Name: automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Det østerrikske vitenskapsfondet (FWF) prosjektene P30214-N36, P32307-B, og av Vienna Science and Technology Fund (WWTF) LS13-030.

<ol>
	<li>McKinney, S. A., D&#233;clais, A. -. C., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+individual+holliday+junctions.">Structural dynamics of individual holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).</li><li>Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+potassium-channel+gating+revealed+by+single-molecule+FRET.">Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).</li><li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks.">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), 235 (2018).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).</li><li>Wu, P. G., Brand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonance+energy+transfer:+Methods+and+applications.">Resonance energy transfer: Methods and applications.</a> Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).</li><li>Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecular+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+measurement+on+structures+and+interactions+of+biomolecules.">Single-molecular f&#246;rster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules.</a> Micromachines. 12 (5), 492 (2021).</li><li>Malkusch, N., D&#246;rfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=smFRET+experiments+of+the+RNA+polymerase+II+transcription+initiation+complex.">smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex.</a> Methods. 120, 115-124 (2017).</li><li>Lee, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+views+of+MutS+on+mismatched+DNA.">Single-molecule views of MutS on mismatched DNA.</a> DNA repair. 20, 82-93 (2014).</li><li>Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microsecond+single-molecule+FRET+to+determine+the+assembly+pathways+of+T4+ssDNA+binding+protein+onto+model+DNA+replication+forks.">Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).</li><li>Deindl, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+conformational+dynamics+with+single-molecule+fluorescence+energy+transfer:+Applications+in+nucleosome+remodeling.">Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling.</a> Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).</li><li>Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+colocalization+FRET+evidence+that+spliceosome+activation+precedes+stable+approach+of+5'+splice+site+and+branch+site.">Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).</li><li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations.">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li><li>Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+kinesin+waits+between+steps.">How kinesin waits between steps.</a> Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).</li><li>G&#246;hring, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+analysis+of+T-cell+receptor-imposed+forces+via+quantitative+single+molecule+FRET+measurements.">Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements.</a> Nature Communications. 12 (1), 2502 (2021).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669 (2018).</li><li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-aided+molecule+sorting:+Analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li><li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells.">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).</li><li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules.">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).</li><li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation.">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li><li>Asher, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+imaging+of+GPCR+dimers+in+living+cells.">Single-molecule FRET imaging of GPCR dimers in living cells.</a> Nature Methods. 18 (4), 397-405 (2021).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy. (12), 1223-1237 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(excitation)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (excitation) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1189-1191 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(emission)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (emission) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1192-1194 (2012).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., van der Wel, C. M., Dimiduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft-matter/pims: PIMS v0.5. , (2020).</li><li>Anaconda Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Miniconda. , (2021).</li><li>conda-forge community. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The conda-forge project: community-based software distribution built on the conda package format and ecosystem. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> JupyterLab Contributors Notebooks - JupyterLab documentation. , (2021).</li><li>Babcock, H., Sigal, Y. M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-density+3D+localization+algorithm+for+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">A high-density 3D localization algorithm for stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Optical Nanoscopy. 1 (6), (2012).</li><li>Gao, Y., Kilfoil, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+detection+and+complete+tracking+of+large+populations+of+features+in+three+dimensions.">Accurate detection and complete tracking of large populations of features in three dimensions.</a> Optics Express. 17 (6), 4685 (2009).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> sdt-python: Python library for fluorescence microscopy data analysis (v17.1). , (2021).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nature Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li><li>Bradski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OpenCV+library.">The OpenCV library.</a> Dr. Dobb's Journal: Software Tools for the Professional Programmer. 25 (11), 120-123 (2000).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft-matter/trackpy:+Trackpy+v0.5.0.">Soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0.</a> Zenodo. , 4682814 (2021).</li><li>Killick, R., Fearnhead, P., Eckley, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+detection+of+changepoints+with+a+linear+computational+cost.">Optimal detection of changepoints with a linear computational cost.</a> Journal of the American Statistical Association. 107 (500), 1590-1598 (2012).</li><li>Schrangl, L., G&#246;hring, J., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+single+molecule+FRET+transitions+without+trajectories.">Kinetic analysis of single molecule FRET transitions without trajectories.</a> The Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123328 (2018).</li><li>Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+single-molecule+FRET+dynamics+with+probability+distribution+analysis.">Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis.</a> ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+analysis+software+(3.0).">Single-molecule FRET analysis software (3.0).</a> Zenodo. , (2021).</li><li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers.">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li><li>Platzer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unscrambling+fluorophore+blinking+for+comprehensive+cluster+detection+via+photoactivated+localization+microscopy.">Unscrambling fluorophore blinking for comprehensive cluster detection via photoactivated localization microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4993 (2020).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The molecular probes handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies. , (2010).</li><li>Szalai, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+energy+transfer+by+intensity-based+STED-FRET.">Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET.</a> Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+two-photon+probe+for+in+vivo+tracking+of+pH+during+a+traumatic+brain+injury+process.">A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process.</a> New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Denne artikkelen beskriver en rørledning for automatiserte opptak og kvantitativ analyse av smFRET-data som stammer fra mobile, men overflatetildelte sondemolekyler. Det kompletterer de to dominerende tilnærmingene til smFRET-eksperimenter, som involverer enten overflate-immobiliserte sonder eller sonder som sprer seg i løsning inn og ut av et konfokalt eksitasjonsvolum17. Det gir riktig FRET-effektivitet og molekylære posisjoner som en funksjon av tid. Det kan derfor brukes som inndata for spesialiserte analyseprogrammer, for eksempel for å kvantifisere overgangskinetikk1, FRET histogrammer39 eller todimensjonal diffusjon22.
