Name: automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av den österrikiska vetenskapsfondens (FWF) projekt P30214-N36, P32307-B och av Wiens vetenskaps- och teknikfond (WWTF) LS13-030.

<ol>
	<li>McKinney, S. A., D&#233;clais, A. -. C., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+individual+holliday+junctions.">Structural dynamics of individual holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).</li><li>Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+potassium-channel+gating+revealed+by+single-molecule+FRET.">Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).</li><li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks.">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), 235 (2018).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).</li><li>Wu, P. G., Brand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonance+energy+transfer:+Methods+and+applications.">Resonance energy transfer: Methods and applications.</a> Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).</li><li>Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecular+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+measurement+on+structures+and+interactions+of+biomolecules.">Single-molecular f&#246;rster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules.</a> Micromachines. 12 (5), 492 (2021).</li><li>Malkusch, N., D&#246;rfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=smFRET+experiments+of+the+RNA+polymerase+II+transcription+initiation+complex.">smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex.</a> Methods. 120, 115-124 (2017).</li><li>Lee, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+views+of+MutS+on+mismatched+DNA.">Single-molecule views of MutS on mismatched DNA.</a> DNA repair. 20, 82-93 (2014).</li><li>Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microsecond+single-molecule+FRET+to+determine+the+assembly+pathways+of+T4+ssDNA+binding+protein+onto+model+DNA+replication+forks.">Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).</li><li>Deindl, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+conformational+dynamics+with+single-molecule+fluorescence+energy+transfer:+Applications+in+nucleosome+remodeling.">Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling.</a> Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).</li><li>Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+colocalization+FRET+evidence+that+spliceosome+activation+precedes+stable+approach+of+5'+splice+site+and+branch+site.">Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).</li><li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations.">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li><li>Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+kinesin+waits+between+steps.">How kinesin waits between steps.</a> Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).</li><li>G&#246;hring, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+analysis+of+T-cell+receptor-imposed+forces+via+quantitative+single+molecule+FRET+measurements.">Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements.</a> Nature Communications. 12 (1), 2502 (2021).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669 (2018).</li><li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-aided+molecule+sorting:+Analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li><li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells.">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).</li><li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules.">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).</li><li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation.">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li><li>Asher, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+imaging+of+GPCR+dimers+in+living+cells.">Single-molecule FRET imaging of GPCR dimers in living cells.</a> Nature Methods. 18 (4), 397-405 (2021).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy. (12), 1223-1237 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(excitation)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (excitation) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1189-1191 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(emission)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (emission) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1192-1194 (2012).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., van der Wel, C. M., Dimiduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft-matter/pims: PIMS v0.5. , (2020).</li><li>Anaconda Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Miniconda. , (2021).</li><li>conda-forge community. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The conda-forge project: community-based software distribution built on the conda package format and ecosystem. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> JupyterLab Contributors Notebooks - JupyterLab documentation. , (2021).</li><li>Babcock, H., Sigal, Y. M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-density+3D+localization+algorithm+for+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">A high-density 3D localization algorithm for stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Optical Nanoscopy. 1 (6), (2012).</li><li>Gao, Y., Kilfoil, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+detection+and+complete+tracking+of+large+populations+of+features+in+three+dimensions.">Accurate detection and complete tracking of large populations of features in three dimensions.</a> Optics Express. 17 (6), 4685 (2009).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> sdt-python: Python library for fluorescence microscopy data analysis (v17.1). , (2021).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nature Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li><li>Bradski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OpenCV+library.">The OpenCV library.</a> Dr. Dobb's Journal: Software Tools for the Professional Programmer. 25 (11), 120-123 (2000).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft-matter/trackpy:+Trackpy+v0.5.0.">Soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0.</a> Zenodo. , 4682814 (2021).</li><li>Killick, R., Fearnhead, P., Eckley, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+detection+of+changepoints+with+a+linear+computational+cost.">Optimal detection of changepoints with a linear computational cost.</a> Journal of the American Statistical Association. 107 (500), 1590-1598 (2012).</li><li>Schrangl, L., G&#246;hring, J., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+single+molecule+FRET+transitions+without+trajectories.">Kinetic analysis of single molecule FRET transitions without trajectories.</a> The Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123328 (2018).</li><li>Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+single-molecule+FRET+dynamics+with+probability+distribution+analysis.">Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis.</a> ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+analysis+software+(3.0).">Single-molecule FRET analysis software (3.0).</a> Zenodo. , (2021).</li><li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers.">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li><li>Platzer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unscrambling+fluorophore+blinking+for+comprehensive+cluster+detection+via+photoactivated+localization+microscopy.">Unscrambling fluorophore blinking for comprehensive cluster detection via photoactivated localization microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4993 (2020).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The molecular probes handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies. , (2010).</li><li>Szalai, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+energy+transfer+by+intensity-based+STED-FRET.">Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET.</a> Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+two-photon+probe+for+in+vivo+tracking+of+pH+during+a+traumatic+brain+injury+process.">A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process.</a> New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).</li></ol>

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Den här artikeln beskriver en pipeline för automatiserade inspelningar och kvantitativ analys av smFRET-data som härrör från mobila men ändå ytbundna sondmolekyler. Det kompletterar de två dominerande metoderna för smFRET-experiment, som involverar antingen yto immobiliserade sonder eller sonder som sprider sig i lösning till och från en konfokal excitationsvolym17. Det ger rätt FRET-effektivitet och de molekylära positionerna som en funktion av tiden. Det kan därför användas som indata för specialiserade analysprogram, t.ex. för att kvantifiera övergångskinetik1, FRET histogram39 eller tvådimensionell diffusion22.
