Name: automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Эта работа была поддержана проектами Австрийского научного фонда (FWF) P30214-N36, P32307-B и Венским научно-техническим фондом (WWTF) LS13-030.

<ol>
	<li>McKinney, S. A., D&#233;clais, A. -. C., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+individual+holliday+junctions.">Structural dynamics of individual holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).</li><li>Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+potassium-channel+gating+revealed+by+single-molecule+FRET.">Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).</li><li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks.">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), 235 (2018).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).</li><li>Wu, P. G., Brand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonance+energy+transfer:+Methods+and+applications.">Resonance energy transfer: Methods and applications.</a> Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).</li><li>Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecular+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+measurement+on+structures+and+interactions+of+biomolecules.">Single-molecular f&#246;rster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules.</a> Micromachines. 12 (5), 492 (2021).</li><li>Malkusch, N., D&#246;rfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=smFRET+experiments+of+the+RNA+polymerase+II+transcription+initiation+complex.">smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex.</a> Methods. 120, 115-124 (2017).</li><li>Lee, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+views+of+MutS+on+mismatched+DNA.">Single-molecule views of MutS on mismatched DNA.</a> DNA repair. 20, 82-93 (2014).</li><li>Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microsecond+single-molecule+FRET+to+determine+the+assembly+pathways+of+T4+ssDNA+binding+protein+onto+model+DNA+replication+forks.">Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).</li><li>Deindl, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+conformational+dynamics+with+single-molecule+fluorescence+energy+transfer:+Applications+in+nucleosome+remodeling.">Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling.</a> Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).</li><li>Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+colocalization+FRET+evidence+that+spliceosome+activation+precedes+stable+approach+of+5'+splice+site+and+branch+site.">Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).</li><li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations.">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li><li>Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+kinesin+waits+between+steps.">How kinesin waits between steps.</a> Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).</li><li>G&#246;hring, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+analysis+of+T-cell+receptor-imposed+forces+via+quantitative+single+molecule+FRET+measurements.">Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements.</a> Nature Communications. 12 (1), 2502 (2021).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669 (2018).</li><li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-aided+molecule+sorting:+Analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li><li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells.">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).</li><li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules.">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).</li><li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation.">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li><li>Asher, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+imaging+of+GPCR+dimers+in+living+cells.">Single-molecule FRET imaging of GPCR dimers in living cells.</a> Nature Methods. 18 (4), 397-405 (2021).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy. (12), 1223-1237 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(excitation)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (excitation) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1189-1191 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(emission)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (emission) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1192-1194 (2012).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., van der Wel, C. M., Dimiduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft-matter/pims: PIMS v0.5. , (2020).</li><li>Anaconda Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Miniconda. , (2021).</li><li>conda-forge community. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The conda-forge project: community-based software distribution built on the conda package format and ecosystem. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> JupyterLab Contributors Notebooks - JupyterLab documentation. , (2021).</li><li>Babcock, H., Sigal, Y. M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-density+3D+localization+algorithm+for+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">A high-density 3D localization algorithm for stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Optical Nanoscopy. 1 (6), (2012).</li><li>Gao, Y., Kilfoil, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+detection+and+complete+tracking+of+large+populations+of+features+in+three+dimensions.">Accurate detection and complete tracking of large populations of features in three dimensions.</a> Optics Express. 17 (6), 4685 (2009).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> sdt-python: Python library for fluorescence microscopy data analysis (v17.1). , (2021).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nature Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li><li>Bradski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OpenCV+library.">The OpenCV library.</a> Dr. Dobb's Journal: Software Tools for the Professional Programmer. 25 (11), 120-123 (2000).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft-matter/trackpy:+Trackpy+v0.5.0.">Soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0.</a> Zenodo. , 4682814 (2021).</li><li>Killick, R., Fearnhead, P., Eckley, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+detection+of+changepoints+with+a+linear+computational+cost.">Optimal detection of changepoints with a linear computational cost.</a> Journal of the American Statistical Association. 107 (500), 1590-1598 (2012).</li><li>Schrangl, L., G&#246;hring, J., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+single+molecule+FRET+transitions+without+trajectories.">Kinetic analysis of single molecule FRET transitions without trajectories.</a> The Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123328 (2018).</li><li>Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+single-molecule+FRET+dynamics+with+probability+distribution+analysis.">Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis.</a> ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+analysis+software+(3.0).">Single-molecule FRET analysis software (3.0).</a> Zenodo. , (2021).</li><li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers.">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li><li>Platzer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unscrambling+fluorophore+blinking+for+comprehensive+cluster+detection+via+photoactivated+localization+microscopy.">Unscrambling fluorophore blinking for comprehensive cluster detection via photoactivated localization microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4993 (2020).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The molecular probes handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies. , (2010).</li><li>Szalai, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+energy+transfer+by+intensity-based+STED-FRET.">Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET.</a> Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+two-photon+probe+for+in+vivo+tracking+of+pH+during+a+traumatic+brain+injury+process.">A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process.</a> New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).</li></ol>