Programvaren er utgitt under en gratis og åpen kildekode-lisens godkjent av Open Source Initiative som gir brukeren den evigvarende retten til fri bruk, endring og videredistribusjon. Github ble valgt som en utviklings- og distribusjonsplattform for å gjøre det så enkelt som mulig å skaffe programvaren og delta i utviklingsprosessen ved å rapportere feil eller bidra med kode40. Programvaren er skrevet i Python, og er ikke avhengig av proprietære komponenter. Valget av Jupyter bærbare PC-er som brukergrensesnitt forenkler inspeksjon av data på hvert analysetrinn og gjør det mulig å skreddersy og utvide rørledningen spesielt for det eksperimentelle systemet. Sdt-python-biblioteket32 fungerer som grunnlag og implementerer funksjonalitet for å evaluere fluorescensmikroskopidata, for eksempel enkeltmolekyl lokalisering, diffusjonsanalyse, fluorescensintensitetsanalyse, fargekanalregistrering, colokaliseringsanalyse og ROI-håndtering.
I prinsippet kan enkeltpartikkelsporing utføres i en-, to- eller tredimensjonale systemer. Her ble analyserørledningen for enkeltmolekyler skreddersydd for studiet av 2D-mobile systemer. Dette valget gjenspeiler tilgjengeligheten av enkle systemer, for eksempel planar-støttede lipid-bilayers (SLD-er), for å presentere mobile fluorescerende sonder. Slike lipidbilayersystemer består vanligvis av to eller flere fosfolipider moieties, hvor bulkfraksjonen bestemmer de viktigste fysisk-kjemiske parametrene til SLB (for eksempel fase og viskositet), og den mindre fraksjonen gir vedleggssteder for biomolekyler. Disse festestedene kan være biotinylerte fosfolipider for avidin- eller streptavidinbaserte proteinplattformer eller nikkel-NTA konjugerte fosfolipider for proteinplattformer med histidinmerker41. Valget av riktig plattform for å koble proteiner til SLB avhenger av det vitenskapelige spørsmålet. Leserne kan henvise til litteraturen16,38,42 for eksempler på vellykkede anvendte strategier. Tettheten av sonder i prøven bør være tilstrekkelig lav for å unngå overlappende punktspredningsfunksjoner; vanligvis anbefales mindre enn 0,1 molekyler per μm2. Se avsnittet om representative resultater (spesielt figur 6) for et eksempel som viser en passende sondetetthet. Analysemetoden gjelder også for enkelt fluorescerende merkede proteinmolekyler som sprer seg i plasmamembranen til levende celler.
Et kritisk aspekt ved smFRET-eksperimenter er produksjon og karakterisering av FRET-sondene selv. Når du velger fluoroforer for et FRET-par, bør Förster-radiusen samsvare med de forventede mellomfargede avstandene43. Fargestoffer som er motstandsdyktige mot fotobleaching, foretrekkes da de gir lange tidsspor. Men for forhøyede blekingshastigheter kan en fluoroforart brukes til å gjenkjenne multiemitterhendelser som stammer fra colokaliserte molekyler via trinnvis fotobleaching analyse; se trinn 8.1.4 i protokolldelen. Fluoroforpar bør være stedsspesifikke og kovalente festet til molekylene av interesse, og danner intra- eller intermolekylære FRET-par.
Kombinere smFRET med andre lett tilgjengelige teknikker kan øke sin romlige oppløsning utover diffraksjonsgrensen (via STED44). SmFRET-sporingsalgoritmen som presenteres her, utvider tilnærmingens anvendbarhet til nye eksperimentelle innstillinger og modellsystemer. Dette inkluderer studier av (i) kinetiske endringer i stoichiometri av mobile biomolekyler, (ii) dynamisk forening av mobile biomolekyler, (iii) frekvensen av enzymatiske reaksjoner av fritt diffuserende reaktanter, og (iv) kinetikken til konformasjonsendringer av mobile biomolekyler. De to første eksemplene krever at modellsystemer som viser intermolekylære FRET, det vil si donor og akseptor, blir konjugert for å skille biomolekylære enheter av interesse. De sistnevnte eksemplene kan gjøre bruk av biosensorer som bærer donor og akseptor innenfor samme molekylære enhet (intramolekylær FRET).