Programvaran släpps under en gratis licens med öppen källkod som godkänts av Open Source Initiative som ger användaren evig rätt till gratis användning, modifiering och omfördelning. Github valdes som en utvecklings- och distributionsplattform för att göra det så enkelt som möjligt att få programvaran och delta i utvecklingsprocessen genom att rapportera buggar eller bidra med code40. Skriven i Python är programvaran inte beroende av proprietära komponenter. Valet av Jupyter-bärbara datorer som användargränssnitt underlättar inspektionen av data vid varje analyssteg och gör det möjligt att skräddarsy och utöka rörledningen specifikt för det experimentella systemet. Sdt-python-biblioteket32 fungerar som grund och implementerar funktionalitet för att utvärdera fluorescensmikroskopidata, såsom enmolekylslokalisering, diffusionsanalys, fluorescensintensitetsanalys, färgkanalregistrering, colocalization-analys och ROI-hantering.
I princip kan enpartikelspårning utföras i ett-, två- eller tredimensionella system. Här var enmolekylanalyspipelinen skräddarsydd för studien av 2D-mobila system. Detta val speglar tillgängligheten av enkla system, till exempel planastödda lipidbilayers (SLB), för att presentera mobila fluorescerande sonder. Sådana lipidbilayersystem består vanligtvis av två eller flera fosfolipider, där bulkfraktionen bestämmer de viktigaste fysikalisk-kemiska parametrarna för SLB (såsom fas och viskositet), och den mindre fraktionen tillhandahåller fästpunkter för biomolekyler. Dessa fästplatser kan vara biotinylerade fosfolipider för avidin- eller streptavidinbaserade proteinplattformar eller nickel-NTA konjugerade fosfolipider för proteinplattformar med histidintaggar41. Valet av lämplig plattform för att koppla proteiner till SLB beror på den vetenskapliga frågan. Läsare kan hänvisa till litteraturen16,38,42 för exempel på framgångsrikt använda strategier. Tätheten av sonder i provet bör vara tillräckligt låg för att undvika överlappande punktspridningsfunktioner. vanligtvis rekommenderas mindre än 0,1 molekyler per μm2. Se avsnittet representativa resultat (särskilt figur 6) för ett exempel som visar en lämplig sondtäthet. Analysmetoden är också tillämplig på enstaka fluorescerande märkta proteinmolekyler som sprids i plasmamembranet i levande celler.
En kritisk aspekt av smFRET-experiment är produktionen och karakteriseringen av FRET-sonderna själva. När du väljer fluoroforer för ett FRET-par bör deras Förster-radie matcha de förväntade interfärgavstånden43. Färgämnen som är resistenta mot fotobleaching föredras eftersom de ger långa tidsspår. För förhöjda blekningshastigheter kan dock en fluoroforart användas för att känna igen multiemitterhändelser som härrör från colocalized molekyler via stegvis fotobleaching analys; se steg 8.1.4 i protokollavsnittet. Fluoroforpar bör vara plats-specifikt och kovalent fästas på molekyler av intresse, bilda intra- eller intermolekylära FRET-par.
Att kombinera smFRET med andra lättillgängliga tekniker kan öka dess rumsliga upplösning utöver diffraktionsgränsen (via STED44). SmFRET-spårningsalgoritmen som presenteras här breddar metodens tillämplighet på nya experimentella inställningar och modellsystem. Detta inbegriper studier av i) kinetiska förändringar i stökiometrin hos mobila biomolekyler, ii) dynamisk associering av mobila biomolekyler, iii) frekvensen av enzymatiska reaktioner hos fritt diffusa reaktanter och iv) kinetiken för konformationella förändringar av mobila biomolekyler. De två första exemplen kräver modellsystem som visar intermolecular FRET, dvs. givare och acceptor konjugeras till separata biomolekylära enheter av intresse. De senare exemplen kan använda biosensorer som bär givare och acceptor inom samma molekylära enhet (intramolekylär FRET).