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

В этой статье подробно описывается конвейер для автоматизированных записей и количественного анализа данных smFRET, поступающих из мобильных, но поверхностно привязанных молекул зонда. Он дополняет два преобладающих подхода к экспериментам smFRET, включающие либо поверхностные иммобилизованные зонды, либо зонды, диффундирующие в растворе в конфокальный объем возбуждения и из него17. Он обеспечивает правильную эффективность FRET и молекулярные позиции в зависимости от времени. Поэтому он может быть использован в качестве входных данных для специализированных программ анализа, например, для количественной оценки кинетики перехода1, гистограмм FRET39 или двумерной диффузии22.
Программное обеспечение выпускается под свободной лицензией с открытым исходным кодом, одобренной Open Source Initiative, которая предоставляет пользователю бессрочное право на свободное использование, модификацию и распространение. Github был выбран в качестве платформы для разработки и распространения, чтобы максимально упростить получение программного обеспечения и участие в процессе разработки, сообщая об ошибках или внося код40. Написанное на Python, программное обеспечение не зависит от проприетарных компонентов. Выбор ноутбуков Jupyter в качестве пользовательских интерфейсов облегчает проверку данных на каждом этапе анализа и позволяет адаптировать и расширять конвейер специально для экспериментальной системы. Библиотека sdt-python32 служит основой и реализует функциональные возможности для оценки данных флуоресцентной микроскопии, таких как локализация одной молекулы, диффузионный анализ, анализ интенсивности флуоресценции, регистрация цветовых каналов, анализ колокализации и обработка ROI.
В принципе, отслеживание одиночных частиц может быть выполнено в одно-, двух- или трехмерных системах. Здесь конвейер одномолекулярного анализа был адаптирован для изучения 2D-мобильных систем. Этот выбор отражает доступность простых систем, таких как планарные липидные бислои (SLB), для представления мобильных флуоресцентных зондов. Такие липидные двухслойные системы обычно состоят из двух или более фрагментов фосфолипидов, где объемная фракция определяет ключевые физико-химические параметры SLB (такие как фаза и вязкость), а незначительная фракция обеспечивает места присоединения для биомолекул. Эти сайты прикрепления могут быть биотинилированными фосфолипидами для белковых платформ на основе авидина или стрептавидина или конъюгированными фосфолипидами никеля-NTA для белковых платформ с гистидиновыми метками41. Выбор подходящей платформы для связывания белков с SLB зависит от научного вопроса. Читатели могут обратиться к литературе16,38,42 для примеров успешно используемых стратегий. Плотность зондов в образце должна быть достаточно низкой, чтобы избежать перекрытия функций точечного распространения; как правило, рекомендуется менее 0,1 молекулы на мкм2. См. раздел репрезентативных результатов (в частности, рисунок 6) для примера, показывающего подходящую плотность зонда. Метод анализа также применим к одиночным флуоресцентно меченым белковым молекулам, диффундирующим в плазматической мембране живых клеток.
Одним из важнейших аспектов экспериментов smFRET является производство и характеристика самих зондов FRET. При выборе флуорофоров для пары FRET их радиус Förster должен соответствовать ожидаемым расстояниям между красителями43. Красители, устойчивые к фотоотбеливанию, являются предпочтительными, поскольку они дают длинные временные следы. Однако для повышенных скоростей обесцвечивания один вид флуорофоров может быть использован для распознавания мультиэмиттерных событий, происходящих из колокализованных молекул, с помощью ступенчатого анализа фотоотбеливания; см. шаг 8.1.4 в разделе протокола. Пары флуорофоров должны быть специфичными и ковалентно прикрепленными к интересующим молекулам, образуя внутри- или межмолекулярные пары FRET.
Сочетание smFRET с другими легкодоступными методами может увеличить его пространственное разрешение за пределы дифракции (через STED44). Представленный здесь алгоритм отслеживания smFRET расширяет применимость подхода к новым экспериментальным настройкам и модельным системам. Это включает в себя исследования (i) кинетических изменений в стехиометрии подвижных биомолекул, (ii) динамической ассоциации подвижных биомолекул, (iii) скорости ферментативных реакций свободно диффузных реагентов и (iv) кинетики конформационных изменений подвижных биомолекул. Первые два примера требуют модельных систем, которые показывают межмолекулярный FRET, т.е. донор и акцептор сопряжены с отдельными биомолекулярными объектами, представляющими интерес. В последних примерах могут использоваться биосенсоры, несущие донора и акцептора в пределах одного молекулярного объекта (внутримолекулярного ФРЕТа).
Внутримолекулярные датчики на основе ФРЕТа могут обеспечить понимание внутренних конформационных изменений биомолекул1,2,3,4, конформационных изменений, вызванных эндогенной или внешней силовой нагрузкой (датчики молекулярной силы16), или концентраций ионов в наносреде, таких как кальций45 и рН46 . В зависимости от модельной системы и предпочтительной анкерной платформы такие события smFRET могут быть отслежены в 2D или 3D: (i) планарное отслеживание событий smFRET может быть использовано для количественной оценки времени взаимодействия рецептор-лиганд в плазматической мембране, ассоциации каскадов усиления сигнала с мембранным креплением и стехиометрических изменений поверхностных рецепторов; (ii) объемное отслеживание событий smFRET может быть использовано для любых внутри- или межмолекулярных зондов FRET в живых клетках или в восстановленных системах in vitro.
Метод отслеживания smFRET был разработан в основном с учетом внутримолекулярных зондов FRET. Эти зонды имеют фиксированное и хорошо известное количество флуоресцентных меток, факт, который был использован для отклонения данных от агломерированных и неправильно синтезированных (например, неполностью меченых) молекул, а также от зондов, где один из флуорофоров был фотоотбелен. Однако, регулируя этапы фильтрации, метод также может быть применен к межмолекулярным датчикам FRET. Например, вместо того, чтобы принимать только молекулы с одним донором и одним акцепторным флуорофором, можно было бы изучить пространственные траектории донорских и акцепторных красителей и выбрать, например, для кодиффузных донор-акцепторных траекторий.
Поскольку алгоритм 3D-DAOSTORM поддерживает определение положения сигнала вдоль оптической оси с помощью астигматизма из-за цилиндрической линзы на пути излучения, 3D-эксперименты могут быть легко интегрированы в конвейер анализа. В этом случае акцепторный сигнал при возбуждении акцептора будет служить для определения стехиометрии и осевого положения. Аналитическое программное обеспечение также может быть использовано для оценки данных экспериментов с иммобилизованными зондами, используя его большую степень автоматизации и схем фильтрации. Фактически, наборы данных эффективности smFRET из переходов Холлидей, иммобилизованных на гелефазных бислоях38 , были проанализированы с использованием ранней версии программного обеспечения.