Intramolekylære FRET-baserte sensorer kan gi innsikt i iboende konformasjonsendringer av biomolekyler1,2,3,4, konformasjonsendringer forårsaket av endogen eller ekstern kraftbelastning (molekylær kraftsensorer16), eller ionkonsentrasjoner i nanomiljøet som kalsium45 og pH46 . Avhengig av modellsystemet og den foretrukne forankringsplattformen, kan slike smFRET-hendelser enten spores i 2D eller 3D: (i) planarsporing av smFRET-hendelser kan brukes til kvantifisering av reseptor-ligand interaksjonstider i en plasmamembran, foreningen av membranforankret signalforsterkning kaskader, og stoichiometriendringer av overflatereseptorer; (ii) volumsporing av smFRET-hendelser kan brukes til intra- eller intermolekylære FRET-sonder i levende celler eller i in vitro-rekonstituerte systemer.
SmFRET-sporingsmetoden ble utviklet hovedsakelig med tanke på intramolekylære FRET-sonder. Disse sondene har et fast og velkjent antall fluorescerende etiketter, et faktum som ble utnyttet til å avvise data fra agglomererte og feil syntetiserte (f.eks. ufullstendig merkede) molekyler, samt fra sonder der en av fluoroforene har blitt fotoblekert. Ved å justere filtreringstrinnene kan imidlertid metoden også brukes på intermolekylære FRET-sonder. For eksempel, i stedet for å akseptere bare molekyler med en enkelt donor og en enkelt akseptor fluorofor, kunne man undersøke de romlige banene til donor- og akseptorfargestoffer og velge for eksempel for co-diffuserende donor-akseptorbaner.
Ettersom 3D-DAOSTORM-algoritmen har støtte for å bestemme et signals posisjon langs den optiske aksen via astigmatismen på grunn av en sylindrisk linse i utslippsstrålebanen, kan 3D-eksperimenter enkelt integreres i analyserørledningen. I dette tilfellet vil akseptorsignalet ved akseptoreksitasjon tjene til å bestemme stoichiometrien og den aksiale posisjonen. Analyseprogramvaren kan også brukes til å evaluere data fra eksperimenter med immobiliserte sonder ved å bruke sin store grad av automatisering og filtreringsordninger. Faktisk ble smFRET effektivitetsdatasett fra Holliday-veikryss immobilisert på gelfase bilayers38 analysert ved hjelp av en tidlig versjon av programvaren.

Förster resonans energioverføring (FRET) har vært en stor driver i molekylær biologisk og biofysisk forskning, da det tillater undersøkelse av prosesser ved sub-nanometeroppløsning. Ettersom effektiviteten av energioverføring mellom donor og akseptorfluoreforer sterkt avhenger av interfargeavstanden i sub-nanometeret til nanometerområdet, har det effektivt blitt brukt som en spektroskopisk hersker for å utforske statisk og dynamisk konformasjon av biomolekyler1,2,3,4. I tillegg har FRET-fenomenet blitt mye brukt til colokaliseringsstudier av membranrelaterte og intracellulære proteiner på et bulknivå5,6. I løpet av de siste to tiårene ble metoden tilpasset overvåking av smFRET-hendelser7, noe som bidro til å øke tidsmessig og romlig oppløsning betydelig og løste selv sjeldne subpopulasjoner i heterogene prøver. Utstyrt med disse teknikkene ble det oppnådd unik innsikt i dynamikken i molekylære maskiner som transkripsjonsbehandlingshastigheten til RNA polymerase II8, replikeringshastigheten til DNA-polymeraser9,10, nukleossomtranslokasjonshastighet11, transkripsjonsspleise og stalling rate av monterte skjøteosomer12, aktiviteten til ribosomale underbefolkninger13, og ganghastigheten til kinesinmotorer14 , for å nevne noen. Reseptor-ligand interaksjon varigheter15 og molekylære krefter16 har blitt kvantifisert.
Intensitetsbaserte smFRET-studier er vanligvis avhengige av sensibilisert utslipp for å måle FRET-effektivitet: En strålesplitter i utslippsbanen skiller lys som stammer fra donor- og akseptorfluoforer ved donoreksitasjon, noe som muliggjør kvantifisering av individuelle fluorescensintensiteter. Effektiviteten kan deretter beregnes som brøkdelen av fotoner som slippes ut av akseptoren med hensyn til det totale fotontallet17. I tillegg tillater akseptoreksitasjon etter donoreksitasjon (ALEX) måling av stoichiometrien til FRET-hendelsene, noe som bidrar til diskriminering mellom ekte lave FRET-signaler fra signaler som oppstår, for eksempel fra sonder med fotobleached acceptor fluorophore18.
