Name: automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
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Este trabalho foi apoiado pelos projetos do Fundo Austríaco de Ciência (FWF) P30214-N36, P32307-B e pelo LS13-030 do Fundo de Ciência e Tecnologia de Viena (WWTF).

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Os autores não declaram conflitos de interesse.

Este artigo detalha um pipeline para as gravações automatizadas e a análise quantitativa dos dados smFRET originados de moléculas de sondas móveis e superficiais. Complementa as duas abordagens predominantes para experimentos smFRET, envolvendo sondas imobilizadas de superfície ou sondas difundindo em solução dentro e fora de um volume de excitação confocal17. Fornece a eficiência correta do FRET e as posições moleculares em função do tempo. Pode, portanto, ser usado como entrada para programas de análise especializados, por exemplo, para quantificar cinética de transição1, histogramas FRET39 ou difusão bidimensional22.
O software é lançado sob uma licença gratuita e de código aberto aprovada pela Open Source Initiative que concede ao usuário o direito perpétuo de livre uso, modificação e redistribuição. O Github foi escolhido como uma plataforma de desenvolvimento e distribuição para facilitar a obtenção do software e participar do processo de desenvolvimento, reportando bugs ou contribuindo com o code40. Escrito em Python, o software não depende de componentes proprietários. A escolha dos notebooks Jupyter como interfaces de usuário facilita a inspeção de dados a cada etapa de análise e permite a adaptação e ampliação do pipeline especificamente para o sistema experimental em mãos. A biblioteca sdt-python32 serve como base e implementa funcionalidade para avaliar dados de microscopia de fluorescência, como localização de molécula única, análise de difusão, análise de intensidade de fluorescência, registro de canal de cores, análise de colocalização e manuseio de ROI.
Em princípio, o rastreamento de partículas únicas pode ser realizado em sistemas uni, bi ou tridimensionais. Aqui, o pipeline de análise de molécula única foi adaptado para o estudo de sistemas móveis 2D. Essa escolha espelha a disponibilidade de sistemas simples, como bicamadas lipídicas (SLBs) suportadas por planar, para apresentar sondas fluorescentes móveis. Tais sistemas lipídicos de bicamadas são tipicamente compostos de dois ou mais moieties fosfolipídios, onde a fração a granel determina os parâmetros físico-químicos chave do SLB (como fase e viscosidade), e a fração menor fornece locais de apego para biomoléculas. Esses locais de apego podem ser fosfolipídios biotinilados para plataformas de proteína baseadas em avidin ou streptavidin ou fosfolipídios conjugados níquel-NTA para plataformas proteicas com tags histidina41. A escolha da plataforma apropriada para a vinculação de proteínas ao SLB depende da questão científica. Os leitores podem consultar a literatura16,38,42, por exemplo, de estratégias empregadas com sucesso. A densidade de sondas na amostra deve ser suficientemente baixa para evitar funções de propagação de pontos sobrepostas; tipicamente, menos de 0,1 moléculas por μm2 são recomendadas. Consulte a seção de resultados representativos (em particular, Figura 6) para um exemplo mostrando uma densidade de sonda adequada. O método de análise também é aplicável a moléculas de proteínas rotuladas fluorescentes únicas na membrana plasmática das células vivas.
Um aspecto crítico dos experimentos smFRET é a produção e caracterização das próprias sondas FRET. Ao escolher fluoroforos para um par DESU, seu raio Förster deve coincidir com as distâncias inter-corantes esperadas43. Corantes resistentes ao fotobleaching são preferidos, pois produzem traços de longo prazo. No entanto, para taxas elevadas de branqueamento, uma espécie de fluorforeiro pode ser utilizada para reconhecer eventos multiemistros originários de moléculas colocalizadas através da análise de fotobleaching stepwise; ver o passo 8.1.4 na seção protocolo. Os pares fluoróforos devem ser ligados especificamente e covalentemente às moléculas de interesse, formando pares FRET intra ou intermolecular.
