Name: automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Bu çalışma Avusturya Bilim Fonu (FWF) projeleri P30214-N36, P32307-B ve Viyana Bilim ve Teknoloji Fonu (WWTF) LS13-030 tarafından desteklendi.

<ol>
	<li>McKinney, S. A., D&#233;clais, A. -. C., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+individual+holliday+junctions.">Structural dynamics of individual holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).</li><li>Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+potassium-channel+gating+revealed+by+single-molecule+FRET.">Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).</li><li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks.">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), 235 (2018).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).</li><li>Wu, P. G., Brand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonance+energy+transfer:+Methods+and+applications.">Resonance energy transfer: Methods and applications.</a> Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).</li><li>Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecular+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+measurement+on+structures+and+interactions+of+biomolecules.">Single-molecular f&#246;rster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules.</a> Micromachines. 12 (5), 492 (2021).</li><li>Malkusch, N., D&#246;rfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=smFRET+experiments+of+the+RNA+polymerase+II+transcription+initiation+complex.">smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex.</a> Methods. 120, 115-124 (2017).</li><li>Lee, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+views+of+MutS+on+mismatched+DNA.">Single-molecule views of MutS on mismatched DNA.</a> DNA repair. 20, 82-93 (2014).</li><li>Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microsecond+single-molecule+FRET+to+determine+the+assembly+pathways+of+T4+ssDNA+binding+protein+onto+model+DNA+replication+forks.">Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).</li><li>Deindl, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+conformational+dynamics+with+single-molecule+fluorescence+energy+transfer:+Applications+in+nucleosome+remodeling.">Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling.</a> Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).</li><li>Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+colocalization+FRET+evidence+that+spliceosome+activation+precedes+stable+approach+of+5'+splice+site+and+branch+site.">Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).</li><li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations.">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li><li>Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+kinesin+waits+between+steps.">How kinesin waits between steps.</a> Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).</li><li>G&#246;hring, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+analysis+of+T-cell+receptor-imposed+forces+via+quantitative+single+molecule+FRET+measurements.">Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements.</a> Nature Communications. 12 (1), 2502 (2021).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669 (2018).</li><li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-aided+molecule+sorting:+Analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li><li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells.">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).</li><li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules.">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).</li><li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation.">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li><li>Asher, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+imaging+of+GPCR+dimers+in+living+cells.">Single-molecule FRET imaging of GPCR dimers in living cells.</a> Nature Methods. 18 (4), 397-405 (2021).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy. (12), 1223-1237 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(excitation)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (excitation) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1189-1191 (2012).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+(emission)+for+single-molecule+FRET.">Objective-type total internal reflection microscopy (emission) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1192-1194 (2012).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., van der Wel, C. M., Dimiduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft-matter/pims: PIMS v0.5. , (2020).</li><li>Anaconda Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Miniconda. , (2021).</li><li>conda-forge community. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The conda-forge project: community-based software distribution built on the conda package format and ecosystem. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> JupyterLab Contributors Notebooks - JupyterLab documentation. , (2021).</li><li>Babcock, H., Sigal, Y. M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-density+3D+localization+algorithm+for+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">A high-density 3D localization algorithm for stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Optical Nanoscopy. 1 (6), (2012).</li><li>Gao, Y., Kilfoil, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+detection+and+complete+tracking+of+large+populations+of+features+in+three+dimensions.">Accurate detection and complete tracking of large populations of features in three dimensions.</a> Optics Express. 17 (6), 4685 (2009).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> sdt-python: Python library for fluorescence microscopy data analysis (v17.1). , (2021).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nature Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li><li>Bradski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OpenCV+library.">The OpenCV library.</a> Dr. Dobb's Journal: Software Tools for the Professional Programmer. 25 (11), 120-123 (2000).</li><li>Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft-matter/trackpy:+Trackpy+v0.5.0.">Soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0.</a> Zenodo. , 4682814 (2021).</li><li>Killick, R., Fearnhead, P., Eckley, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+detection+of+changepoints+with+a+linear+computational+cost.">Optimal detection of changepoints with a linear computational cost.</a> Journal of the American Statistical Association. 107 (500), 1590-1598 (2012).</li><li>Schrangl, L., G&#246;hring, J., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+single+molecule+FRET+transitions+without+trajectories.">Kinetic analysis of single molecule FRET transitions without trajectories.</a> The Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123328 (2018).</li><li>Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+single-molecule+FRET+dynamics+with+probability+distribution+analysis.">Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis.</a> ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).</li><li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+analysis+software+(3.0).">Single-molecule FRET analysis software (3.0).</a> Zenodo. , (2021).</li><li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers.">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li><li>Platzer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unscrambling+fluorophore+blinking+for+comprehensive+cluster+detection+via+photoactivated+localization+microscopy.">Unscrambling fluorophore blinking for comprehensive cluster detection via photoactivated localization microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4993 (2020).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The molecular probes handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies. , (2010).</li><li>Szalai, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+energy+transfer+by+intensity-based+STED-FRET.">Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET.</a> Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+two-photon+probe+for+in+vivo+tracking+of+pH+during+a+traumatic+brain+injury+process.">A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process.</a> New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Bu makalede, mobil ancak yüzeye bağlı prob moleküllerinden kaynaklanan smFRET verilerinin otomatik kayıtları ve nicel analizi için bir işlem hattı ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Yüzey hareketsiz probları veya probların bir konfokal eksitasyon hacmine girip çıkmasını içeren smFRET deneylerine yönelik iki baskın yaklaşımı tamamlar17. Zamanın bir fonksiyonu olarak doğru FRET verimliliğini ve moleküler pozisyonları sağlar. Bu nedenle, geçiş kinetiği1, FRET histogramları39 veya iki boyutlu difüzyon22'yi ölçmek için özel analiz programları için giriş olarak kullanılabilir.