Ettmolekyls FRET-eksperimenter utføres vanligvis på en av to måter. For det første lyser en liten region i prøvevolumet ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Enkelt sondemolekyler i løsning er begeistret når de tilfeldigvis diffuserer innenfor brennvidden. Med denne teknikken kan raske fotontellingsdetektorer brukes, noe som muliggjør tidsoppløsning under mikrosekund. For det andre er sonder spesielt immobilisert på overflater og overvåket via widefield mikroskopi, ofte ved hjelp av total intern refleksjon (TIR) konfigurasjon for å minimere bakgrunnsfluorescens. Sonde immobilisering gir mye lengre opptakstider enn å bruke den første tilnærmingen. I tillegg tillater det større synsfeltet overvåking av flere sonder parallelt. Behovet for et kamera gjør denne metoden treg sammenlignet med den som er beskrevet ovenfor. Tidsoppløsningen er begrenset til millisekunder til andre område.
Hvis det kreves lange tidsspor, for eksempel for å studere dynamiske prosesser på en millisekunder til andre tidsskala, er den første metoden ikke anvendelig, da fluorescensutbruddene vanligvis er for korte. Den andre tilnærmingen mislykkes når immobilisering ikke er mulig, for eksempel i live-celle eksperimenter med sonder som sprer seg i cellemembranen. Videre har det blitt observert at biologiske modellsystemer kan variere responsen dramatisk avhengig av mobiliteten til den kontaktede overflaten16.
Mens kombinerte smFRET- og enkeltpartikkelsporingseksperimenter som registrerer mobile FRET-sonder har blitt utført i løpet av de siste 19, er det ingen offentlig tilgjengelig programvare for evaluering av dataene. Dette førte til utviklingen av en ny analyseplattform, som muliggjør bestemmelse av flere egenskaper til mobile fluorescerende sonder, inkludert smFRET effektivitet og stoichiometri, posisjoner med underpikselnøyaktighet og fluorescensintensiteter som tidsfunksjoner. Metoder for filtrering av de resulterende sporene ved å undersøke trinnvis blekingsadferd, nærmeste naboavstander, utslippsintensiteter og andre egenskaper ble etablert for utelukkende å velge riktig syntetiserte og funksjonelle enkeltsondemolekyler. Programvaren støtter også eksperimentelle og analytiske teknikker som nylig ble avtalt i en multilaboratorisk studie for å produsere pålitelige, kvantitative smFRET-data17. Spesielt overholder implementeringen de validerte prosedyrene for beregning av FRET-effektivitet og stoichiometri. Fluorescensintensiteter ved donoreksitasjon i donorutslippskanalen IDD og akseptorutslippskanalen IDA brukes til beregning av den tilsynelatende FRET-effektiviteten Eapp ved hjelp av Eq (1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg"> (1)
Ved hjelp av fluorescensintensiteten i akseptorutslippskanalen ved akseptoreksitasjon IAA beregnes den tilsynelatende stoichiometrien ved hjelp av Eq (2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg"> (2)
FRET effektivitet E og stoichiometri S kan avledes fra Eapp og Sapp ved å vurdere fire korreksjonsfaktorer.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg">
α beskriver lekkasjen av donorfluorescens inn i akseptorutslippskanalen og kan bestemmes ved hjelp av en prøve som bare inneholder donorfluoriforer eller ved å analysere deler av baner der akseptoren har blitt bleket. δ korrigerer for direkte eksitasjon av akseptoren av donoreksitasjonslyskilden og kan måles ved hjelp av en prøve med bare akseptorfluoforer eller ved å analysere deler av baner der donoren har blitt bleket.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg">.
γ skalerer IDD for å rette opp avvikende deteksjonseffektivitet i donor- og akseptorutslippskanaler og forskjellige kvanteeffektiviteter hos fluoroforene. Faktoren kan beregnes ved å analysere økningen i donorintensitet ved akseptorbleking i baner med høy FRET-effektivitet20 eller ved å studere et utvalg med flere diskrete FRET-tilstander.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg">
β skalerer IAA for å korrigere for ulik effektivitet av donor- og akseptoreksitasjon. Hvis γ ble bestemt via akseptorblekingsanalyse, kunne β beregnes ut fra et utvalg av kjent donor-til-akseptor ratio21. Ellers gir FRET-utvalget med flere tilstander også β.
Sammen tillater rettelsene beregningen av den korrigerte FRET-effektiviteten ved hjelp av Eq (3).
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg"> (3)
og riktig stoichiometri ved hjelp av Eq (4).