A combinação do SMFRET com outras técnicas prontamente disponíveis pode aumentar sua resolução espacial além do limite de difração (via STED44). O algoritmo de rastreamento smFRET apresentado aqui amplia a aplicabilidade da abordagem para novas configurações experimentais e sistemas de modelos. Isso inclui estudos de (i) alterações cinéticas na estequiometria das biomoléculas móveis, (ii) associação dinâmica de biomoléculas móveis, (iii) a taxa de reações enzimáticas de reagentes livremente difundidores, e (iv) a cinética das alterações conformacionais das biomoléculas móveis. Os dois primeiros exemplos requerem sistemas de modelos que mostrem FRET intermolecular, ou seja, doador e aceitador são conjugados para separar entidades biomoleculares de interesse. Estes últimos exemplos podem fazer uso de biosensores portadores de doador e aceitador dentro da mesma entidade molecular (FRET intramolecular).
Sensores intramoleculares baseados em FRET podem fornecer informações sobre alterações conformais intrínsecas de biomoléculas1,2,3,4, alterações conformais causadas por carga de força endógena ou externa (sensores de força molecular16), ou concentrações de íons no nano ambiente, como cálcio45 e pH46 . Dependendo do sistema de modelo e da plataforma de ancoragem preferida, tais eventos smFRET podem ser rastreados em 2D ou 3D: (i) o rastreamento planar de eventos smFRET pode ser empregado para a quantificação dos tempos de interação receptor-ligante dentro de uma membrana plasmática, a associação de cascatas de amplificação de sinal ancorado em membrana e as alterações estequiomárias dos receptores de superfície; (ii) o rastreamento de volume de eventos smFRET pode ser usado para qualquer sonda FRET intra ou intermolecular em células vivas ou em sistemas reconstituídos in vitro.
O método de rastreamento smFRET foi desenvolvido principalmente com sondas FRET intramolecular em mente. Essas sondas apresentam um número fixo e bem conhecido de rótulos fluorescentes, fato que foi explorado para rejeitar dados de moléculas agglomeradas e incorretamente sintetizadas (por exemplo, incompletamente rotuladas), bem como de sondas onde um dos fluoroforos foi fotobleachado. No entanto, ajustando as etapas de filtragem, o método também pode ser aplicado a sondas FRET intermoleculares. Por exemplo, em vez de aceitar apenas moléculas com um único doador e um único fluoróforo aceitor, pode-se examinar as trajetórias espaciais de corantes doadores e aceitadores e selecionar, por exemplo, para co-difundir trajetórias de aceitadores de doadores.
Como o algoritmo 3D-DAOSTORM tem suporte para determinar a posição de um sinal ao longo do eixo óptico através do astigmatismo devido a uma lente cilíndrica no caminho do feixe de emissão, experimentos 3D poderiam ser facilmente integrados ao pipeline de análise. Neste caso, o sinal de aceitação sobre a excitação aceitante serviria para determinar a estequiometria e a posição axial. O software de análise também pode ser empregado para avaliar dados de experimentos com sondas imobilizadas utilizando seu grande grau de esquemas de automação e filtragem. De fato, os conjuntos de dados de eficiência smFRET das junções Holliday imobilizadas em bicamadas em fase de gel38 foram analisados usando uma versão inicial do software.

A transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) tem sido um grande impulsionador em pesquisas biológicas e biofísicas moleculares, pois permite a investigação de processos em resolução de subnômetros. Como a eficiência da transferência de energia entre fluoroforos doadores e aceitadores depende fortemente da distância entre corantes no subnômetro para o nanômetro, tem sido efetivamente usada como uma régua espectrística para explorar a conformação estática e dinâmica das biomoléculas1,2,3,4. Além disso, o fenômeno FRET tem sido amplamente utilizado para estudos de colocalização de proteínas associadas à membrana e intracelulares em um nível a granel5,6. Nas últimas duas décadas, o método foi adaptado para monitoramento de eventos smFRET7, o que ajudou a aumentar substancialmente a resolução temporal e espacial e resolveu até subpopulações raras em amostras heterogêneas. Equipados com essas técnicas, foram adquiridos insights únicos na dinâmica das máquinas moleculares, como a taxa de processamento de transcrição da polimerase RNA II8, a velocidade de replicação das polimerases de DNA 9,10, a taxa de translocação nucleossomo11, a taxa de emenda de transcrição e a taxa de paralisação dos conjuntos 12, a atividade das subpopulações ribossômicas13, e a velocidade de caminhada de motores de kinesin1414 , para citar alguns. As durações de interação receptor-ligante15 e forças moleculares16 foram quantificadas.