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) был основным драйвером в молекулярно-биологических и биофизических исследованиях, поскольку он позволяет исследовать процессы с субнанометровым разрешением. Поскольку эффективность передачи энергии между донорскими и акцепторными флуорофорами сильно зависит от межкрасильного расстояния в субнанометровом и нанометровом диапазоне, он был эффективно использован в качестве спектроскопической линейки для исследования статической и динамической конформации биомолекул1,2,3,4. Кроме того, феномен FRET широко используется для исследований колокализации мембраноассоциированных и внутриклеточных белков на объемном уровне5,6. В последние два десятилетия метод был адаптирован для мониторинга событий smFRET7, что помогло существенно увеличить временное и пространственное разрешение и разрешить даже редкие субпопуляции в гетерогенных образцах. Благодаря этим методам были получены уникальные сведения о динамике молекулярных механизмов, таких как скорость обработки транскриптов РНК-полимеразы II8, скорость репликации ДНК-полимераз9,10, скорость транслокации нуклеосом11, скорость сплайсинга и сваливания транскриптов собранных сплайсеосом12, активность рибосомных субпопуляций13 и скорость ходьбы кинезиновых двигателей14 , и это лишь некоторые из них. Определены длительности взаимодействия рецептор-лиганд15 и молекулярные силы16.
Исследования smFRET на основе интенсивности обычно полагаются на сенсибилизированное излучение для измерения эффективности FRET: делитель пучка в пути излучения пространственно разделяет свет, исходящий от донорских и акцепторных флуорофоров при возбуждении донора, что позволяет количественно оценить индивидуальные интенсивности флуоресценции. Эффективность впоследствии может быть рассчитана как доля фотонов, испускаемых акцептором, по отношению к общему количеству фотонов17. Кроме того, акцепторное возбуждение после донорского возбуждения (ALEX) позволяет измерять стехиометрию событий FRET, помогая в различении истинных сигналов низкого FRET от сигналов, возникающих, например, от зондов с фотоотбеленным акцепторным флуорофором18.
Одномолекулярные эксперименты с FRET обычно проводятся одним из двух способов. Во-первых, небольшая область в объеме образца освещается с помощью конфокального микроскопа. Одиночные молекулы зонда в растворе возбуждаются, когда они диффундируют в фокальном объеме. С помощью этого метода можно использовать детекторы быстрого подсчета фотонов, что обеспечивает разрешение времени менее микросекунды. Во-вторых, зонды специально иммобилизуются на поверхностях и контролируются с помощью широкоугольной микроскопии, часто с использованием конфигурации полного внутреннего отражения (TIR) для минимизации фоновой флуоресценции. Иммобилизация зонда позволяет гораздо дольше регистрировать время, чем при первом подходе. Кроме того, большее поле зрения позволяет параллельно контролировать несколько зондов. Необходимость в камере делает этот метод медленным по сравнению с описанным выше. Временное разрешение ограничено миллисекундой до второго диапазона.
Если требуются длинные временные следы, например, для изучения динамических процессов в масштабе от миллисекунды до второй времени, первый метод неприменим, так как флуоресцентные всплески обычно слишком короткие. Второй подход терпит неудачу всякий раз, когда иммобилизация невозможна, например, в экспериментах с живыми клетками с зондами, диффундирующими внутри клеточной мембраны. Кроме того, было замечено, что биологические модельные системы могут резко варьировать свою реакцию в зависимости от подвижности контактируемой поверхности16.
Хотя в прошлом19 года проводились комбинированные эксперименты по отслеживанию smFRET и одиночных частиц, записывающие мобильные зонды FRET, общедоступного программного обеспечения для оценки данных не существует. Это побудило к разработке новой аналитической платформы, которая позволяет определять множественные свойства мобильных флуоресцентных зондов, включая эффективность smFRET и стехиометрию, положения с субпиксельной точностью и интенсивность флуоресценции как функции времени. Были установлены методы фильтрации полученных следов путем изучения поведения ступенчатого обесцвечивания, расстояний ближайших соседей, интенсивности излучения и других признаков исключительно для выбора правильно синтезированных и функциональных однозондовых молекул. Программное обеспечение также поддерживает экспериментальные и аналитические методы, недавно согласованные в многолабораторном исследовании для получения надежных количественных данных smFRET17. В частности, реализация придерживается валидированных процедур расчета эффективности FRET и стехиометрии. Интенсивности флуоресценции при возбуждении донора в донорском эмиссионном канале IDD и акцепторном эмиссионном канале IDA используются для расчета кажущейся эффективности FRET Eapp с использованием Eq (1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg"> (1)
С помощью интенсивности флуоресценции в канале излучения акцептора при акцепторном возбуждении IAA кажущаяся стехиометрия рассчитывается с использованием Eq (2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg"> (2)
Эффективность FRET E и стехиометрия S могут быть получены из Eapp и Sapp путем рассмотрения четырех поправочных коэффициентов.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg">
α описывает утечку донорской флуоресценции в акцепторный эмиссионный канал и может быть определен с использованием образца, содержащего только донорские флуорофоры, или путем анализа участков траекторий, где акцептор был обесцвечен. δ корректирует прямое возбуждение акцептора источником света возбуждения донора и может быть измерено с использованием образца только с акцепторными флуорофорами или путем анализа участков траекторий, где донор был отбелен.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg">.