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg"> (4)
Ideelt sett gir korrigert stoichiometri for et 1: 1 donor-til-akseptorforhold S = 0,5. I praksis gir et redusert signal-til-støy-forhold en spredning av de målte verdiene til S, noe som hemmer diskrimineringen fra donorsignaler (S = 1) og akseptor-bare signaler (S = 0). De resulterende tidssporene kan brukes som inngang for en mer detaljert analyse av enkeltmolekylets baner for å skaffe informasjon som romlige kraftprofiler16, mobiliteten til enkeltmolekylhendelsene22, eller overgangskinetikk mellom forskjellige tilstander1.
Følgende protokoll beskriver eksperimentelle parametere og prosedyrer for smFRET-sporingseksperimenter, samt arbeidsprinsippet bak dataanalyse ved hjelp av den nyutviklede programvarepakken. For innsamling av eksperimentelle data anbefales det å bruke et mikroskopioppsett som oppfyller følgende krav: i) evne til å oppdage utslipp av enkeltfargemolekyler; ii) widefield belysning: spesielt for live-celle eksperimenter, total intern refleksjon (TIR23,24,25) konfigurasjon anbefales; iii) romlig separasjon av utslippslys i henhold til bølgelengde slik at donor og akseptorfluorescens projiseres på forskjellige regioner i samme kamerabrikke25 eller forskjellige kameraer; iv) modulering av lyskilder for donor- og akseptoreksitasjon med millisekundpresisjon, for eksempel ved bruk av direkte modulatable lasere eller modulering via acoustooptiske modulatorer. Dette tillater stroboskopisk belysning for å minimere fotobleaching av fluoroforer samt vekslende eksitasjon for å bestemme stoichiometries; v) utgang av en fil per innspilt bildesekvens i et format som kan leses av PIMS Python-pakken26. Spesielt støttes TIFF-filer med flere sider.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790404P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945; Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1084-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer microscope body</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET570/60m</td>
			<td>donor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET675/50m</td>
			<td>acceptor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conda-forge</td>
			<td>conda-forge community</td>
			<td></td>
			<td>community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td>
			<td>MENZEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>FF640-FDi01-25&#215;36</td>
			<td>separation of donor and acceptor emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (quad band)</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>Di01-R405/488/532/635-25&#215;36</td>
			<td>separation of excitation and emission light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fret-analysis</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python package for smFRET data analysis; version 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11524766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBeam Smart 405-S 405 nm laser</td>
			<td>Toptica Photonics AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek chambers (8 wells)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177402PK</td>
			<td>for sample preparation and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenia Prime 532 nm laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniconda</td>
			<td>Anaconda Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Python 3 distribution. Min. version: 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20860 &#38; 20859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBIS 640 nm laser</td>
			<td>Coherent Inc</td>
			<td>1185055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optosplit II</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5253</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sdt-python</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python library for data analysis; version 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpek bead size kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T14792</td>
			<td>Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USC500TH Ultrasound bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>for SUV formation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes

Single-molekyl Förster resonans energioverføring (smFRET) er en allsidig teknikk som rapporterer om avstander i sub-nanometeret til nanometerområdet. Det har blitt brukt i et bredt spekter av biofysiske og molekylære biologiske eksperimenter, inkludert måling av molekylære krefter, karakterisering av konformasjonsdynamikk av biomolekyler, observasjon av intracellulær kolokalisering av proteiner og bestemmelse av reseptor-ligand interaksjonstider. I en widefield mikroskopikonfigurasjon utføres eksperimenter vanligvis ved hjelp av overflate-immobiliserte sonder. Her presenteres en metode som kombinerer sporing av enkeltmolekyler med vekslende eksitasjonseksitasjon (ALEX) smFRET-eksperimenter, som tillater oppkjøp av smFRET-tidsspor av overflatebundne, men mobile sonder i plasmamembraner eller glassstøttede lipid-bilayers. For analyse av registrerte data ble det utviklet en automatisert programvaresamling med åpen kildekode som støtter (i) lokalisering av fluorescerende signaler, (ii) enkeltpartikkelsporing, (iii) bestemmelse av FRET-relaterte mengder, inkludert korreksjonsfaktorer, (iv) streng verifisering av smFRET-spor og (v) intuitiv presentasjon av resultatene. De genererte dataene kan enkelt brukes som innspill til videre utforskning via spesialisert programvare, for eksempel for vurdering av sondenes diffusjonsadferd eller undersøkelse av FRET-overganger.

En rekke lav- og høynivåinformasjon kan hentes ut fra smFRET-spor avhengig av eksperimentets vitenskapelige spørsmål. Her presenteres eksempler på analyserørledninger med analoge og digitale sonder: en peptidbasert molekylær kraftsensor16 og en DNA-sonde med stokastisk veksling av henholdsvis konformasjonen38. Se figur 5 for utformingen og arbeidsprinsippet for disse sondene.
Etter at lokaliserings- og sporingsalgoritmene er utført som beskrevet i protokollen, tilbyr pakken flere datavisualiseringsverktøy for å optimalisere de første parametrene og påfølgende filtertrinn: (i) visualisering av individuelle smFRET-hendelser, (ii) valgfri bildesegmentering for å analysere data i visse interesseområder, (iii) overvåking av filtertrinn via FRET-effektivitet vs. stoichiometri (E-S) plott. Visualiseringen av enkeltmolekyldataene presenteres i figur 6.