Estudos smFRET baseados em intensidade normalmente dependem de emissões sensibilizadas para medir a eficiência do FRET: um divisor de feixe no caminho de emissão separa espacialmente a luz originária de fluoroforos doadores e aceitadores após a excitação do doador, permitindo a quantificação das intensidades individuais de fluorescência. A eficiência pode ser posteriormente calculada como a fração de fótons emitidos pelo aceitador em relação à contagem total de fótons17. Além disso, a excitação aceitadora após a excitação do doador (ALEX) permite a medição da estequiometria dos eventos FRET, auxiliando na discriminação entre sinais verdadeiros de baixo FRET de sinais decorrentes, por exemplo, de sondas com um fluoroforeiro aceitador fotobleachado18.
Experimentos fret de molécula única são comumente realizados de duas maneiras. Primeiro, uma pequena região no volume da amostra é iluminada usando um microscópio confocal. Moléculas de sonda única em solução estão animadas quando se difundem dentro do volume focal. Com esta técnica, podem ser utilizados detectores rápidos de contagem de fótons, permitindo a resolução de tempo sub-microsegundo. Em segundo lugar, as sondas são especificamente imobilizadas em superfícies e monitoradas via microscopia de campo largo, muitas vezes usando a configuração de reflexão interna total (TIR) para minimizar a fluorescência de fundo. A imobilização da sonda permite tempos de gravação muito mais longos do que usar a primeira abordagem. Além disso, o campo de visão maior permite o monitoramento de múltiplas sondas em paralelo. A necessidade de uma câmera torna este método lento em comparação com o descrito acima. A resolução de tempo é limitada ao milissegundo para o segundo intervalo.
Se forem necessários traços de longo tempo, por exemplo, para estudar processos dinâmicos em uma escala de milissegundo a segunda vez, o primeiro método não é aplicável, pois as explosões de fluorescência são tipicamente muito curtas. A segunda abordagem falha sempre que a imobilização não é viável, por exemplo, em experimentos de células vivas com sondas difundindo dentro da membrana celular. Além disso, observou-se que os sistemas de modelos biológicos podem variar drasticamente sua resposta dependendo da mobilidade da superfície contatada16.
Embora os experimentos combinados de rastreamento de smFRET e single-particle que gravam testes FRET móveis tenham sido realizados no passado19, não há software disponível publicamente para a avaliação dos dados. Isso levou ao desenvolvimento de uma nova plataforma de análise, que permite a determinação de múltiplas propriedades de sondas fluorescentes móveis, incluindo eficiência smFRET e estequiometria, posições com precisão de subcontomínuo e intensidades de fluorescência como funções do tempo. Métodos para filtrar os traços resultantes examinando o comportamento de branqueamento passo a passo, distâncias mais próximas do vizinho, intensidades de emissão e outros traços foram estabelecidos para escolher exclusivamente moléculas de sonda única sintetizadas e funcionais corretamente. O software também suporta técnicas experimentais e analíticas recentemente acordadas em um estudo multilaboratório para produzir dados smFRET confiáveis e quantitativos17. Em particular, a implementação adere aos procedimentos validados para o cálculo da eficiência do FRET e da estequiometria. As intensidades de fluorescência após a excitação do doador no canal de emissão de doadores IDD e no canal de emissão aceitador IDA são utilizadas para o cálculo da aparente eficiência do FRET Eapp usando eq (1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg"> (1)
Com a ajuda da intensidade da fluorescência no canal de emissão aceitador após a excitação aceitante IAA, a estoquiometria aparente é calculada usando Eq (2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg"> (2)
A eficiência FRET E e o estequiometria S podem ser derivados de Eapp e Sapp considerando quatro fatores de correção.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg">
α descreve o vazamento da fluorescência do doador no canal de emissão do aceitador e pode ser determinado usando uma amostra contendo apenas fluoroforos doadores ou analisando partes de trajetórias onde o aceitador foi branqueado. δ corrige para a excitação direta do aceitador pela fonte de luz de excitação do doador e pode ser medido usando uma amostra com fluoroforos aceitádores ou analisando partes de trajetórias onde o doador foi branqueado.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg">.