Yazılım, Kullanıcıya ücretsiz kullanım, değişiklik ve yeniden dağıtım hakkı veren Açık Kaynak Girişimi tarafından onaylanan ücretsiz ve açık kaynaklı bir lisans altında piyasaya sürülür. Github, hataları bildirerek veya code40'a katkıda bulunarak yazılımı elde etmeyi ve geliştirme sürecine katılmayı mümkün olduğunca kolaylaştırmak için bir geliştirme ve dağıtım platformu olarak seçildi. Python ile yazılan yazılım, tescilli bileşenlere bağlı değildir. Jupyter dizüstü bilgisayarların kullanıcı arayüzü olarak seçimi, her analiz adımında verilerin incelenmesini kolaylaştırır ve boru hattının özellikle eldeki deneysel sistem için uyarlayıp genişletilmesini sağlar. Sdt-python library32 temel görevi görür ve tek moleküllü lokalizasyon, difüzyon analizi, floresan yoğunluğu analizi, renk kanalı kaydı, kolokalizasyon analizi ve yatırım getirisi işleme gibi floresan mikroskopi verilerini değerlendirmek için işlevsellik uygular.
Prensip olarak, tek parçacıklı izleme tek, iki veya üç boyutlu sistemlerde yapılabilir. Burada, tek moleküllü analiz boru hattı 2D mobil sistemlerin çalışmasına göre uyarlandı. Bu seçim, mobil floresan probları sunmak için düzlem destekli lipid bilayerler (SLB'ler) gibi basit sistemlerin kullanılabilirliğini yansıtır. Bu tür lipid bilayer sistemleri tipik olarak, toplu fraksiyonun SLB'nin temel fizikokimyasal parametrelerini (faz ve viskozite gibi) belirlediği ve küçük fraksiyonun biyomoleküller için bağlanma bölgeleri sağladığı iki veya daha fazla fosfolipid moieties oluşur. Bu bağlanma bölgeleri, hevesli veya streptavidin bazlı protein platformları için biyotinilasyonlu fosfolipidler veya histidin etiketleri ile protein platformları için nikel-NTA konjuge fosfolipidler olabilir41. Proteinleri SLB'ye bağlamak için uygun platformun seçimi bilimsel soruya bağlıdır. Okuyucular, başarıyla kullanılan stratejilere örnek olarak literatür16,38,42'ye başvurabilir. Numunedeki probların yoğunluğu, çakışan nokta yayılma işlevlerini önlemek için yeterince düşük olmalıdır; tipik olarak, μm2 başına 0,1 molekülden daha az önerilir. Uygun bir prob yoğunluğunu gösteren bir örnek için temsili sonuçlar bölümüne (özellikle Şekil 6) bakın. Analiz yöntemi, canlı hücrelerin plazma zarında yaygın olan tek floresan etiketli protein molekülleri için de geçerlidir.
SmFRET deneylerinin kritik bir yönü, FRET problarının kendilerinin üretimi ve karakterizasyonudur. Bir FRET çifti için florofor seçerken, Förster yarıçapları beklenen boyalar arası mesafelerle eşleşmelidir43. Fotobleachinge dayanıklı boyalar uzun süre iz bırakmaları nedeniyle tercih edilir. Bununla birlikte, yüksek ağartma oranları için, kolokalize moleküllerden kaynaklanan multiemitter olaylarını adım adım fotobleaching analizi ile tanımak için bir florofor türü kullanılabilir; protokol bölümündeki 8.1.4 adımına bakın. Florofor çiftleri, özellikle ve etkileşim moleküllerine spesifik olarak bağlanmalı ve intra-veya intermoleküler FRET çiftleri oluşturmalıdır.
smFRET'i diğer hazır tekniklerle birleştirmek, uzamsal çözünürlüğünü kırınım sınırının ötesine (STED44 aracılığıyla) artırabilir. Burada sunulan smFRET izleme algoritması, yaklaşımın yeni deneysel ayarlara ve model sistemlerine uygulanabilirliğini genişletiyor. Bu, (i) mobil biyomoleküllerin stoichiometristindeki kinetik değişiklikler, (ii) mobil biyomoleküllerin dinamik ilişkisi, (iii) serbestçe yayılan reaktanların enzymatic reaksiyonlarının oranı ve (iv) mobil biyomoleküllerin konformasyonel değişikliklerinin kinetiği çalışmalarını içerir. İlk iki örnek, intermoleküler FRET'i gösteren model sistemleri gerektirir, yani donör ve alıcı, ilgi çekici biyomoleküler varlıkları ayırmak için eşlenir. İkinci örnekler, aynı moleküler varlık (intramoleküler FRET) içinde donör ve alıcı taşıyan biyosensörlerden yararlanabilir.