Til slutt representeres de filtrerte FRET-hendelsene av et E-S-plott og et FRET-effektivitets histogram (figur 4). E-S-plottet er et nyttig verktøy for å optimalisere de nevnte filtreringstrinnene og undersøke det endelige resultatet. Delvis blekede eller ufullstendig merkede FRET-sensorer kan utelukkes av deres stoichiometriverdi. Mobilitetsparametere kan undersøkes ved å plotte inn en individuell bane i en x-y-tomt (figur 6) eller en gjennomsnittlig firkantet forskyvningsplott (MSD) (figur 4). Den første metoden er spesielt nyttig for å diskriminere mobil fra immobiliserte hendelser, mens sistnevnte brukes til å beregne diffusjonskoeffisienten.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> Figur 4: Eksemplarisk utgang. (A) FRET-effektiviteten er plottet versus stoichiometri (E-S-plott) for en populasjon av den molekylære kraftsensoren (venstre panel) som dekorerer en glassstøttet lipid-bilayer og anstrengt av en T-celle. Bare én befolkningssky er synlig. Det respektive histogrammet av FRET-effektivitet eksemplifiserer forskjellen mellom en kraftsensorpopulasjon i nærvær og fravær av celler (midtpanel). Ingen overgang til lavere FRET-effektivitet i sensorpopulasjonen i nærvær av T-celler kan observeres, noe som indikerer liten eller ingen kraftavhengig strekking av sensormodulen. MSD-plottet for disse eksperimentelle forholdene bekrefter at kraftsensorpopulasjonen under en T-celle beveger seg betydelig langsommere enn deres ubundne kolleger (høyre panel). (B) Den samme analysen ble utført med Holliday-kryss-DNA-sensor som pyntet en glassstøttet væske lipid-bilayer. E-S-plottet viser tydelig to populasjoner, som også er tydelige i FRET-effektivitetshistogrammet. MSD-plottet indikerer tilstedeværelsen av en sensorpopulasjon som beveger seg raskt. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverføring; MSD = gjennomsnittlig firkantet forskyvning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> Figur 5: Design- og arbeidsprinsipp for intramolekylære FRET-sonder. (A) Analog peptidsensor for kvantifisering av mekaniske molekylære krefter. Donor og akseptor fluoroforer er kovalent festet til hver ende av peptid ryggraden. Sensormodulen er stedsspesifikk festet til en bestemt ligand, som igjen binder en celle-resident overflatereseptor av interesse (her et antistofffragment som spesifikt gjenkjenner betakjeden til T-cellereseptoren). Ved reseptor-ligandbinding utøves kraft, og sensormodulen forlenges og til slutt rekyleres etter bindingsspalting. Dette panelet er modifisert fra 16. (B) Digital DNA-sensor for kvantifisering av FRET-overganger. FRET-sensoren består av fire DNA-tråder som danner et Holliday-veikryss. Donoren og akseptorfluoreore er kovalent festet til to tråder. Holliday-veikryss bytter ofte konformasjon avhengig av de omkringliggende bufferforholdene. Den stokastiske vekslingen av disse konformasjonene kan overvåkes ved å kvantifisere FRET-effektiviteten til individuelle sonder. Forkortelser: TCR = T celle reseptor; FRET = Förster resonans energioverføring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> Figur 6: Eksempler på lokalisering og sporing av FRET-sonder. (A) FRET-effektiviteten og stoichiometrien til individuelle hendelser beregnes ved å kvantifisere intensiteten av donorfluoreforen ved donoreksitasjon (D → D), akseptorfluofor ved donoreksitasjon (D → A), og akseptorfluoreoreoren ved akseptoreksitasjon (A → A). Nærmeste nabofiltrering forhindrer skjevhet ved å overlappe punktspredningsfunksjoner for nære emittere. Bildesegmentering gjør det mulig for brukeren å velge visse smFRET-hendelser lokalisert innenfor et interesseområde (f.eks. en celle eller en mikropattern). Som et eksempel på bildesegmentering ble T-celler farget med Fura-2 (vist til venstre) og utsatt for adaptiv terskelverdi for å identifisere cellekantene (oransje prikket linje). Skalastenger = 5 μm. (B) smFRET-baner ved hjelp av molekylær kraftsensor. Individuelle baner kan plottes inn i x-y-planet , og visualiserer deres diffusjonsatferd og lokalisering (venstre panel). Videre kan hver banes intensiteter plottes over tid for å identifisere FRET-overganger eller bleketrinn (midtpanelet viser den røde banen fra venstre panel). Den resulterende FRET-effektiviteten og stoichiometrien kan visualiseres på samme måte (høyre panel). (C) smFRET-baner ved hjelp av DNA-sensoren for Holliday-krysset. HBSS + 12 mM MgCl2 ble brukt som buffer under målingene. Bortsett fra det tilsynelatende akseptorblekingstrinnet nær sekvensenden av disse eksemplene, kan frekvensen av FRET-overganger for hver sensor bestemmes. Holliday-veikryssene bytter samsvar med en høy frekvens, mens sensoren for molekylær kraft ikke viser FRET-overganger. Denne informasjonen gjør det mulig å justere de eksperimentelle forholdene, for eksempel forsinkelsen mellom rammene, for å øke eller redusere antall observerte overganger. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverføring; smFRET = enkeltmolekyl FRET; HBSS = Hanks balanserte saltoppløsning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tilleggsinformasjon: Lokalisering og sporing av enkeltmolekyler (01. Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Denne artikkelen presenterer en metode for romlig analyse av mobil, enkeltmolekyl Förster resonans energioverføring (smFRET)-baserte sonder ved hjelp av widefield fluorescensmikroskopi. Det nyutviklede programvareverktøysettet gjør det mulig å bestemme smFRET-tidsspor for bevegelige sonder, inkludert riktig FRET-effektivitet og molekylære posisjoner, som tidsfunksjoner.