γ dimensiona o IDD para corrigir a eficiência de detecção divergente nos canais de emissão de doadores e aceitadores e diferentes eficiências quânticas dos fluoroforos. O fator pode ser computado analisando o aumento da intensidade do doador após o branqueamento aceitador em trajetórias com alta eficiência de FRET20 ou estudando uma amostra com múltiplos estados fret discretos.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg">
β dimensiona a IAA para corrigir a eficiência díspare da excitação de doadores e aceitadores. Se γ foi determinada através da análise de branqueamento aceitante, β poderia ser calculada a partir de uma amostra da relação doador-aceitador conhecido21. Caso contrário, a amostra de FRET multi-estado também rende β.
Juntas, as correções permitem o cálculo da eficiência fret corrigida utilizando Eq (3).
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg"> (3)
e a estequiometria corrigida utilizando Eq (4).
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg"> (4)
Idealmente, a estequiometria corrigida para uma relação doador-aceitador de 1:1 dá S = 0,5. Na prática, uma redução da relação sinal-ruído produz uma disseminação dos valores medidos de S, dificultando a discriminação de sinais somente de doadores (S = 1) e sinais somente de aceitadores (S = 0). Os traços de tempo resultantes podem ser usados como entrada para uma análise mais detalhada das trajetórias de uma molécula única para obter informações como perfis de força espesso16, mobilidade dos eventos de molécula única22 ou cinética de transição entre diferentes estados1.
O protocolo a seguir descreve parâmetros experimentais e procedimentos para experimentos de rastreamento smFRET, bem como o princípio de trabalho por trás da análise de dados usando o recém-desenvolvido conjunto de software. Para a aquisição de dados experimentais, recomenda-se a utilização de uma configuração de microscopia atendendo aos seguintes requisitos: i) capacidade de detecção da emissão de moléculas de corante único; ii) iluminação de campo largo: em particular para experimentos com células vivas, recomenda-se a configuração de reflexão interna total (TIR23,24,25); iii) separação espacial da luz de emissão de acordo com o comprimento de onda de tal forma que a fluorescência doador e aceitadora seja projetada em diferentes regiões do mesmo chip de câmera25 ou câmeras diferentes; iv) modulação de fontes de luz para excitação doador e aceitadora com precisão de milissegundo, por exemplo, utilizando lasers diretamente moduladores ou modulação através de moduladores acousto-ópticos. Isso permite a iluminação e stroboscópica para minimizar o fotobleaching de fluoroforos, bem como a excitação alternada para determinar estequiometrias; v) saída de um arquivo por sequência de imagem gravada em um formato que pode ser lido pelo pacote PIMS Python26. Em particular, os arquivos TIFF de várias páginas são suportados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790404P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945; Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1084-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer microscope body</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET570/60m</td>
			<td>donor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET675/50m</td>
			<td>acceptor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conda-forge</td>
			<td>conda-forge community</td>
			<td></td>
			<td>community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td>
			<td>MENZEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>FF640-FDi01-25&#215;36</td>
			<td>separation of donor and acceptor emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (quad band)</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>Di01-R405/488/532/635-25&#215;36</td>