γ масштабирует IDD для устранения различий в эффективности обнаружения доноров и акцепторных эмиссионных каналов и различной квантовой эффективности флуорофоров. Коэффициент может быть рассчитан путем анализа увеличения интенсивности донорства при акцепторном отбеливании по траекториям с высокой эффективностью FRET20 или путем изучения образца с несколькими дискретными состояниями FRET.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg">
β шкалирует IAA для коррекции разрозненной эффективности возбуждения донора и акцептора. Если γ определяли с помощью акцепторного отбеливания, β можно было бы рассчитать по выборке известного соотношения донора к акцептору21. В противном случае многоштатный образец FRET также дает β.
Вместе эти поправки позволяют рассчитать скорректированную эффективность FRET с использованием Eq (3).
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg"> (3)
и скорректированная стехиометрия с использованием Eq (4).
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg"> (4)
В идеале скорректированная стехиометрия для соотношения донор/акцептор 1:1 дает S = 0,5. На практике пониженное отношение сигнал/шум приводит к распространению измеренных значений S, препятствуя дискриминации по сигналам только донора (S = 1) и сигналам только акцептора (S = 0). Полученные временные следы могут быть использованы в качестве входных данных для более детального анализа траекторий одной молекулы для получения такой информации, как профили пространственно-временных сил16, подвижность одномолекулярных событий22 или кинетика перехода между различными состояниями1.
Следующий протокол описывает экспериментальные параметры и процедуры для экспериментов по отслеживанию smFRET, а также принцип работы анализа данных с использованием недавно разработанного пакета программного обеспечения. Для получения экспериментальных данных рекомендуется использовать микроскопическую установку, отвечающую следующим требованиям: i) способность обнаруживать эмиссию одиночных молекул красителя; ii) широкоугольное освещение: в частности, для экспериментов с живыми клетками рекомендуется конфигурация полного внутреннего отражения (TIR23,24,25); iii) пространственное разделение излучения света по длине волны таким образом, что донорная и акцепторная флуоресценция проецируется на разные области одного и того же чипа камеры25 или разных камер; iv) модуляция источников света для донорского и акцепторного возбуждения с миллисекундной точностью, например, с использованием непосредственно модулируемых лазеров или модуляция с помощью акустооптических модуляторов. Это позволяет стробоскопическому освещению свести к минимуму фотоотбеливание флуорофоров, а также попеременное возбуждение для определения стехиометрий; v) вывод одного файла на записанную последовательность изображений в формате, который может быть прочитан пакетом PIMS Python26. В частности, поддерживаются многостраничные TIFF-файлы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790404P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945; Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1084-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer microscope body</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET570/60m</td>
			<td>donor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET675/50m</td>
			<td>acceptor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conda-forge</td>
			<td>conda-forge community</td>
			<td></td>
			<td>community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td>
			<td>MENZEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>FF640-FDi01-25&#215;36</td>
			<td>separation of donor and acceptor emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (quad band)</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>Di01-R405/488/532/635-25&#215;36</td>
			<td>separation of excitation and emission light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fret-analysis</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python package for smFRET data analysis; version 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11524766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBeam Smart 405-S 405 nm laser</td>
			<td>Toptica Photonics AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek chambers (8 wells)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177402PK</td>
			<td>for sample preparation and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenia Prime 532 nm laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniconda</td>
			<td>Anaconda Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Python 3 distribution. Min. version: 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20860 &#38; 20859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBIS 640 nm laser</td>
			<td>Coherent Inc</td>
			<td>1185055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optosplit II</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5253</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sdt-python</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python library for data analysis; version 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpek bead size kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T14792</td>
			<td>Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USC500TH Ultrasound bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>for SUV formation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes

Одномолекулярный резонансный перенос энергии Фёрстера (smFRET) является универсальным методом, сообщающим о расстояниях в диапазоне от субнанометра до нанометра. Он был использован в широком спектре биофизических и молекулярно-биологических экспериментов, включая измерение молекулярных сил, характеристику конформационной динамики биомолекул, наблюдение внутриклеточной колокализации белков и определение времени взаимодействия рецептор-лиганд. В конфигурации широкоугольной микроскопии эксперименты обычно проводятся с использованием поверхностных иммобилизованных зондов. Здесь представлен метод, сочетающий отслеживание одной молекулы с экспериментами с переменным возбуждением (ALEX) smFRET, позволяющий получать следы времени smFRET поверхностных, но мобильных зондов в плазматических мембранах или липидных бислоях со стеклянной поддержкой. Для анализа записанных данных был разработан автоматизированный сбор программного обеспечения с открытым исходным кодом, поддерживающий (i) локализацию флуоресцентных сигналов, (ii) отслеживание одиночных частиц, (iii) определение величин, связанных с FRET, включая поправочные коэффициенты, (iv) строгую проверку следов smFRET и (v) интуитивное представление результатов. Сгенерированные данные могут быть удобно использованы в качестве входных данных для дальнейшего исследования с помощью специализированного программного обеспечения, например, для оценки диффузионного поведения зондов или исследования переходов FRET.