Intramolekylära FRET-baserade sensorer kan ge insikt i inneboende konformationella förändringar av biomolekyler1,2,3,4, konformationella förändringar orsakade av endogen eller extern kraftbelastning (molekylär kraftsensorer16) eller jonkoncentrationer i nanomiljön som kalcium45 och pH46 . Beroende på modellsystemet och den föredragna förankringsplattformen kan sådana smFRET-händelser antingen spåras i 2D eller 3D: (i) plana spårning av smFRET-händelser kan användas för kvantifiering av receptor-ligand interaktionstider inom ett plasmamembran, associering av membranförankrade signalförstärkningskaskader och stoichiometriförändringar av ytreceptorer; ii) Volymspårning av smFRET-händelser kan användas för alla intra- eller intermolekylära FRET-sonder i levande celler eller in vitro-rekonstituerade system.
SmFRET spårningsmetoden utvecklades främst med intramolekylära FRET-sonder i åtanke. Dessa sonder har ett fast och välkänt antal fluorescerande etiketter, ett faktum som utnyttjades för att avvisa data från agglomererade och felaktigt syntetiserade (t.ex. ofullständigt märkta) molekyler, liksom från sonder där en av fluoroforerna har fotobleachats. Men genom att justera filtreringsstegen kan metoden också tillämpas på intermolekylära FRET-sonder. Till exempel, i stället för att bara acceptera molekyler med en enda donator och en enda acceptor fluorofor, skulle man kunna undersöka de rumsliga banorna för donator- och acceptorfärgämnen och välja till exempel för samspridande donator-acceptorbanor.
Eftersom 3D-DAOSTORM-algoritmen har stöd för att bestämma en signals position längs den optiska axeln via astigmatismen på grund av en cylindrisk lins i emissionsstrålebanan, kan 3D-experiment enkelt integreras i analyspipelinen. I detta fall skulle acceptorsignalen vid acceptor excitation tjäna till att bestämma stökiometrin och axiell position. Analysprogramvaran kan också användas för att utvärdera data från experiment med immobiliserade sonder genom att använda sin stora grad av automatiserings- och filtreringsscheman. Faktum är att smFRET effektivitets datamängder från Holliday korsningar immobiliserade på gel-fas bilayers38 analyserades med hjälp av en tidig version av programvaran.

Förster resonans energiöverföring (FRET) har varit en viktig drivkraft i molekylär biologisk och biofysisk forskning, eftersom det möjliggör undersökning av processer vid sub-nanometer upplösning. Eftersom effektiviteten i energiöverföringen mellan donator- och acceptorfluoforer starkt beror på interfärgningsavståndet i subnanorometern till nanometerområdet, har den effektivt använts som spektroskopisk linjal för att utforska statisk och dynamisk konformation av biomolekyler1,2,3,4. Dessutom har FRET-fenomenet använts i stor utsträckning för colocalization studier av membranassocierade och intracellulära proteiner på en bulknivå5,6. Under de senaste två decennierna har metoden anpassats för övervakning av smFRET-händelser7, vilket bidrog till att avsevärt öka tidsmässiga och rumsliga upplösningen och löste även sällsynta subpopulationer i heterogena prover. Utrustad med dessa tekniker fick unika insikter om dynamiken i molekylära maskiner som transkriptionsbehandlingshastigheten för RNA-polymeras II8, replikeringshastighet för DNA-polymeraser9,10, nukleosomflyttningshastighet11, transkripteringssplissering och stallningsgrad för monterade splitsosomer12, aktiviteten hos ribosomala subpopulationer13 och gåhastigheten hos kinesinmotorer14 , för att nämna några. Receptor-ligand interaktion varaktigheter15 och molekylära krafter16 har kvantifierats.
Intensitetsbaserade smFRET-studier förlitar sig vanligtvis på sensibiliserade utsläpp för att mäta FRET-effektivitet: en stråldelare i emissionsbanan separerar rumsligt ljus som härrör från givaren och acceptor fluoroforer på givarens excitation, vilket möjliggör kvantifiering av individuell fluorescensintensiteter. Effektiviteten kan därefter beräknas som den del av fotoner som avges av acceptorn med avseende på det totala fotonantalet17. Dessutom tillåter acceptor excitation efter givarens excitation (ALEX) mätning av stökiometrin hos FRET-händelserna, vilket bidrar till diskriminering mellan sanna låga FRET-signaler från signaler som uppstår, t.ex. från sonder med en fotobleached acceptor fluorophore18.