Automatisert todimensjonal romlig analyse av mobile ettmolekyls FRET-sonder

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Ettmolekyls FRET-eksperimenter ved hjelp av overflatebundne sonder har blitt utført nesten utelukkende på immobiliserte molekyler tidligere. Imidlertid diffuserer mange biomolekyler og kan analyseres med vår metode. Ved å kombinere enkeltmolekylet FRET med sporing er det mulig å analysere ikke bare FRET-mangeltidsspor av bevegelige sonder, men også å undersøke romlige aspekter som diffusjonsadferd.Vår metode er kompatibel med en rekke forskjellige FRET-baserte sonder. Det kan for eksempel gi innsikt i molekylære krefter, konformasjonsdynamikk og bindende kinetikk i levende celleeksperimenter. Fret-eksperimenter av høy kvalitet er notorisk vanskelige å utføre.For pålitelig kvantifisering er det viktig å registrere data med et godt signal-til-støy-forhold og enkeltmolekylspor med tilstrekkelig lengde. For å starte prøvemålingen, begeistre donoren og akseptørens fluoroforer i en passende belysningstid mens du utløser kameraet og vent til kameraets avlesning er aktivert. Gjenta eksitasjonen av donor og aksepter fluoroforer alternativt.Velg antall repetisjoner som skal være store nok til å sikre fotobleking av minst en fluorofor per sonde innen synsfeltet, slik at trinnvis fotobleachinganalyse kan diskriminere enkeltmolekylsignaler fra aggregater. Angi belysningssekvensen for å tillate valg av eksitasjonsrammer for donor og aksepter samt rammer for bildesegmentering fra innspilte bildesekvenser. Analyser datasettene som er registrert ved hjelp av de samme belysningsinnstillingene samtidig.Til dette formål tilordner du en identifikator og et mønster som samsvarer med de respektive bildesekvensfilnavnene til hvert datasett. I tillegg kan du definere spesifikke datasett for spesielle formål, for eksempel opptak av fiducial markører for bilderegistrering, eksitasjonslysprofiler for flat feltkorrigering, og eventuelt bare donor- og aksepterprøver for å bestemme korrigeringsfaktorer. Deretter velger du utslippskanaler og RAW-bilder hvis begge kanalene er tatt opp med ett enkelt kamera.For dette, bruk riktig grafisk widget for å velge passende regioner for donor- og akseptutslipp, og deretter lokalisere fiducial markører i begge utslippskanaler og utføre bilderegistrering. Bruk det medfølgende brukergrensesnittet til å finne de riktige parameterne for lokaliseringsalgoritmen for både giver- og akseptutslippskanaler. Deretter angir du lokaliseringsparametere for enkeltmolekyler for FRET-sonder ved donoreksitasjon i summen av bildene hentet fra donor- og akseptorutslipp, og angir deretter lokaliseringsparametere for sonder ved akseptoreksitasjon i akseptorutslippskanalen.Lokaliser FRET-sondene ved donor og akseptoreksitasjon uavhengig i alle rammer. Resultatene slås sammen til én tabell som inneholder det opprinnelige rammenummeret, todimensjonale koordinater og en identifikator som refererer til kildebildefilen. Hvis du vil spore og måle fluorescensintensitet, velger du passende alternativer for Trackpy-algoritmen for å koble FRET-sondelokaliseringer til baner.Deretter bruker du analyseprogramvarefunksjonaliteten til å behandle hjelpebildedata fra bildesekvenser. Trekk ut flere bilder som er tatt for å lette segmentering merket med S i eksitasjonssekvensen. Til slutt bestemmer du donor- og akseptoreksitasjonslysprofilene på tvers av synsfeltet fra bilder som er tatt opp på et tett merket utvalg.For de første filtreringstrinnene, kast signaler med overlappende punktspredningsfunksjoner, da det er vanskelig å bestemme fluorescensintensitetene pålitelig. Ved inhomogen belysning, godta bare signaler som ligger i godt opplyste områder innen synsfeltet for å sikre godt signal-til-støy-forhold. Hvis du studerer intramolekylær FRET, begrense analysen til de banene som er tilstede fra begynnelsen av bildesekvensen.Deretter utfører du den flate feltkorrigeringen, som bruker eksitasjonslyskildeprofilene som ble oppnådd tidligere for å reversere de posisjonsavhengige fluorescensintensitetsvariasjonene forårsaket av inhomogen belysning, og deretter beregne den tilsynelatende FRET-effektiviteten og den