagini registrate. Allo stesso tempo, analizza i set di dati registrati utilizzando le stesse impostazioni di illuminazione.A tal fine, assegnare un identificatore e un modello che corrisponda ai rispettivi nomi di file della sequenza di immagini a ciascun set di dati. Inoltre, definire set di dati specifici per scopi speciali come registrazioni di marcatori fiduciali per la registrazione delle immagini, profili di luce di eccitazione per la correzione del campo piatto e, facoltativamente, campioni solo donatore e solo accettore per determinare i fattori di correzione. Quindi, selezionare i canali di emissione e le immagini raw se entrambi i canali vengono registrati utilizzando una singola telecamera.Per questo, utilizzare il widget grafico appropriato per selezionare le regioni appropriate per l'emissione di donatori e accettori, quindi localizzare i marcatori fiduciali in entrambi i canali di emissione ed eseguire la registrazione delle immagini. Utilizzare l'interfaccia utente fornita per trovare i parametri appropriati per l'algoritmo di localizzazione per i canali di emissione donatore e accettore. Quindi, impostare i parametri di localizzazione a singola molecola per le sonde FRET dopo l'eccitazione del donatore nella somma delle immagini ottenute dalle emissioni del donatore e dell'accettore, quindi impostare i parametri di localizzazione per le sonde dopo l'eccitazione dell'accettore nel canale di emissione dell'accettore.Localizzare le sonde FRET in caso di eccitazione del donatore e dell'accettore in modo indipendente in tutti i fotogrammi. I risultati vengono uniti in un'unica tabella contenente il numero di fotogramma originale, le coordinate bidimensionali e un identificatore che fa riferimento al file di immagine di origine. Per tracciare e misurare l'intensità della fluorescenza, scegliere le opzioni appropriate per l'algoritmo Trackpy per collegare le localizzazioni della sonda FRET alle traiettorie.Successivamente, utilizzando la funzionalità del software di analisi, elaborare i dati di immagine ausiliari da sequenze di immagini. Estrai immagini aggiuntive registrate per facilitare la segmentazione contrassegnata da S nella sequenza di eccitazione. Infine, determinare i profili di luce di eccitazione del donatore e dell'accettore in tutto il campo visivo dalle immagini registrate su un campione densamente etichettato.Per le fasi iniziali di filtraggio, scartare i segnali con funzioni di diffusione del punto sovrapposto in quanto è difficile determinare le loro intensità di fluorescenza in modo affidabile. Nel caso di illuminazione disomogenea, accettare solo segnali situati in regioni ben illuminate all'interno del campo visivo per garantire un buon rapporto segnale-rumore. Se si studia fret intramolecolare, limitare l'analisi a quelle traiettorie presenti dall'inizio della sequenza di immagini.Quindi, eseguire la correzione del campo piatto, che utilizza i profili della sorgente luminosa di eccitazione ottenuti in precedenza per invertire le variazioni di intensità di fluorescenza dipendenti dalla posizione causate da un'illuminazione disomogenea, quindi calcolare l'efficienza FRET apparente e la stechiometria apparente. Per eseguire un'analisi graduale del fotosbiancamento per discriminare tra singole sonde molecolari e aggregati, trovare parametri appropriati per l'algoritmo di rilevamento del punto di cambiamento sull'eccitazione del donatore e dell'accettore in modo indipendente. Quindi eseguire l'algoritmo di rilevamento del punto di modifica.Per rimuovere la traccia che mostra un comportamento ambiguo di fotosbiancamento, definire soglie di intensità al di sotto delle quali un fluoroforo è considerato sbiancato, quindi selezionare una delle seguenti opzioni. Opzione uno in cui l'accettore fluoroforo sbianca in un unico passaggio mentre il donatore non mostra sbiancamento parziale. Opzione due in cui il donatore sbianca in un unico passaggio mentre non vi è alcuna rimozione parziale dell'accettore.Opzione tre in cui uno dei due fluorofori sbianca in un unico passaggio mentre l'altro non sbianca parzialmente. E l'opzione quattro in cui i fluorofori donatori e accettori mostrano fotosbiancamento a fase singola o nessuna fotosbiancamento. Quindi calcolare i fattori di correzione per la perdita di emissioni del donatore nel canale dell'accettore, l'eccitazione diretta dell'accettore, le efficienze di rilevamento e le efficienze di eccitazione.Quindi, utilizzare i fattori di correzione per calcolare l'efficienza FRET dall'efficienza apparente e la stechiometria dalla stechiometria apparente. Per un ulteriore filtraggio, selezionare solo i punti dati precedenti al primo evento di sbiancamento in ogni traiettoria. Inoltre, per limitare l'analisi alle sonde a singola molecola, accettare solo traiettorie con almeno il 75% dei punti dati entro i limiti di stechiometria appropriati.Quindi eseguire la segmentazione delle immagini tramite metodi di soglia globali o adattivi sulle immagini ausiliarie appropriate per limitare l'analisi a regioni distinte all'interno del campo visivo. Creare grafici di efficienza rispetto alla stechiometria per verificare che i segnali di stechiometria errata siano stati correttamente identificati e rimossi. Quindi tracciare istogrammi di efficienze FRET per fornire una panoramica consolidata delle distribuzioni di efficienza FRET e raggruppare gli istogrammi per un comodo confronto dei risultati di diversi esperimenti.Sfruttando le librerie scientifiche Python, è possibile valutare ulteriormente i dati all'interno del notebook, eseguendo, ad esempio, analisi di diffusione. La visualizzazione e il tracciamento dell'evento FRET a singola molecola sono mostrati qui. Gli eventi FRET filtrati sono rappresentati da grafici di efficienza rispetto a quelli stechiometrici in un istogramma di efficienza FRET.Inoltre, i parametri di mobilità possono essere studiati tracciando un singolo percorso di traiettoria in un grafico XY o un grafico di spostamento quadrato medio. L'output della nostra piattaforma ci consente di identificare ulteriormente le transizioni nelle tracce temporali di efficienza FRET delle sonde mobili. Ad esempio, per valutare i cambiamenti conformazionali delle biomolecole.Utilizzando un sensore di forza basato su FRET, la piattaforma di analisi ci ha permesso di quantificare gli eventi di forza a singola molecola all'interno della sinapsi immunologica durante la segnalazione precoce delle cellule T.

Research

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