Fret-experiment med en molekyl utförs ofta på ett av två sätt. För det första belyses en liten region i provvolymen med hjälp av ett konfokalt mikroskop. En sondmolekyler i lösning är upphetsade när de råkar spridas inom brännvolymen. Med denna teknik kan snabba fotonräkningsdetektorer användas, vilket möjliggör tidsupplösning under mikrosekunder. För det andra immobiliseras sonder specifikt på ytor och övervakas via widefieldmikroskopi, ofta med hjälp av total intern reflektion (TIR) konfiguration för att minimera bakgrundsfluorescens. Probe immobilisering möjliggör mycket längre inspelningstider än att använda den första metoden. Dessutom tillåter det större synfältet övervakning av flera sonder parallellt. Behovet av en kamera gör denna metod långsam jämfört med den som beskrivs ovan. Tidsupplösningen är begränsad till millisekunden till andra intervallet.
Om det krävs långa tidsspår, t.ex. för att studera dynamiska processer på en millisekund till andra gången, är den första metoden inte tillämplig, eftersom fluorescenssprängningarna vanligtvis är för korta. Det andra tillvägagångssättet misslyckas när immobilisering inte är möjligt, t.ex. i experiment med levande celler med sonder som sprider sig i cellmembranet. Dessutom har det observerats att biologiska modellsystem kan variera sitt svar dramatiskt beroende på den kontaktade ytans rörlighet16.
Medan kombinerade smFRET- och single-particle tracking experiment som registrerar mobila FRET-sonder har utförts under de senaste19, finns det ingen offentligt tillgänglig programvara för utvärdering av data. Detta föranledde utvecklingen av en ny analysplattform, som möjliggör bestämning av flera egenskaper hos mobila fluorescerande sonder, inklusive smFRET-effektivitet och stökiometri, positioner med subpixelnoggrannhet och fluorescensintensiteter som tidens funktioner. Metoder för att filtrera de resulterande spåren genom att undersöka stegvis blekningsbeteende, närmaste granne avstånd, utsläpp intensiteter och andra egenskaper fastställdes för att uteslutande välja korrekt syntetiserade och funktionella en-sond molekyler. Programvaran stöder också experimentella och analytiska tekniker som nyligen överenskommits i en multilaboratory studie för att producera tillförlitliga, kvantitativa smFRET-data17. I synnerhet följer genomförandet de validerade förfarandena för beräkning av FRET-effektivitet och stökiometri. Fluorescensintensiteter vid givarens excitation i givarens utsläppskanal IDD och acceptor emissionskanal IDA används för beräkning av den uppenbara FRET-effektiviteten Eapp med Eq (1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg"> (1)
Med hjälp av fluorescensintensiteten i acceptorutsläppskanalen vid acceptor excitation IAA beräknas den uppenbara stökiometrin med eq (2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg"> (2)
FRET-effektiviteten E och stökiometrin S kan härledas från Eapp och Sapp genom att beakta fyra korrigeringsfaktorer.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg">
α beskriver läckaget av donatorfluorescens i acceptorens utsläppskanal och kan bestämmas med hjälp av ett prov som endast innehåller donatorfluoforer eller genom att analysera delar av banor där acceptorn har blekts. δ korrigerar för direkt excitation av acceptorn av givarexcitationsljuskällan och kan mätas med hjälp av ett prov med endast acceptorfluoforer eller genom att analysera delar av banor där givaren har blekts.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg">.
γ skalar IDD för att korrigera olika detektionseffektivitetseffektivitet i givar- och acceptorutsläppskanaler och olika kvanteffektivitetsvinster hos fluoroforerna. Faktorn kan beräknas genom att analysera ökningen av donatorintensiteten vid acceptor blekning i banor med hög FRET-effektivitet20 eller genom att studera ett prov med flera diskreta FRET-tillstånd.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg">
β skalar IAA för att korrigera för olika effektivitetsvinster av givare och acceptor excitation. Om γ fastställdes via acceptans blekningsanalys kunde β beräknas utifrån ett prov av känt förhållande mellan donator och acceptor21. Annars ger det flerstatliga FRET-exemplet också β.
Tillsammans möjliggör korrigeringarna beräkningen av den korrigerade FRET-effektiviteten med eq (3).
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg"> (3)
och den korrigerade stökiometrin med Eq (4).