Из треков smFRET можно извлечь различную низко- и высокоуровневую информацию в зависимости от научного вопроса эксперимента. Здесь представлены примеры конвейеров анализа с аналоговыми и цифровыми зондами: пептидный датчик молекулярной силы16 и ДНК-зонд со стохастическим переключением его конформации38 соответственно. Обратитесь к рисунку 5 для определения конструкции и принципа работы этих датчиков.
После того, как алгоритмы локализации и отслеживания были выполнены, как описано в протоколе, пакет предлагает несколько инструментов визуализации данных для оптимизации начальных параметров и последующих этапов фильтрации: (i) визуализация отдельных событий smFRET, (ii) дополнительная сегментация изображений для анализа данных в определенных областях интересов, (iii) мониторинг шагов фильтра с помощью графиков эффективности FRET и стехиометрии (E-S). Визуализация одномолекулярных данных представлена на рисунке 6.
Наконец, отфильтрованные события FRET представлены графиком E-S и гистограммой эффективности FRET (рисунок 4). График E-S является полезным инструментом для оптимизации вышеупомянутых шагов фильтрации и исследования конечного результата. Частично отбеленные или неполностью маркированные датчики FRET могут быть исключены по их стехиометрическому значению. Параметры подвижности могут быть исследованы путем построения индивидуального траекторионного пути на графике x-y (рисунок 6) или графике среднего квадратного смещения (MSD) (рисунок 4). Первый метод особенно полезен для различения мобильных и иммобилизованных событий, в то время как последний используется для расчета коэффициента диффузии.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> Рисунок 4: Примерный результат. (A) Эффективность FRET строится по сравнению со стехиометрией (график E-S) для популяции датчика молекулярной силы (левая панель), украшающего липидный бислой со стеклянной поддержкой и напряженного Т-клеткой. Видно только одно облако населения. Соответствующая гистограмма эффективности FRET иллюстрирует разницу между популяцией датчика силы при наличии и отсутствием клеток (средняя панель). Не наблюдается сдвига в сторону снижения эффективности FRET популяции датчиков в присутствии Т-клеток, что указывает на незначительное или полное отсутствие силозависимого растяжения сенсорного модуля. График MSD этих экспериментальных условий подтверждает, что популяция датчиков силы под Т-клеткой движется значительно медленнее, чем их несвязанные аналоги (правая панель). (B) Тот же анализ проводился с помощью датчика ДНК соединения Холлидей, украшающего поддерживаемый стеклом жидкий липидный бислой. График E-S четко показывает две популяции, которые также очевидны в гистограмме эффективности FRET. График MSD указывает на наличие одной быстро движущейся популяции датчиков. Сокращения: FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера; MSD = среднее квадратное смещение. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> Рисунок 5: Конструкция и принцип работы внутримолекулярных датчиков FRET. (A) Аналоговый пептидный датчик для количественной оценки механических молекулярных сил. Донорский и акцепторный флуорофоры ковалентно прикреплены к обоим концам пептидной основы. Сенсорный модуль является сайт-специфически прикрепленным к определенному лиганду, который, в свою очередь, связывает интересующий рецептор клеточной резидентной поверхности (здесь фрагмент антитела, специфически распознающий бета-цепь рецептора Т-клеток). При связывании рецептор-лиганд оказывается сила, и сенсорный модуль расширяется и в конечном итоге откатывается после расщепления связи. Эта панель изменена с 16. (B) Цифровой датчик ДНК для количественной оценки переходов FRET. Датчик FRET состоит из четырех нитей ДНК, образующих соединение Холлидей. Донор и акцепторный флуорофор ковалентно прикреплены к двум нитям. Соединения Холлидей часто меняют свою конформацию в зависимости от окружающих буферных условий. Стохастическое переключение этих конформаций можно контролировать путем количественной оценки эффективности FRET отдельных зондов. Сокращения: TCR = Т-клеточный рецептор; FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> Рисунок 6: Примеры локализации и отслеживания зондов FRET. (A) Эффективность FRET и стехиометрия отдельных событий рассчитываются путем количественной оценки интенсивности донорского флуорофора при возбуждении донора (D → D), акцепторного флуорофора при возбуждении донора (D → A) и акцепторного флуорофора при акцепторном возбуждении (A → A). Фильтрация ближайших соседей предотвращает смещение за счет перекрытия функций точечного распространения близких излучателей. Сегментация изображений позволяет пользователю выбирать определенные события smFRET, локализованные в интересующей области (например, ячейка или микрошаблон). В качестве примера сегментации изображения Т-клетки окрашивали Fura-2 (отображается слева) и подвергали адаптивному пороговому значению для идентификации краев клеток (оранжевая пунктирная линия). Шкала баров = 5 мкм. (B) траекторий smFRET с использованием датчика молекулярной силы. Отдельные траектории могут быть построены в плоскости x-y , визуализируя их диффузионное поведение и локализацию (левая панель). Кроме того, интенсивность каждой траектории может быть построена с течением времени для идентификации переходов FRET или этапов отбеливания (средняя панель показывает красную траекторию с левой панели). Результирующая эффективность FRET и стехиометрия могут быть визуализированы аналогично (правая панель). (C) траектории smFRET с использованием датчика ДНК соединения Холлидей. HBSS + 12 мМ MgCl2 использовался в качестве буфера во время измерений. Помимо очевидной стадии отбеливания акцептора в конце последовательности этих примеров, может быть определена частота переходов FRET для каждого датчика. Переходы Холлидей переключают свою конформацию с высокой частотой, тогда как датчик молекулярной силы не демонстрирует переходов FRET. Эта информация позволяет корректировать экспериментальные условия, такие как задержка между кадрами, увеличивать или уменьшать количество наблюдаемых переходов. Сокращения: FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера; smFRET = одномолекулярный ЛАД; HBSS = сбалансированный солевой раствор Хэнка. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительная информация: Локализация и отслеживание отдельных молекул (01. Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