intramoleküler FRET tabanlı sensörler, biyomoleküllerin içsel konformasyonel değişimleri1,2,3,4, endojen veya dış kuvvet yükünün neden olduğu konformasyonel değişiklikler (moleküler kuvvet sensörleri16) veya kalsiyum45 ve pH46 gibi nano ortamdaki iyon konsantrasyonları hakkında fikir verebilir . Model sistemine ve tercih edilen ankraj platformuna bağlı olarak, bu tür smFRET olayları 2D veya 3D olarak izlenebilir: (i) bir plazma zarı içindeki reseptör-ligand etkileşim sürelerinin ölçülmesi, membran bağlantılı sinyal amplifikasyon basamaklarının birlikteliği ve yüzey reseptörlerinin stoichiometry değişiklikleri için smFRET olaylarının düzlemsel takibi; (ii) smFRET olaylarının hacim takibi, canlı hücrelerde veya in vitro yeniden oluşturulmuş sistemlerde herhangi bir intra-veya intermoleküler FRET probu için kullanılabilir.
SmFRET izleme yöntemi esas olarak intramoleküler FRET probları göz önünde bulundurularak geliştirilmiştir. Bu problar, aglomeralanmış ve yanlış sentezlenmiş (örneğin, tamamlanmamış etiketlenmiş) moleküllerden ve floroforlardan birinin fotobleached olduğu problardan gelen verileri reddetmek için sömürülen sabit ve iyi bilinen sayıda floresan etikete sahiptir. Bununla birlikte, filtreleme adımlarını ayarlayarak, yöntem intermoleküler FRET problarına da uygulanabilir. Örneğin, sadece tek bir donör ve tek bir kabul eden florofor içeren molekülleri kabul etmek yerine, donör ve alıcı boyalarının mekansal yörüngelerini inceleyebilir ve örneğin, donör-kabul eden yörüngeleri birlikte dağıtmak için seçebilirsiniz.
3D-DAOSTORM algoritması, emisyon ışını yolundaki silindirik bir lens nedeniyle astigmat üzerinden optik eksen boyunca bir sinyalin konumunu belirleme desteğine sahip olduğu için, 3D deneyler analiz boru hattına kolayca entegre edilebilir. Bu durumda, kabul edenin çıkarılması üzerine gelen kabul eden sinyal, stoichiometry ve eksenel pozisyonu belirlemeye yarar. Analiz yazılımı, büyük ölçüde otomasyon ve filtreleme şemalarını kullanarak hareketsiz problar içeren deneylerden elde edilen verileri değerlendirmek için de kullanılabilir. Aslında, Holliday kavşaklarından gelen smFRET verimlilik veri kümeleri jel fazlı bilayers38 üzerinde hareketsiz hale getirildi yazılımın erken bir sürümü kullanılarak analiz edildi.

Förster rezonans enerji transferi (FRET), nanometre altı çözünürlükte süreçlerin araştırılmasına izin verdiği için moleküler biyolojik ve biyofiziksel araştırmalarda önemli bir sürücü olmuştur. Donör ve kabul eden floroforlar arasındaki enerji transferinin verimliliği, nanometre altı ile nanometre aralığındaki boya arası mesafeye güçlü bir şekilde bağlı olduğundan, biyomoleküllerin statik ve dinamik uyumunu keşfetmek için spektroskopik bir cetvel olarak etkin bir şekilde kullanılmıştır1,2,3,4. Ek olarak, FRET fenomeni, membranla ilişkili ve hücre içi proteinlerin toplu düzeyde kolokalizasyon çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır5,6. Son yirmi yılda, yöntem zamansal ve mekansal çözünürlüğü önemli ölçüde artırmaya yardımcı olan ve heterojen örneklerdeki nadir alt nüfusları bile çözen smFRET olaylarını izlemek için uyarlandı7. Bu tekniklerle donatılmış, RNA polimeraz II8'in transkript işleme hızı, DNA polimerazlarının replikasyon hızı9,10, nükleozom translokasyon oranı11, birleştirilmiş spliceosomes12 transkript birleştirme ve duraklama oranı, ribozomal subpopulasyonların aktivitesi13 ve kinesin motorlarının yürüme hızı14 gibi moleküler makinelerin dinamiklerine benzersiz içgörüler kazandırıldı14 , birkaç isim vermek için. Reseptör-ligand etkileşim süreleri15 ve moleküler kuvvetler16 ölçülmüştir.
Yoğunluk bazlı smFRET çalışmaları tipik olarak FRET verimliliğini ölçmek için duyarlı emisyona dayanır: emisyon yolundaki bir ışın ayırıcı, donör uyarılması üzerine donör ve kabul edici floroforlardan kaynaklanan ışığı mekansal olarak ayırır ve bireysel floresan yoğunluklarının ölçülmesine izin verir. Verimlilik daha sonra toplam foton sayısına göre alıcı tarafından yayılan fotonların fraksiyonu olarak hesaplanabilir17. Buna ek olarak, donör ekscitasyonunu (ALEX) takiben kabul eden heyecan, FRET olaylarının stoichiometry ölçümüne izin vererek, örneğin fotobleached acceptor fluorophore18 içeren problardan kaynaklanan sinyallerden kaynaklanan gerçek düşük FRET sinyalleri arasındaki ayrımcılığa yardımcı olur.