tilsynelatende stoichiometrien. For å utføre trinnvis analyse av fotobleaching for diskriminering mellom enkeltmolekylære sonder og aggregater, finn passende parametere for endringspunktdeteksjonsalgoritmen ved donor og akseptereksitasjon uavhengig. Utfør deretter algoritmen for endringspunktgjenkjenning.Hvis du vil fjerne spor som viser tvetydig fotobleaching-virkemåte, definerer du intensitetsterskler som en fluorofor anses som bleket under, og deretter velger du ett av følgende alternativer. Alternativ en hvor akseptor fluorophore blekemidler i et enkelt trinn mens donoren viser ingen delvis bleking. Alternativ to der donor blekes i et enkelt trinn mens det ikke er noen delvis akseptorbleking.Alternativ tre hvor enten fluorofor blekemidler i et enkelt trinn mens den andre ikke delvis blekes. Og alternativ fire der donor og akseptor fluorophores viser enkeltsteg fotobleaching eller ingen fotobleaching i det hele tatt. Beregn deretter korreksjonsfaktorene for donorutslippslekkasje i akseptorkanalen, direkte akseptoreksitasjon, deteksjonseffektivitet og eksitasjonseffektivitet.Deretter bruker du korreksjonsfaktorene til å beregne FRET-effektivitet fra tilsynelatende effektivitet og stoichiometri fra tilsynelatende støkiometri. Hvis du vil filtrere ytterligere, velger du bare datapunkter fra før den første blekingshendelsen i hver bane. I tillegg, for å begrense analysen til enkeltmolekylsonder, godtar du bare baner med minst 75% av datapunktene innenfor de aktuelle stoichiometrigrensene.Utfør deretter bildesegmentering via globale eller adaptive terskelmetoder på de aktuelle hjelpebildene for å begrense analysen til forskjellige områder innen synsfeltet. Skap effektivitet kontra stoichiometri tomter for å bekrefte at signaler om feil stoichiometri er riktig identifisert og fjernet. Deretter plott histogrammer av FRET effektivitet for å gi en veletablert oversikt over FRET effektivitet distribusjoner og grupper histogrammer for praktisk sammenligning av resultater fra ulike eksperimenter.Ved å dra nytte av vitenskapelige Python-biblioteker, er det mulig å evaluere dataene i notatboken ytterligere, og utføre for eksempel diffusjonsanalyse. Visualisering og sporing av en-molekyl FRET hendelse er vist her. Filtrerte FRET-hendelser representeres av effektivitet kontra stoichiometriplott i et FRET-effektivitets histogram.Videre kan mobilitetsparametere undersøkes ved å plotte en individuell bane i en XY-tomt eller en gjennomsnittlig firkantet forskyvningsplott. Utgangen av plattformen vår gjør det mulig for oss å identifisere overganger ytterligere i FRET effektivitetstid spor av mobile sonder. For eksempel, for å evaluere konformasjonsendringer av biomolekylene.Ved hjelp av en FRET-basert kraftsensor tillot analyseplattformen oss å kvantifisere enkeltmolekylkrafthendelser i den immunologiske synapsen under tidlig T-cellesignalering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed Single-molekyl kraft proteolyse målinger ved hjelp av Magnetic pinsett

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Kvantitativ FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse for SENP1 Protease Kinetics Bestemmelse

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Gransker Receptor-ligandsysternene med Cellulosome med AFM-baserte Single-molekyl kraft spektroskopi

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høyoppløselig Spatiotemporal Analyse av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescens mikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enkelt Molecule Fluorescensmikroskopi på Planar Støttet bilagene

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Etikett-free enkelt molekyl Detection Bruke Microtoroid Optiske resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Sensitive Påvisning av Proteopathic Seeding aktivitet med FRET flowcytometrisystemer

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescens Recovery etter Flette en Droplet Mål To-dimensjonal Diffusion of et fosfolipid med ett lag

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatisert Sammentrekning Analysis of Human Engineered hjertevev for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...