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg"> (4)
Helst ger den korrigerade stökiometrin för ett 1:1 donator-till-acceptor-förhållande S = 0,5. I praktiken ger ett minskat signal-till-brus-förhållande en spridning av de uppmätta värdena för S, vilket hindrar diskrimineringen från signaler endast för donatorer (S = 1) och endast acceptanssignaler (S = 0). De resulterande tidsspåren kan användas som indata för en mer detaljerad analys av enmolekylbanorna för att erhålla information som spatiotemporala kraftprofiler16, rörligheten för enmolekylhändelserna22 eller övergångskinetik mellan olika tillstånd1.
Följande protokoll beskriver experimentella parametrar och procedurer för smFRET-spårningsexperiment, samt arbetsprincipen bakom dataanalys med hjälp av den nyutvecklade programvarusviten. För förvärv av experimentella data rekommenderas att man använder en mikroskopiinställning som uppfyller följande krav: i) förmåga att upptäcka utsläpp av enstaka färgämnesmolekyler; ii) Belysning av bredfält: särskilt för experiment med levande celler rekommenderas total intern reflektion (TIR23,24,25) konfiguration. iii) Rumslig separation av emissionsljuset efter våglängd så att givarens och acceptorfluorescensen projiceras på olika regioner i samma kamerachip25 eller olika kameror. iv) Modulering av ljuskällor för donator och acceptor excitation med millisekundsprecision, t.ex. med hjälp av direkt modulerbara lasrar eller modulering via acoustooptiska modulatorer. Detta tillåter stroboscopic belysning för att minimera fotobleaching av fluoroforer samt alternerande excitation för att bestämma stoichiometrier; v) utdata för en fil per inspelad bildsekvens i ett format som kan läsas av PIMS Python-paketet26. I synnerhet stöds TIFF-filer med flera sidor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790404P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945; Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1084-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer microscope body</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET570/60m</td>
			<td>donor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET675/50m</td>
			<td>acceptor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conda-forge</td>
			<td>conda-forge community</td>
			<td></td>
			<td>community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td>
			<td>MENZEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>FF640-FDi01-25&#215;36</td>
			<td>separation of donor and acceptor emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (quad band)</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>Di01-R405/488/532/635-25&#215;36</td>
			<td>separation of excitation and emission light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fret-analysis</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python package for smFRET data analysis; version 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11524766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBeam Smart 405-S 405 nm laser</td>
			<td>Toptica Photonics AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek chambers (8 wells)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177402PK</td>
			<td>for sample preparation and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenia Prime 532 nm laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniconda</td>
			<td>Anaconda Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Python 3 distribution. Min. version: 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20860 &#38; 20859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBIS 640 nm laser</td>
			<td>Coherent Inc</td>
			<td>1185055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optosplit II</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5253</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sdt-python</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python library for data analysis; version 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpek bead size kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T14792</td>
			<td>Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USC500TH Ultrasound bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>for SUV formation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes

Enmolekylig Förster resonansenergiöverföring (smFRET) är en mångsidig teknik som rapporterar om avstånd i subnanorometern till nanometerområdet. Det har använts i ett brett spektrum av biofysiska och molekylärbiologiska experiment, inklusive mätning av molekylära krafter, karakterisering av konformationell dynamik av biomolekyler, observation av intracellulär colocalization av proteiner och bestämning av receptor-ligand interaktionstider. I en widefield mikroskopi konfiguration utförs experiment vanligtvis med hjälp av yto immobiliserade sonder. Här presenteras en metod som kombinerar enmolekylspårning med alternerande excitation (ALEX) smFRET-experiment, vilket möjliggör förvärv av smFRET-tidsspår av ytbundna, men mobila sonder i plasmamembran eller glasstödda lipidbilayers. För analys av inspelade data utvecklades en automatiserad insamling av programvara med öppen källkod som stöder (i) lokalisering av fluorescerande signaler, ii) spårning av en partikel, iii) bestämning av FRET-relaterade kvantiteter inklusive korrigeringsfaktorer, iv) strikt verifiering av smFRET-spår och (v) intuitiv presentation av resultaten. De genererade data kan bekvämt användas som indata för vidare utforskning via specialiserad programvara, t.ex. för bedömning av sonders diffusionsbeteende eller undersökning av FRET-övergångar.

En mängd olika låg- och högnivåinformation kan extraheras från smFRET-spår beroende på den vetenskapliga frågan om experimentet. Här presenteras exempel på analyspipelines med analoga och digitala sonder: en peptidbaserad molekylär kraftsensor16 och en DNA-sond med stokastisk växling av dess konformation38. Se figur 5 för dessa sonders konstruktions- och arbetsprincip.