			<td>separation of excitation and emission light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fret-analysis</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python package for smFRET data analysis; version 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11524766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBeam Smart 405-S 405 nm laser</td>
			<td>Toptica Photonics AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek chambers (8 wells)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177402PK</td>
			<td>for sample preparation and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenia Prime 532 nm laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniconda</td>
			<td>Anaconda Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Python 3 distribution. Min. version: 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20860 &#38; 20859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBIS 640 nm laser</td>
			<td>Coherent Inc</td>
			<td>1185055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optosplit II</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5253</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sdt-python</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python library for data analysis; version 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpek bead size kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T14792</td>
			<td>Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USC500TH Ultrasound bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>for SUV formation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes

Transferência de energia de ressonância Förster de uma molécula única (smFRET) é uma técnica versátil que relata distâncias no subnômetro até a faixa de nanômetros. Tem sido usado em uma ampla gama de experimentos biológicos biofísicos e moleculares, incluindo a medição de forças moleculares, caracterização da dinâmica conformacional das biomoléculas, observação da colocalização intracelular de proteínas e determinação dos tempos de interação receptor-ligante. Em uma configuração de microscopia de campo largo, os experimentos são tipicamente realizados usando sondas imobilizadas pela superfície. Aqui, é apresentado um método que combina rastreamento de molécula única com experimentos de smFRET de excitação alternada (ALEX), permitindo a aquisição de traços de tempo smFRET de sondas superficiais, mas móveis em membranas plasmáticas ou bicamadas lipídicas suportadas por vidro. Para a análise dos dados registrados, foi desenvolvida uma coleta automatizada de software de código aberto apoiando (i) a localização de sinais fluorescentes, (ii) rastreamento de partículas únicas, (iii) determinação de quantidades relacionadas ao FRET, incluindo fatores de correção, (iv) verificação rigorosa de traços smFRET e (v) apresentação intuitiva dos resultados. Os dados gerados podem ser convenientemente usados como entrada para posterior exploração via software especializado, por exemplo, para a avaliação do comportamento difuso das sondas ou a investigação de transições de FRET.

Uma variedade de informações de baixo e alto nível pode ser extraída de trilhas smFRET dependendo da questão científica do experimento. Aqui, são apresentados exemplos de pipelines de análise com sondas analógicas e digitais: um sensor de força molecular baseado em peptídeo16 e uma sonda de DNA com comutação estocástica de sua conformação38, respectivamente. Consulte a Figura 5 para o princípio de design e trabalho destas sondas.
Após a execução dos algoritmos de localização e rastreamento, conforme descrito no protocolo, o pacote oferece múltiplas ferramentas de visualização de dados para otimizar os parâmetros iniciais e as etapas subsequentes do filtro: (i) visualização de eventos smFRET individuais, (ii) segmentação opcional de imagem para analisar dados em determinadas regiões de interesses, (iii) monitoramento de etapas de filtro via incisoologia FRET versus estoquiometria (E-S). A visualização dos dados de molécula única é apresentada na Figura 6.