Tek moleküllü FRET deneyleri genellikle iki yoldan biriyle gerçekleştirilir. İlk olarak, numune hacmindeki küçük bir bölge konfokal mikroskop kullanılarak aydınlattır. Çözeltideki tek prob molekülleri odak hacmi içinde yaygınlaşarak gerçekleştiğinde heyecanlanırlar. Bu teknikle, mikrosaniye altı zaman çözünürlüğünü sağlayan hızlı foton sayma dedektörleri kullanılabilir. İkincisi, problar yüzeylerde özellikle hareketsiz hale getirilir ve genellikle arka plan floresansını en aza indirmek için toplam iç yansıma (TIR) konfigürasyonu kullanılarak geniş alan mikroskopisi ile izlenir. Prob hareketsizleştirme, ilk yaklaşımı kullanmaktan çok daha uzun kayıt süreleri sağlar. Buna ek olarak, daha büyük görüş alanı paralel olarak birden çok probun izlenmesine izin verdi. Kamera ihtiyacı, bu yöntemi yukarıda açıklanana kıyasla yavaşlatır. Zaman çözünürlüğü milisaniye ile ikinci aralık arasında sınırlıdır.
Örneğin, dinamik süreçleri milisaniye ile ikinci zaman ölçeğinde incelemek için uzun süreli izlemeler gerekiyorsa, floresan patlamaları genellikle çok kısa olduğu için ilk yöntem uygulanamaz. İkinci yaklaşım, hareketsizleştirme mümkün olmadığı zaman, örneğin hücre zarı içinde yayılan probları içeren canlı hücre deneylerinde başarısız olur. Ayrıca, biyolojik model sistemlerinin temas edilen yüzeyin hareketliliğine bağlı olarak tepkilerini önemli ölçüde değiştirebildiği görülmüştür16.
Geçtiğimiz 19 yılında mobil FRET problarını kaydeden kombine smFRET ve tek parçacıklı izleme deneyleri gerçekleştirilirken, verilerin değerlendirilmesi için kamuya açık bir yazılım bulunmamaktadır. Bu, smFRET verimliliği ve stoichiometry, piksel altı doğruluğuna sahip pozisyonlar ve zamanın işlevleri olarak floresan yoğunlukları da dahil olmak üzere mobil floresan probların birden fazla özelliğinin belirlenmesine izin veren yeni bir analiz platformunun geliştirilmesine neden oldu. Sadece doğru sentezlenmiş ve işlevsel tek prob moleküllerini seçmek için adım adım ağartma davranışını, en yakın komşu mesafelerini, emisyon yoğunluklarını ve diğer özellikleri inceleyerek elde edilen izleri filtreleme yöntemleri oluşturulmuştur. Yazılım ayrıca güvenilir, nicel smFRET verileri üretmek için çok ayrıntılı bir çalışmada yakın zamanda kararlaştırılan deneysel ve analitik teknikleri de desteklemektedir17. Özellikle, uygulama FRET verimliliği ve stoichiometry hesaplaması için doğrulanmış prosedürlere uyar. Donör emisyon kanalı IDD ve kabul eden emisyon kanalı IDA'daki donör ekscitasyonu üzerine floresan yoğunlukları, Eq (1) kullanılarak görünür FRET verimliliğinin hesaplanmasında kullanılır.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg"> (1)
Kabul edenin IAA'sı üzerine kabul eden emisyon kanalındaki floresan yoğunluğunun yardımıyla, görünür stoichiometry Eq (2) kullanılarak hesaplanır.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg"> (2)
FRET verimliliği E ve stoichiometry S, dört düzeltme faktörü göz önünde bulundurularak Eapp ve Sapp'tan türetilebilir.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg">
α, donör floresanının alıcı emisyon kanalına sızdırılmasını açıklar ve sadece donör floroforları içeren bir örnek kullanılarak veya alıcının ağartıldığı yörüngelerin bölümlerini analiz ederek belirlenebilir. δ, bağışçının donör ekscitasyon ışık kaynağı tarafından doğrudan çıkarılması için düzeltilir ve sadece alıcı floroforlu bir örnek kullanılarak veya donörün ağartıldığı yörüngelerin bölümlerini analiz ederek ölçülebilir.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg">.
γ, donör ve alıcı emisyon kanallarındaki farklı algılama verimliliklerini ve floroforların farklı kuantum verimliliklerini düzeltmek için IDD'yi ölçeklendirir. Faktör, yüksek FRET verimliliğine sahip yörüngelerde alıcı ağartma üzerine donör yoğunluğundaki artışı analiz ederek veya birden fazla ayrıK FRET durumlarını içeren bir örnek çalışılarak hesaplanabilir.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg">
β, IAA'yı donör ve alıcı uyarımının farklı verimliliklerini düzeltmek için ölçeklendirir. Γ alıcı ağartma analizi ile tespit edilirse, bilinen donör-kabul oranı örneğinden β hesaplanabilir21. Aksi takdirde, çok durumlu FRET örneği de β verir.
Düzeltmeler birlikte, Düzeltilmiş FRET verimliliğinin Eq (3) kullanılarak hesaplanmasına izin verir.
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg"> (3)
ve Eq (4) kullanılarak düzeltilmiş stoichiometry.