В данной статье представлен метод пространственно-временного анализа подвижных одномолекулярных зондов на основе резонансного переноса энергии Фёрстера (smFRET) с использованием широкоугольной флуоресцентной микроскопии. Недавно разработанный программный инструментарий позволяет определять следы времени smFRET движущихся зондов, включая правильную эффективность FRET и молекулярные положения, как функции времени.

Автоматизированный двумерный пространственно-временный анализ мобильных одномолекулярных зондов FRET

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Одномолекулярные эксперименты FRET с использованием поверхностных зондов в прошлом проводились почти исключительно на обездвиженных молекулах. Тем не менее, многие биомолекулы диффундируют и могут быть проанализированы с помощью нашего метода. Сочетание одномолекулярного FRET с отслеживанием позволяет анализировать не только следы времени дефицита FRET движущихся зондов, но и исследовать пространственно-временные аспекты, такие как диффузионное поведение.Наш метод совместим с различными зондами на основе FRET. Например, он может дать представление о молекулярных силах, конформационной динамике и кинетике связывания в экспериментах с живыми клетками. Высококачественные одномолекулярные эксперименты с FRET, как известно, трудно выполнить.Для надежной количественной оценки важно записывать данные с хорошим соотношением сигнал/шум и одномолекулярными треками достаточной длины. Чтобы начать измерение образца, возбуждайте фторофоры донора и акцептора в течение соответствующего времени освещения при срабатывании камеры и дождитесь включения считывания показаний камеры. Повторите возбуждение донорских и акцепторных флуорофоров альтернативно.Выберите количество повторов, которое должно быть достаточно большим, чтобы обеспечить фотоотбеливание по крайней мере одного флуорофора на зонд в поле зрения, позволяя проводить ступенчатый анализ фотоотбеливания для различения одномолекулярных сигналов от агрегатов. Укажите последовательность освещения, чтобы разрешить выбор кадров возбуждения донора и акцептора, а также кадров для сегментации изображения из записанных последовательностей изображений. Одновременно анализируйте записанные наборы данных, используя одни и те же настройки освещения.С этой целью назначьте идентификатор и шаблон, которые соответствуют соответствующим именам файлов последовательности изображений для каждого набора данных. Кроме того, определите конкретные наборы данных для специальных целей, таких как записи фидуциальных маркеров для регистрации изображений, световые профили возбуждения для коррекции плоского поля и, при необходимости, образцы только для доноров и только для акцепторов для определения поправочных коэффициентов. Затем выберите каналы излучения и необработанные изображения, если оба канала записаны с помощью одной камеры.Для этого используйте соответствующий графический виджет для выбора подходящих регионов для донорской и акцепторной эмиссии, затем локализуйте фидуциальные маркеры в обоих каналах излучения и выполняйте регистрацию изображений. Используйте предоставленный пользовательский интерфейс для поиска подходящих параметров для алгоритма локализации как для донорских, так и для акцепторных эмиссионных каналов. Далее задают параметры одномолекулярной локализации для зондов FRET при возбуждении донора в сумме изображений, полученных от донорского и акцепторного излучения, затем задают параметры локализации для зондов при акцепторном возбуждении в акцепторном эмиссионном канале.Локализуйте зонды FRET при донорском и акцепторном возбуждении независимо во всех кадрах. Результаты объединяются в одну таблицу, содержащую исходный номер кадра, двумерные координаты и идентификатор, относящийся к файлу исходного изображения. Для отслеживания и измерения интенсивности флуоресценции выберите соответствующие параметры алгоритма Trackpy для связывания локализаций зонда FRET с траекториями.Затем, используя функциональность программного обеспечения для анализа, обрабатывайте вспомогательные данные изображений из последовательностей изображений. Извлеките дополнительные изображения, записанные для облегчения сегментации, отмеченной S в последовательности возбуждения. Наконец, определите световые профили донора и акцептора возбуждения по всему полю зрения по изображениям, записанным на плотно меченом образце.На начальных этапах фильтрации отбрасывайте сигналы с перекрывающимися функциями точечного распространения, так как трудно надежно определить их интенсивность флуоресценции. В случае неоднородного освещения принимайте только сигналы, расположенные в хорошо освещенных областях в поле зрения, чтобы обеспечить хорошее соотношение сигнал/шум. При изучении внутримолекулярного ФРЕТа ограничьте анализ теми траекториями, которые присутствуют с начала последовательности изображения.