Finalmente, os eventos FRET filtrados são representados por um enredo E-S e um histograma de eficiência FRET (Figura 4). O enredo E-S é uma ferramenta útil para otimizar as etapas de filtragem acima mencionadas e investigar o resultado final. Sensores FRET parcialmente branqueados ou incompletamente rotulados podem ser excluídos pelo seu valor de estequiometria. Os parâmetros de mobilidade podem ser investigados traçando um caminho de trajetória individual em um enredo x-y (Figura 6) ou um enredo de deslocamento quadrado médio (MSD) (Figura 4). O primeiro método é especialmente útil para discriminar o celular a partir de eventos imobilizados, enquanto o segundo é usado para calcular o coeficiente de difusão.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> Figura 4: Saída exemplar. (A) A eficiência do FRET é plotada versus estequiometria (enredo E-S) para uma população do sensor de força molecular (painel esquerdo) decorando uma bicamada lipídica suportada por vidro e tensa por uma célula T. Apenas uma nuvem populacional é visível. O respectivo histograma de eficiências de FRET exemplifica a diferença entre uma população de sensores de força na presença e ausência de células (painel médio). Não se pode observar mudança para menor eficiência de FRET da população de sensores na presença de células T, indicando pouco ou nenhum alongamento dependente da força do módulo do sensor. O enredo MSD dessas condições experimentais confirma que a população do sensor de força sob uma célula T se move consideravelmente mais lenta do que suas contrapartes desvinculadas (painel direito). (B) A mesma análise foi realizada com o sensor de DNA de junção holliday decorando uma bicamada lipídica de fluido suportada por vidro. A trama E-S mostra claramente duas populações, que também são aparentes no histograma de eficiência da FRET. O gráfico MSD indica a presença de uma população de sensores em movimento rápido. Abreviaturas: FRET = Transferência de energia de ressonância förster; MSD = deslocamento quadrado médio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> Figura 5: Princípio de design e trabalho das sondas FRET intramolecular. (A) Sensor de peptídeo analógico para quantificação de forças moleculares mecânicas. Os fluoroforos doadores e aceitantes estão covalentemente ligados a ambos os lados da espinha dorsal do peptídeo. O módulo do sensor é especificamente ligado a um ligante específico, que por sua vez liga um receptor de interesse de superfície residente em células (aqui, um fragmento de anticorpo especificamente reconhecendo a cadeia beta do receptor de células T). Após a ligação receptor-ligante, a força é exercida, e o módulo do sensor se estende e eventualmente recua após o decote da ligação. Este painel é modificado a partir de 16. (B) Sensor de DNA digital para quantificação de transições de FRET. O sensor FRET é composto por quatro fios de DNA formando uma junção Holliday. O doador e o fluoróforo aceitor estão covalentemente ligados a dois fios. As junções holliday frequentemente mudam sua conformação dependendo das condições de tampão circundantes. A comutação estocástica dessas conformações pode ser monitorada quantificando a eficiência do FRET de sondas individuais. Abreviaturas: TCR = receptor de células T; FRET = Transferência de energia de ressonância förster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> Figura 6: Exemplos de localização e rastreamento de sondas FRET. (A) A eficiência do FRET e a estequiometria de eventos individuais são calculadas quantificando a intensidade do fluorohore doador após a excitação do doador (D → D), o fluorohore acceptor após a excitação do doador (D → A) e o fluoróforo aceitor após a excitação aceitadora (A → A). A filtragem do vizinho mais próximo evita o viés ao sobrepor funções de propagação de pontos de emissores próximos. A segmentação de imagens permite que o usuário escolha certos eventos smFRET localizados dentro de uma área de interesse (por exemplo, uma célula ou um micropattern). Como exemplo de segmentação de imagem, as células T foram manchadas com Fura-2 (exibidas à esquerda) e submetidas a limiares adaptativos para identificar as bordas celulares (linha pontilhada laranja). Barras de escala = trajetórias smFRET de 5 μm. (B) utilizando o sensor de força molecular. Trajetórias individuais podem ser traçadas no plano x-y , visualizando seu comportamento de difusão e localização (painel esquerdo). Além disso, as intensidades de cada trajetória podem ser traçadas ao longo do tempo para identificar transições de FRET ou passos de branqueamento (painel do meio mostra a trajetória vermelha do painel esquerdo). A eficiência e a estequiometria de FRET resultantes podem ser visualizadas de forma semelhante (painel direito). (C) trajetórias smFRET usando o sensor de DNA de junção Holliday. HBSS + 12 mM MgCl2 foi utilizado como tampão durante as medições. Além do aparente passo de branqueamento do aceitador perto do final da sequência desses exemplos, a frequência de transições de FRET para cada sensor pode ser determinada. As junções holliday alternam sua conformação com uma alta frequência, enquanto o sensor de força molecular não exibe transições DE FRET. Essas informações possibilitam ajustar as condições experimentais, como o atraso entre os quadros, para aumentar ou reduzir o número de transições observadas. Abreviaturas: FRET = Transferência de energia de ressonância förster; smFRET = fret de molécula única; HBSS = Solução de sal balanceada da Hank. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Informações Suplementares: Localização e rastreamento de moléculas únicas (01). Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>

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Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Este artigo apresenta um método para análise espiostemporal de sondas móveis, de uma molécula, baseadas em Förster, utilizando microscopia de fluorescência widefield. O kit de ferramentas de software recém-desenvolvido permite a determinação de traços de tempo smFRET de sondas móveis, incluindo a eficiência correta do FRET e as posições moleculares, em função do tempo.