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg"> (4)
İdeal olarak, 1:1 donör-kabul oranı için düzeltilmiş stoichiometry S = 0.5 verir. Uygulamada, azaltılmış sinyal-gürültü oranı, ölçülen S değerlerinin yayılmasını sağlar ve yalnızca donör sinyallerinden (S = 1) ve yalnızca alıcı sinyallerinden (S = 0) ayrımcılığı engeller. Elde edilen zaman izleri, mekansal kuvvet profilleri16, tek moleküllü olayların hareketliliği22 veya farklı durumlar arasındaki geçiş kinetiği gibi bilgileri elde etmek için tek molekül yörüngelerinin daha ayrıntılı bir analizi için giriş olarak kullanılabilir1.
Aşağıdaki protokolde, smFRET izleme deneyleri için deneysel parametreler ve prosedürlerin yanı sıra yeni geliştirilen yazılım paketini kullanarak veri analizinin arkasındaki çalışma ilkesi açıklanmaktadır. Deneysel verilerin eldei için, aşağıdaki gereksinimleri karşılayan bir mikroskopi kurulumu kullanılması önerilir: i) tek boya moleküllerinin emisyonunu tespit etme yeteneği; ii) geniş alan aydınlatması: özellikle canlı hücre deneyleri için toplam iç yansıma (TIR23,24,25) konfigürasyonu önerilir; iii) emisyon ışığının dalga boylarına göre uzamsal olarak ayrılması, donör ve alıcı floresan aynı kamera çipinin farklı bölgelerine yansıtılır25 veya farklı kameralar; iv) donör ve alıcı uyarılması için ışık kaynaklarının milisaniye hassasiyetle modülasyonu, örneğin doğrudan modüle edilebilir lazerler veya acousto-optik modülatörler aracılığıyla modülasyon. Bu, floroforların fotobleachingini en aza indirmek için stroboscopic aydınlatmaya ve stoichiometries belirlemek için alternatif uyarmaya izin eder; v) PIMS Python paketi26 tarafından okunabilecek bir biçimde kaydedilen görüntü sırası başına bir dosyanın çıktısı. Özellikle, çok sayfalı TIFF dosyaları desteklenir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790404P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945; Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1084-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer microscope body</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET570/60m</td>
			<td>donor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET675/50m</td>
			<td>acceptor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conda-forge</td>
			<td>conda-forge community</td>
			<td></td>
			<td>community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td>
			<td>MENZEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>FF640-FDi01-25&#215;36</td>
			<td>separation of donor and acceptor emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (quad band)</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>Di01-R405/488/532/635-25&#215;36</td>
			<td>separation of excitation and emission light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fret-analysis</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python package for smFRET data analysis; version 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11524766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBeam Smart 405-S 405 nm laser</td>
			<td>Toptica Photonics AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek chambers (8 wells)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177402PK</td>
			<td>for sample preparation and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenia Prime 532 nm laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniconda</td>
			<td>Anaconda Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Python 3 distribution. Min. version: 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20860 &#38; 20859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBIS 640 nm laser</td>
			<td>Coherent Inc</td>
			<td>1185055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optosplit II</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5253</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sdt-python</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python library for data analysis; version 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpek bead size kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T14792</td>
			<td>Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USC500TH Ultrasound bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>for SUV formation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes

Tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (smFRET), nanometre altından nanometre aralığına olan mesafeleri rapor eden çok yönlü bir tekniktir. Moleküler kuvvetlerin ölçümü, biyomoleküllerin konformasyonel dinamiklerinin karakterizasyonu, proteinlerin hücre içi kolokalizasyonunun gözlemlenmesi ve reseptör-ligand etkileşim sürelerinin belirlenmesi dahil olmak üzere çok çeşitli biyofiziksel ve moleküler biyolojik deneylerde kullanılmıştır. Geniş alan mikroskopi konfigürasyonunda, deneyler genellikle yüzey hareketsiz problar kullanılarak gerçekleştirilir. Burada, tek moleküllü izlemeyi alternatif uyarlama (ALEX) smFRET deneyleriyle birleştiren bir yöntem sunulmuştur ve plazma membranlarında veya cam destekli lipid iki katmanlı yüzeye bağlı, ancak mobil probların smFRET zaman izlerinin elde edilmesine izin verir. Kaydedilen verilerin analizi için, (i) floresan sinyallerin yerelleştirilmesi, (ii) tek parçacıklı izleme, (iii) düzeltme faktörleri de dahil olmak üzere FRET ile ilgili miktarların belirlenmesi, (iv) smFRET izlerinin sıkı bir şekilde doğrulanması ve (v) sonuçların sezgisel sunumuna destek olan otomatik, açık kaynaklı bir yazılım koleksiyonu geliştirilmiştir. Oluşturulan veriler, örneğin probların difüzyon davranışlarının değerlendirilmesi veya FRET geçişlerinin araştırılması gibi özel yazılımlar aracılığıyla daha fazla keşif için girdi olarak kullanılabilir.

Deneyin bilimsel sorusuna bağlı olarak smFRET parçalarından çeşitli düşük ve üst düzey bilgiler çıkarılabilir. Burada, analog ve dijital problara sahip analiz boru hatları örnekleri sunulmaktadır: peptit bazlı moleküler kuvvet sensörü16 ve konformasyonu38'in stokastik anahtarlamalı bir DNA probu. Bu probların tasarım ve çalışma prensibi için Şekil 5'e bakın.