Затем выполните коррекцию плоского поля, которая использует полученные ранее профили источников света возбуждения, чтобы обратить вспять зависящие от положения изменения интенсивности флуоресценции, вызванные неоднородным освещением, а затем вычислить кажущуюся эффективность FRET и кажущуюся стехиометрию. Для выполнения пошагового анализа фотоотбеливания для различения одиночных молекулярных зондов и агрегатов найти соответствующие параметры алгоритма обнаружения точки изменения при возбуждении донора и акцептора независимо друг от друга. Затем выполните алгоритм обнаружения точки изменения.Чтобы удалить дорожку, показывающую неоднозначное поведение фотоотбеливания, определите пороговые значения интенсивности, ниже которых флуорофор считается обесцвеченным, а затем выберите один из следующих вариантов. Вариант первый, в котором акцептор флуорофор отбеливается за один шаг, в то время как донор не показывает частичного отбеливания. Вариант второй, в котором донор отбеливает в один этап, пока нет частичного акцепторного отбеливания.Вариант третий, в котором один флуорофор отбеливает за один шаг, в то время как другой не отбеливает частично. И вариант четвертый, в котором донорские и акцепторные флуорофоры показывают одноступенчатое фотоотбеливание или отсутствие фотоотбеливания вообще. Затем рассчитайте поправочные коэффициенты утечки донорского излучения в акцепторный канал, прямого возбуждения акцептора, эффективности обнаружения и эффективности возбуждения.Затем используйте поправочные коэффициенты для расчета эффективности FRET из кажущейся эффективности и стехиометрии из видимой стехиометрии. Для дальнейшей фильтрации выберите только точки данных до первого события обесцвечивания в каждой траектории. Кроме того, чтобы ограничить анализ одномолекулярными зондами, принимайте только траектории с не менее 75% точек данных в соответствующих пределах стехиометрии.Затем выполните сегментацию изображений с помощью глобальных или адаптивных методов пороговых значений на соответствующих вспомогательных изображениях, чтобы ограничить анализ отдельными областями в поле зрения. Создайте графики эффективности и стехиометрии, чтобы убедиться, что сигналы неправильной стехиометрии были правильно идентифицированы и удалены. Затем постройте гистограммы эффективности FRET, чтобы обеспечить хорошо установленный обзор распределений эффективности FRET и сгруппируйте гистограммы для удобного сравнения результатов различных экспериментов.Используя преимущества научных библиотек Python, можно дополнительно оценивать данные в записной книжке, выполняя, например, диффузионный анализ. Визуализация и отслеживание одномолекулярного события FRET показаны здесь. Отфильтрованные события FRET представлены графиками эффективности и стехиометрии в гистограмме эффективности FRET.Кроме того, параметры подвижности могут быть исследованы путем построения индивидуального траекторионного пути на графике XY или графике среднего квадратного смещения. Выход нашей платформы позволяет нам дополнительно идентифицировать переходы во времени эффективности FRET следов мобильных зондов. Например, оценить конформационные изменения биомолекул.Используя датчик силы на основе FRET, аналитическая платформа позволила нам количественно оценить одномолекулярные силовые события в иммунологическом синапсе во время ранней передачи сигналов Т-клетками.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Создание двумерных рисунком Подложки для конфайнмента белков и клеточных

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Мультиплексный одиночных молекул группы Протеолиз измерений с использованием магнитных пинцет

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Количественные FRET (Ферстер резонансный перенос энергии) анализ для определения протеазы SENP1 кинетики

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Высокое разрешение Пространственно-временная Анализ рецептора Dynamics по одиночных молекул флуоресцентной микроскопии

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Одной молекулы флуоресцентной микроскопии на Planar Поддерживаемые Бислои

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Этикетка без одной молекулы обнаружения, используя Microtoroid оптических резонаторов

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Чувствительный Обнаружение Proteopathic посев деятельности с FRET проточной цитометрии

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Флуоресценции Восстановление после Слияние капли измерить двумерной диффузии фосфолипидов монослоя

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Автоматизированный анализ Сужение человеческого Engineered ткани сердца для скрининга сердца безопасности лекарственных средств

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...