När lokaliserings- och spårningsalgoritmerna har utförts enligt beskrivningen i protokollet erbjuder paketet flera datavisualiseringsverktyg för att optimera de första parametrarna och efterföljande filtersteg: (i) visualisering av enskilda smFRET-händelser, (ii) valfri bildsegmentering för att analysera data i vissa intresseområden, (iii) övervakning av filtersteg via FRET-effektivitet kontra stökiometridiagram (E-S). Visualiseringen av enmolekylsdata presenteras i figur 6.
Slutligen representeras de filtrerade FRET-händelserna av en E-S-plot och ett FRET-effektivitets histogram (figur 4). E-S-tomten är ett användbart verktyg för att optimera de ovan nämnda filtreringsstegen och undersöka slutresultatet. Delvis blekta eller ofullständigt märkta FRET-sensorer kan uteslutas av deras stökiometrivärde. Mobilitetsparametrar kan undersökas genom att rita upp en enskild bana i ett x-y-område (figur 6) eller ett genomsnittligt kvadratiskt förskjutningsdiagram (figur 4). Den första metoden är särskilt användbar för att diskriminera mobil från immobiliserade händelser, medan den senare används för att beräkna diffusionskoefficienten.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> Figur 4: Föredömlig produktion. (A) FRET-effektiviteten plottas kontra stökometri (E-S-plot) för en population av den molekylära kraftsensorn (vänster panel) som dekorerar en glasstödd lipidbilayer och spänns av en T-cell. Endast ett befolkningsmoln är synligt. Respektive histogram av FRET-effektivitet exemplifierar skillnaden mellan en kraftsensorpopulation i närvaro och frånvaro av celler (mittpanel). Ingen övergång till lägre FRET-effektivitet hos sensorpopulationen i närvaro av T-celler kan observeras, vilket indikerar liten eller ingen kraftberoende sträckning av sensormodulen. MSD-området för dessa experimentella tillstånd bekräftar att kraftsensorpopulationen under en T-cell rör sig betydligt långsammare än deras obundna motsvarigheter (höger panel). (B) Samma analys utfördes med Holliday junction DNA-sensor som dekorerar en glasstödd flytande lipidbilayer. E-S-tomten visar tydligt två populationer, vilket också framgår av FRET-effektivitets histogrammet. MSD-området indikerar närvaron av en snabbrörlig sensorpopulation. Förkortningar: FRET = Förster resonans energiöverföring; MSD = genomsnittlig kvadratförskjutning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> Figur 5: Konstruktion och arbetsprincip för intramolekylära FRET-sonder. (A) Analog peptidsensor för kvantifiering av mekaniska molekylära krafter. Donatorn och acceptor fluoroforer är kovalent fästa på vardera änden av peptid ryggraden. Sensormodulen är platsspecifikt fäst vid en specifik ligand, som i sin tur binder en cell-resident ytreceptor av intresse (här, ett antikroppsfragment som specifikt känner igen betakedjan för T-cellsreceptorn). Vid receptor-ligandbindning utövas kraft, och sensormodulen sträcker sig och rekylerar så småningom efter bindningsklyvning. Denna panel är modifierad från 16. (B) Digital DNA-sensor för kvantifiering av FRET-övergångar. FRET-sensorn består av fyra DNA-strängar som bildar en Holliday-korsning. Donatorn och acceptor fluorophore är kovalent fäst vid två strängar. Holliday-korsningar växlar ofta sin konformation beroende på de omgivande buffertförhållandena. Den stokastiska växlingen av dessa konformationer kan övervakas genom att kvantifiera FRET-effektiviteten hos enskilda sonder. Förkortningar: TCR = T-cellsreceptor; FRET = Förster resonans energiöverföring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> Bild 6: Exempel på lokalisering och spårning av FRET-sonder. A) DE enskilda händelsernas fret-effektivitet och stokiiometri beräknas genom att givaren fluoroforens intensitet vid donatorexcitation (D → D), acceptorfluoforen vid donatorexcitation (D → A) och acceptorfluorfluoren vid acceptor excitation (A → A). Närmaste grannfiltrering förhindrar partiskhet genom överlappande punktspridningsfunktioner för nära emittrar. Bildsegmentering gör det möjligt för användaren att välja vissa smFRET-händelser lokaliserade inom ett intresseområde (t.ex. en cell eller en mikromönster). Som ett exempel på bildsegmentering färgades T-celler med Fura-2 (visas till vänster) och utsattes för adaptiv tröskel för att identifiera cellkanterna (orange prickad linje). Skalstänger = 5 μm. (B) smFRET-banor med hjälp av molekylkraftsensorn. Enskilda banor kan ritas i x-y-planet , vilket visualiserar deras diffusionsbeteende och lokalisering (vänster panel). Dessutom kan varje banas intensitet ritas över tid för att identifiera FRET-övergångar eller blekningssteg (mittpanelen visar den röda banan från den vänstra panelen). Den resulterande FRET-effektiviteten och stökiometrin kan visualiseras på samma sätt (höger panel). C) SMFRET-banor med hjälp av Holliday junction DNA-sensorn. HBSS + 12 mM MgCl2 användes som buffert under mätningarna. Bortsett från det uppenbara acceptor blekningssteget nära sekvensänden av dessa exempel kan frekvensen av FRET-övergångar för varje sensor bestämmas. Holliday-korsningarna växlar sin konformation med hög frekvens, medan den molekylära kraftsensorn inte uppvisar FRET-övergångar. Denna information gör det möjligt att justera de experimentella förhållandena, såsom fördröjningen mellan ramarna, för att öka eller minska antalet observerade övergångar. Förkortningar: FRET = Förster resonans energiöverföring; smFRET = enmolekylig FRET; HBSS = Hanks balanserade saltlösning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Kompletterande information: Lokalisering och spårning av enstaka molekyler (01. Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Denna artikel presenterar en metod för spatiotemporal analys av mobila, en-molekyl Förster resonans energiöverföring (smFRET)-baserade sonder med hjälp av widefield fluorescence mikroskopi. Den nyutvecklade mjukvaruverktygssatsen gör det möjligt att bestämning av smFRET-tidsspår av rörliga sonder, inklusive rätt FRET-effektivitet och de molekylära positionerna, som tidens funktioner.