Yerelleştirme ve izleme algoritmaları protokolde açıklandığı gibi yürütüldükten sonra, paket ilk parametreleri ve sonraki filtre adımlarını optimize etmek için birden fazla veri görselleştirme aracı sunar: (i) bireysel smFRET olaylarının görselleştirilmesi, (ii) belirli ilgi bölgelerindeki verileri analiz etmek için isteğe bağlı görüntü segmentasyonu, (iii) filtre adımlarının FRET verimliliği ve stoichiometry (E-S) çizimleri aracılığıyla izlenmesi. Tek moleküllü verilerin görselleştirilmesi Şekil 6'da sunulmuştur.
Son olarak, filtrelenmiş FRET olayları bir E-S çizimi ve bir FRET verimlilik histogramı ile temsil edilir (Şekil 4). E-S çizimi, yukarıda belirtilen filtreleme adımlarını optimize etmek ve nihai sonucu araştırmak için kullanışlı bir araçtır. Kısmen ağartılmış veya eksik etiketlenmiş FRET sensörleri stoichiometry değerlerine göre hariç tutulabilir. Hareketlilik parametreleri , x-y çiziminde (Şekil 6) veya ortalama kare yer değiştirme (MSD) grafiğinde (Şekil 4) tek bir yörünge yolu çizilerek incelenebilir. İlk yöntem özellikle mobili hareketsiz olaylardan ayırt etmek için yararlıdır, ikincisi ise difüzyon katsayısını hesaplamak için kullanılır.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> Şekil 4: Örnek çıktı. (A) FRET verimliliği, cam destekli bir lipid bilayerini süsleyen ve bir T hücresi tarafından zorlanan moleküler kuvvet sensörünün (sol panel) bir popülasyonu için stoichiometry 'ye (E-S arsa) karşı çizilir. Yalnızca bir popülasyon bulutu görülebilir. FRET verimliliklerinin ilgili histogramı, hücrelerin varlığı ve yokluğunda (orta panel) bir kuvvet sensörü popülasyonu arasındaki farkı örneklem eder. T hücrelerinin varlığında sensör popülasyonunun daha düşük FRET verimliliğine kayma gözlenemez, bu da sensör modülünün kuvvete bağlı olarak çok az veya hiç esnemediğini gösterir. Bu deneysel koşulların MSD çizimi, bir T hücresinin altındaki kuvvet sensörü popülasyonunun ilişkisiz benzerlerinden (sağ panel) çok daha yavaş hareket ettiğini doğrular. (B) Aynı analiz, cam destekli sıvı lipid bilayerini süsleyen Holliday junction DNA sensörü ile yapılmıştır. E-S arsası, FRET verimlilik histogramında da belirgin olan iki popülasyonu açıkça göstermektedir. MSD çizimi, hızlı hareket eden bir sensör popülasyonunun varlığını gösterir. Kısaltmalar: FRET = Förster rezonans enerji transferi; MSD = ortalama kare yer değiştirme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> Şekil 5: Intramoleküler FRET problarının tasarımı ve çalışma prensibi. (A) Mekanik moleküler kuvvetlerin ölçülmesi için analog peptit sensörü. Donör ve kabul eden floroforlar peptit omurgasının her iki ucuna da yaygın olarak bağlanır. Sensör modülü, belirli bir ligand'a özel olarak tutturulur, bu da hücre yerleşik bir yüzey reseptörüne bağlanır (burada, özellikle T hücre reseptörünün beta zincirini tanıyan bir antikor parçası). Reseptör-ligand bağlanması üzerine kuvvet uygulanır ve sensör modülü bağ dekoltesi sonrası uzar ve sonunda geri tepir. Bu panel 16'dan değiştirildi. (B) FRET geçişlerinin nicelleştirilmesi için dijital DNA sensörü. FRET sensörü Holliday kavşağı oluşturan dört DNA teli oluşur. Donör ve kabul eden florofor iki tellere birlikte bağlanır. Holliday kavşakları, çevredeki tampon koşullarına bağlı olarak konformasyonlarını sık sık değiştirir. Bu konformasyonların stokastik anahtarlamaları, bireysel probların FRET verimliliği ölçülerek izlenebilir. Kısaltmalar: TCR = T hücre reseptörü; FRET = Förster rezonans enerji transferi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> Şekil 6: FRET problarının lokalizasyonu ve takibi örnekleri. (A) Bireysel olayların FRET verimliliği ve stoichiometry, donör haber alma (D → D), donör ekscitasyonu üzerine kabul eden florofor (D → A) ve kabul eden flüforun alıcı ekscitasyon (A → A) üzerindeki yoğunluğu ölçülerek hesaplanır. En yakın komşu filtreleme, yakın yayıcıların nokta yayma işlevlerinin üst üste binmesiyle sapmayı önler. Görüntü segmentasyonu, kullanıcının ilgi alanı içinde yerelleştirilmiş belirli smFRET olaylarını (örneğin, bir hücre veya mikropattern) seçmesine olanak tanır. Görüntü segmentasyonuna örnek olarak, T hücreleri Fura-2 ile boyandı (solda görüntülendi) ve hücre kenarlarını tanımlamak için uyarlanabilir eşiğe tabi tutuldu (turuncu noktalı çizgi). Ölçek çubukları = moleküler kuvvet sensörini kullanarak 5 μm. (B) smFRET yörüngeleri. Tek tek yörüngeler x-y düzleminde çizilebilir, difüzyon