Análise espacial bidimensional automatizada de sondas FRET de molécula única móvel

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Experimentos fret de molécula única usando sondas ligadas à superfície foram realizados quase exclusivamente em moléculas imobilizadas no passado. No entanto, muitas biomoléculas difusas e podem ser analisadas com nosso método. A combinação de FRET de molécula única com o rastreamento torna possível analisar não apenas traços de tempo de deficiência de FRET de sondas móveis, mas também investigar aspectos espessotemporais, como o comportamento difuso.Nosso método é compatível com uma variedade de diferentes sondas baseadas em FRET. Por exemplo, poderia fornecer insights sobre forças moleculares, dinâmica conformacional e cinética de ligação em experimentos de células vivas. Experimentos fret de molécula única de alta qualidade são notoriamente difíceis de executar.Para quantificação confiável, é importante registrar dados em uma boa relação sinal-ruído e faixas de uma molécula de comprimento suficiente. Para iniciar a medição da amostra, excite o doador e os fluoroforos aceitádores para um tempo de iluminação apropriado enquanto aciona a câmera e espere até que a leitura da câmera seja ativada. Repita a excitação do doador e dos fluoroforos aceitador alternativamente.Escolha o número de repetições para ser grande o suficiente para garantir o fotobleaching de pelo menos um fluoróforo por sonda dentro do campo de visão permitindo que a análise de fotobleaching stepwise discriminar sinais de molécula única a partir de agregados. Especifique a sequência de iluminação para permitir a seleção de quadros de excitação doador e aceitador, bem como quadros para segmentação de imagens a partir de sequências de imagem gravadas. Simultaneamente, analise os conjuntos de dados registrados usando as mesmas configurações de iluminação.Para isso, atribua um identificador e um padrão que corresponda aos respectivos nomes de arquivos de sequência de imagem a cada conjunto de dados. Além disso, defina conjuntos de dados específicos para fins especiais, como registros de marcadores fiduciários para registro de imagem, perfis de luz de excitação para correção de campo plano e, opcionalmente, amostras somente para doadores e aceitadores para determinar fatores de correção. Em seguida, selecione canais de emissão e imagens brutas se ambos os canais forem gravados usando uma única câmera.Para isso, use o widget gráfico apropriado para selecionar regiões apropriadas para emissão de doadores e aceitadores e, em seguida, localize marcadores fiduciais em ambos os canais de emissão e realize o registro de imagens. Use a interface de usuário fornecida para encontrar os parâmetros apropriados para o algoritmo de localização para canais de emissão de doadores e aceitadoras. Em seguida, defina parâmetros de localização de molécula única para sondas FRET após a excitação do doador na soma das imagens obtidas das emissões de doadores e aceitadores, em seguida, defina parâmetros de localização para sondas após a excitação aceitadora no canal de emissão de aceitadores.Localize as sondas FRET sobre a excitação de doadores e aceitadores independentemente em todos os quadros. Os resultados são mesclados em uma tabela que contém o número do quadro original, coordenadas bidimensionais e um identificador referente ao arquivo de imagem de origem. Para rastrear e medir a intensidade da fluorescência, escolha opções apropriadas para o algoritmo Trackpy para vincular localizações de sonda FRET em trajetórias.Em seguida, usando a funcionalidade do software de análise, processe dados de imagem auxiliares de sequências de imagens. Extrair imagens adicionais gravadas para facilitar a segmentação marcada por S na sequência de excitação. Por fim, determine os perfis de luz de excitação do doador e do usuário em todo o campo de visão a partir de imagens gravadas em uma amostra densamente rotulada.Para as etapas iniciais de filtragem, descarte sinais com funções de propagação de ponto sobrepostas, pois é difícil determinar suas intensidades de fluorescência de forma confiável. No caso da iluminação inhomogenous, aceite apenas sinais localizados em regiões bem iluminadas