Automatiserad tvådimensionell Spatiotemporal analys av mobila enmolekyliga FRET-sonder

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Enmolekyliga FRET-experiment med ytbundna sonder har utförts nästan uteslutande på immobiliserade molekyler tidigare. Men många biomolekyler sprider sig och kan analyseras med vår metod. Genom att kombinera enmolekyls FRET med spårning kan man analysera inte bara FRET-bristtidsspår av rörliga sonder, utan också att undersöka spatiotemporala aspekter som diffusionsbeteende.Vår metod är kompatibel med en mängd olika FRET-baserade sonder. Det kan till exempel ge insikter om molekylära krafter, konformationsdynamik och bindande kinetik i levande cellexperiment. Högkvalitativa fret-experiment med en molekyl är notoriskt svåra att utföra.För tillförlitlig kvantifiering är det viktigt att registrera data med ett bra signal-till-brus-förhållande och enmolekylspår av tillräcklig längd. För att påbörja provmätningen, excitera donatorn och accepterfluoforerna under en lämplig belysningstid medan du utlöser kameran och väntar tills kamerans avläsning är aktiverad. Upprepa excitationen av givaren och acceptera fluoroforer alternativt.Välj antalet upprepningar som ska vara tillräckligt stort för att säkerställa fotobleaching av minst en fluorofor per sond inom synfältet, vilket gör det möjligt för stegvis fotobleachinganalys att diskriminera enmolekylssignaler från aggregat. Ange belysningssekvensen för att tillåta val av givar- och acceptexcitationsramar samt bildsegmenteringsramar från inspelade bildsekvenser. Analysera samtidigt datamängderna som registrerats med samma belysningsinställningar.I detta syfte tilldelar du en identifierare och ett mönster som matchar respektive filnamn för bildsekvens till varje datauppsättning. Definiera dessutom specifika datamängder för särskilda ändamål, t.ex. Välj sedan utsläppskanaler och råa bilder om båda kanalerna spelas in med en enda kamera.För detta använder du lämplig grafisk widget för att välja lämpliga regioner för givar- och acceptutsläpp, lokalisera sedan fiducialmarkörer i båda emissionskanalerna och utföra bildregistrering. Använd det angivna användargränssnittet för att hitta lämpliga parametrar för lokaliseringsalgoritmen för både givar- och accepterutsläppskanaler. Ställ sedan in enmolekylslokaliseringsparametrar för FRET-sonder vid donatorexcitation i summan av de bilder som erhållits från givarens och acceptorutsläppen och ställ sedan in lokaliseringsparametrar för sonder vid acceptor excitation i acceptor-utsläppskanalen.Lokalisera FRET-sonder på givare och acceptor excitation oberoende i alla ramar. Resultaten sammanfogas till en tabell som innehåller det ursprungliga ramnumret, tvådimensionella koordinater och en identifierare som refererar till källbildfilen. Om du vill spåra och mäta fluorescensintensitet väljer du lämpliga alternativ för Trackpy-algoritmen för att länka FRET-sondlokaliseringar till banor.Använd sedan analysprogramvarans funktionalitet hjälp av hjälp av bilddata från bildsekvenser. Extrahera ytterligare bilder inspelade för att underlätta segmentering markerad med S i excitationssekvensen. Slutligen bestämmer du givar- och acceptor excitationsljusprofiler över hela synfältet från bilder som spelats in på ett tätt märkt prov.För de första filtreringsstegen kasserar du signaler med överlappande punktspridningsfunktioner eftersom det är svårt att bestämma deras fluorescensintensiteter på ett tillförlitligt sätt. Vid inhomogen belysning, acceptera endast signaler som ligger i väl upplysta områden inom synfältet för att säkerställa ett bra signal-till-brus-förhållande. Om du studerar intramolekylär FRET, begränsa analysen till de banor som finns från början av bildsekvensen.Därefter utför du den platta fältkorrigeringen, som använder excitation ljuskällan profiler som erhållits tidigare för att vända de position-beroende fluorescens intensitet variationer som orsakas av inhomogen belysning, sedan beräkna den uppenbara FRET effektivitet och den uppenbara stökiometrin. För att utföra stegvis analys av fotobleaching för diskriminering mellan enstaka molekylära