davranışlarını ve lokalizasyonlarını (sol panel) görselleştirir. Ayrıca, her yörüngenin yoğunlukları, FRET geçişlerini veya ağartma adımlarını tanımlamak için zaman içinde çizilebilir (orta panel sol panelden kırmızı yörüngeyi gösterir). Elde edilen FRET verimliliği ve stoichiometry benzer şekilde görselleştirilebilir (sağ panel). (C) Holliday kavşak DNA sensörünü kullanarak smFRET yörüngeleri. Ölçümler sırasında tampon olarak HBSS + 12 mM MgCl2 kullanılmıştır. Bu örneklerin sıra ucuna yakın görünür kabul edici ağartma adımı dışında, her sensör için FRET geçişlerinin sıklığı belirlenebilir. Holliday kavşakları konformasyonlarını yüksek frekansla değiştirirken, moleküler kuvvet sensörü FRET geçişleri sergilemez. Bu bilgiler, gözlemlenen geçişlerin sayısını artırmak veya azaltmak için çerçeveler arasındaki gecikme gibi deneysel koşulları ayarlamayı mümkün kılar. Kısaltmalar: FRET = Förster rezonans enerji transferi; smFRET = tek moleküllü FRET; HBSS = Hank'in dengeli tuz çözeltisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Bilgi: Tek moleküllerin lokalizasyonu ve takibi (01. Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes at JoVE.com

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Bu makalede, geniş alan floresan mikroskopisi kullanılarak mobil, tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (smFRET) tabanlı probların mekansal analizi için bir yöntem sunulmaktadır. Yeni geliştirilen yazılım araç seti, doğru FRET verimliliği ve moleküler konumlar da dahil olmak üzere hareketli probların smFRET zaman izlerinin zamanın işlevleri olarak belirlenmesini sağlar.

Mobil Tek Moleküllü FRET Problarının Otomatik İki Boyutlu Mekansal Analizi

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Yüzeye bağlı problar kullanılarak yapılan tek moleküllü FRET deneyleri, geçmişte neredeyse sadece hareketsiz moleküller üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, birçok biyomolekül yayılır ve yöntemimizle analiz edilebilir. Tek moleküllü FRET'i izleme ile birleştirmek, hareketli probların sadece FRET eksiklik zaman izlerini analiz etmeyi değil, aynı zamanda difüzyon davranışı gibi mekansal yönleri de araştırmayı mümkün kılar.Yöntemimiz çeşitli FRET tabanlı problarla uyumludur. Örneğin, canlı hücre deneylerinde moleküler kuvvetler, konformasyonsal dinamikler ve bağlayıcı kinetikler hakkında içgörüler sağlayabilir. Yüksek kaliteli tek moleküllü FRET deneylerinin gerçekleştirilmesi oldukça zordur.Güvenilir niceleme için, verilerin iyi bir sinyal-gürültü oranında ve yeterli uzunlukta tek moleküllü parçalarda kaydedilmesi önemlidir. Örnek ölçümüne başlamak için, kamerayı tetiklerken uygun bir aydınlatma süresi için donör ve alıcı floroforlarını heyecanlandırın ve kamera okuması etkinleştirilene kadar bekleyin. Donör ve kabul eden floroforların ekscitasyonunu alternatif olarak tekrarlayın.Tek moleküllü sinyalleri agregalardan ayırt etmek için adım adım fotobleaching analizine izin veren görüş alanında prob başına en az bir floroforun fotobleachingini sağlayacak kadar büyük olacak tekrar sayısını seçin. Donör ve alıcı heyecanlandırma karelerinin yanı sıra kaydedilen görüntü dizilerinden görüntü segmentasyonu için çerçevelerin seçilmesine izin vermek için aydınlatma sırasını belirtin. Aynı zamanda, aynı aydınlatma ayarlarını kullanarak kaydedilen veri kümelerini analiz edin.Bu amaçla, her veri kümesine ilgili görüntü sırası dosya adlarıyla eşleşen bir tanımlayıcı ve desen atayın. Ayrıca, görüntü kaydı için fiducial işaretleyicilerin kayıtları, düz alan düzeltmesi için heyecan ışığı profilleri ve düzeltme faktörlerini belirlemek için isteğe bağlı olarak yalnızca donör ve yalnızca alıcı örnekleri gibi özel amaçlar için belirli veri kümeleri tanımlayın. Ardından, her iki kanal da tek bir kamera kullanılarak kaydedilmişse emisyon kanallarını ve ham görüntüleri seçin.Bunun için, donör ve kabul eden emisyon için uygun bölgeleri seçmek için uygun grafik widget'ını kullanın, ardından her iki emisyon kanalında da fiducial işaretleyicileri yerelleştirin ve görüntü kaydı gerçekleştirin. Hem donör hem de kabul eden emisyon kanalları için yerelleştirme algoritması için uygun parametreleri bulmak üzere sağlanan kullanıcı arabirimini kullanın. Daha sonra, donör ve alıcı emisyonlarından elde edilen görüntülerin toplamında donör ekscitasyonu üzerine FRET probları için tek moleküllü lokalizasyon parametrelerini ayarlayın, ardından