dentro do campo de visão para garantir uma boa relação sinal-ruído. Se estudar o FRET intramolecular, restrinja a análise às trajetórias presentes desde o início da sequência da imagem.Em seguida, execute a correção de campo plano, que utiliza os perfis de fonte de luz de excitação obtidos anteriormente para reverter as variações de intensidade de fluorescência dependentes da posição causadas pela iluminação inhomogenous, em seguida, calcular a aparente eficiência de FRET e a aparente estequiometria. Para realizar a análise passo a passo do fotobleaching para discriminar entre sondas moleculares únicas e agregados, encontre parâmetros apropriados para o algoritmo de detecção de ponto de mudança sobre a excitação de doadores e aceitadores independentemente. Em seguida, execute o algoritmo de detecção de ponto de mudança.Para remover a faixa mostrando comportamento fotobleaching ambíguo, defina limiares de intensidade abaixo dos quais um fluoróforo é considerado branqueado e selecione uma das seguintes opções. Opção um em que o fluoróforo aceitante branqueia em um único passo enquanto o doador não mostra branqueamento parcial. Opção dois em que o doador branqueia em um único passo enquanto não há um branqueamento parcial.Opção três em que ou fluorfora em um único passo, enquanto o outro não alveja parcialmente. E opção quatro em que doador e fluoroforos aceitantes mostram fotobleaching de passo único ou nenhuma fotobleaching em tudo. Em seguida, calcule os fatores de correção para o vazamento de emissões de doadores no canal de aceitação, excitação aceitadora direta, eficiência de detecção e eficiência de excitação.Em seguida, use os fatores de correção para calcular a eficiência do FRET a partir da eficiência aparente e da estequiometria a partir de estequiometria aparente. Para posterior filtragem, selecione apenas pontos de dados de antes do primeiro evento de branqueamento em cada trajetória. Além disso, para restringir a análise a sondas de molécula única, aceite apenas trajetórias com pelo menos 75% dos pontos de dados dentro dos limites apropriados de estequiometria.Em seguida, realize a segmentação de imagens através de métodos de limiar global ou adaptável nas imagens auxiliares apropriadas para restringir a análise a regiões distintas no campo de visão. Crie eficiência versus parcelas de estequiometria para verificar se sinais de estequiometria incorreta foram corretamente identificados e removidos. Em seguida, plote histogramas de eficiências fret para fornecer uma visão geral bem estabelecida das distribuições de eficiência da FRET e agrupar os histogramas para comparação conveniente de resultados de diferentes experimentos.Aproveitando as bibliotecas científicas python, é possível avaliar ainda mais os dados dentro do notebook, realizando, por exemplo, análise de difusão. Visualização e rastreamento de evento FRET de molécula única são mostrados aqui. Os eventos FRET filtrados são representados por gráficos de eficiência versus estequiometria em um histograma de eficiência FRET.Além disso, os parâmetros de mobilidade podem ser investigados plotando um caminho de trajetória individual em um enredo XY ou um gráfico de deslocamento quadrado médio. A saída de nossa plataforma nos permite identificar ainda mais transições em traços de tempo de eficiência do FRET de sondas móveis. Por exemplo, avaliar mudanças conformais das biomoléculas.Usando um sensor de força baseado em FRET, a plataforma de análise nos permitiu quantificar eventos de força de molécula única dentro da sinapse imunológica durante a sinalização precoce de células T.

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Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Análise para SENP1 Determinação Cinética Protease

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Único Detecção de Moléculas livre-Label Usando Microtoroid ópticos Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Recuperação de fluorescência após a fusão uma gota de medir a difusão bidimensional de um Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automated Análise contração do Coração Humano engenharia de tecidos para Screening Cardiac Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...