sonder och aggregat, hitta lämpliga parametrar för förändringspunkt identifiering algoritmen på givaren och accepter excitation oberoende. Kör sedan algoritmen för identifiering av ändringspunkt.Om du vill ta bort spår som visar tvetydigt fotobleaching-beteende definierar du intensitetströsklar under vilka en fluorofor anses blekt och väljer sedan ett av följande alternativ. Alternativ ett där acceptor fluorophore bleker i ett enda steg medan givaren inte visar någon partiell blekning. Alternativ två där donatorn bleker i ett enda steg medan det inte finns någon partiell acceptor blekning.Alternativ tre där antingen fluorofre bleker i ett enda steg medan det andra inte delvis bleker. Och alternativ fyra där donator och acceptor fluorophores visar enstegs fotobleaching eller ingen fotobleaching alls. Beräkna sedan korrigeringsfaktorerna för givarutsläppsläckage i acceptorkanalen, direkt acceptor excitation, detektionseffektivitet och excitationseffektivitet.Använd sedan korrigeringsfaktorerna för att beräkna FRET-effektivitet från uppenbar effektivitet och stökiometri från uppenbar stökiometri. För ytterligare filtrering väljer du endast datapunkter från före den första blekningshändelsen i varje bana. För att begränsa analysen till enmolekyliga sonder, acceptera dessutom endast banor med minst 75% av datapunkterna inom lämpliga stökiometrigränser.Utför sedan bildsegmentering via globala eller anpassningsbara tröskelvärden på lämpliga hjälp bilder för att begränsa analysen till distinkta regioner inom synfältet. Skapa effektivitet kontra stökiometridiagram för att verifiera att signaler av felaktig stökiometri har identifierats korrekt och tagits bort. Plot sedan histogram av FRET effektivitet för att ge en väletablerad översikt över FRET effektivitet distributioner och gruppera histogram för bekväm jämförelse av resultat från olika experiment.Genom att dra nytta av vetenskapliga Python-bibliotek är det möjligt att ytterligare utvärdera data i anteckningsboken och till exempel utföra diffusionsanalys. Visualisering och spårning av enmolekyls FRET-händelse visas här. Filtrerade FRET-händelser representeras av effektivitet kontra stökiometri tomter i ett FRET effektivitet histogram.Vidare kan mobilitetsparametrar undersökas genom att rita en enskild bana i ett XY-område eller ett genomsnittligt kvadratiskt förskjutningsdiagram. Effekten av vår plattform gör det möjligt för oss att ytterligare identifiera övergångar i FRET-effektivitetstidsspår av mobila sonder. Till exempel för att utvärdera konformationella förändringar av biomolekylerna.Med hjälp av en FRET-baserad kraftsensor gjorde analysplattformen det möjligt för oss att kvantifiera enmolekylskrafthändelser inom den immunologiska synapsen under tidig T-cellssignalering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Att skapa två-dimensionell Mönstrad substrat för Protein och Cell inneslutning

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexade enda molekyl Force proteolys Mätningar med Magnetic pincett

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Kvantitativ FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analys för SENP1 Proteas Kinetik Fastställande

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Undersöka Receptor-ligand System av Cellulosome med AFM-baserad Single-molekyl Force spektroskopi

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Högupplöst Spatiotemporal Analys av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enda molekyl fluorescensmikroskopi på Planar bilayers stöds

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Label-fri enda molekyl Detection Använda Microtoroid optiska resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Känslig detektion av Proteopathic Seeding aktivitet med FRET flödescytometri

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescens Återhämtning efter Sammanfoga en droppe att mäta de tvådimensionella Spridning av en Phospholipid Mono

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatiserad Contraction analys av Human Engineered hjärtvävnad för Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...