alıcı emisyon kanalında alıcı çıkarma üzerine problar için yerelleştirme parametrelerini ayarlayın.FRET problarını donör ve alıcı çıkarma üzerine tüm çerçevelerde bağımsız olarak yerelleştirin. Sonuçlar, özgün çerçeve numarasını, iki boyutlu koordinatları ve kaynak görüntü dosyasına başvuran bir tanımlayıcıyı içeren tek bir tabloda birleştirilir. Floresan yoğunluğunu izlemek ve ölçmek için Trackpy algoritmasının FRET prob yerelleştirmelerini yörüngelere bağlaması için uygun seçenekleri belirleyin.Ardından, analiz yazılımı işlevselliğini kullanarak, görüntü dizilerinden yardımcı görüntü verilerini işleyin. Heyecanlandırma dizisinde S ile işaretlenmiş segmentasyonu kolaylaştırmak için kaydedilen ek görüntüleri ayıklayın. Son olarak, yoğun etiketli bir örnekte kaydedilen görüntülerden görüş alanındaki donör ve alıcı çıkarma ışığı profillerini belirleyin.İlk filtreleme adımları için, floresan yoğunluklarını güvenilir bir şekilde belirlemek zor olduğundan, çakışan nokta yayılma işlevlerine sahip sinyalleri atın. Ev dışı aydınlatma durumunda, iyi sinyal-gürültü oranı sağlamak için yalnızca görüş alanındaki iyi aydınlatılmış bölgelerde bulunan sinyalleri kabul edin. Intramoleküler FRET'i inceliyorsanız, analizi görüntü dizisinin başlangıcından itibaren mevcut olan yörüngelerle sınırlayın.Daha sonra, inhomojen aydınlatmanın neden olduğu konuma bağlı floresan yoğunluğu varyasyonlarını tersine çevirmek için daha önce elde edilen heyecan verici ışık kaynağı profillerini kullanan düz alan düzeltmesini yürütün, ardından görünür FRET verimliliğini ve görünür stoichiometry'yi hesaplanın. Tek moleküler problar ve agregalar arasında ayrım yapmak için fotobleachingin adım adım analizini yapmak için, donör ve alıcı ekscitasyonu üzerine değişiklik noktası algılama algoritması için uygun parametreleri bağımsız olarak bulun. Ardından değişiklik noktası algılama algoritmasını çalıştırın.Belirsiz fotobleaching davranışını gösteren parçayı kaldırmak için, aşağıda bir floroforun ağartılmış olarak kabul edildiği yoğunluk eşiklerini tanımlayın ve aşağıdaki seçeneklerden birini seçin. Birinci seçenek, alıcı floroforun tek bir adımda ağarttığı ve donörün kısmi ağartma gösterdiği yerdir. İkinci seçenek, donörün tek bir adımda ağarttığı, kısmi kabul edici ağartma olmadığı yer.Üçüncü seçenek, floroforun tek bir adımda ağarttığı, diğerinin ise kısmen ağarttığı yerdir. Ve dördüncü seçenek, donör ve kabul eden floroforların tek adımlı fotobleaching gösterdiği veya hiç fotobleaching göstermediği yer. Daha sonra bağışçı emisyonu sızıntısı için düzeltme faktörlerini alıcı kanala, doğrudan kabul edenin çıkarılması, algılama verimlilikleri ve heyecan verici verimlilikleri hesaplayın.Daha sonra, FRET verimliliğini belirgin verimlilikten ve stoichiometry'den belirgin stoichiometry'den hesaplamak için düzeltme faktörlerini kullanın. Daha fazla filtreleme için, her yörüngedeki ilk ağartma olayından önce yalnızca veri noktalarını seçin. Ayrıca, analizi tek moleküllü problarla sınırlamak için, yalnızca uygun stoichiometry sınırları içinde veri noktalarının en az% 75'ine sahip yörüngeleri kabul edin.Ardından, analizi görünüm alanındaki farklı bölgelerle sınırlamak için uygun yardımcı görüntülerde genel veya uyarlanabilir eşikleme yöntemleriyle görüntü segmentasyonu gerçekleştirin. Yanlış stoichiometry sinyallerinin doğru şekilde tanımlandığını ve kaldırıldığını doğrulamak için stoichiometry çizimlerine karşı verimlilik oluşturun. Daha sonra FRET verimlilik dağılımlarına iyi bir genel bakış sağlamak için FRET verimlilik histogramlarını çizin ve farklı deneylerden elde edilen sonuçların uygun karşılaştırması için histogramları gruplandırın.Bilimsel Python kitaplıklarından yararlanarak, not defteri içindeki verileri daha fazla değerlendirmek, örneğin difüzyon analizi yapmak mümkündür. Tek moleküllü FRET olayının görselleştirilmesi ve izlenmesi burada gösterilmiştir. Filtrelenmiş FRET olayları, FRET verimlilik histogramındaki stoichiometry arazilerine karşı verimlilikle temsil edilir.Ayrıca, hareketlilik parametreleri bir XY arsasında veya ortalama bir kare yer değiştirme grafiğinde tek bir yörünge yolu çizilerek araştırılabilir. Platformumuzun çıktısı, mobil probların FRET verimlilik süresi izlemelerindeki geçişleri daha fazla tanımlamamızı sağlar. Örneğin, biyomoleküllerin konformasyonel değişikliklerini değerlendirmek için.FRET tabanlı bir kuvvet sensörü kullanarak, analiz platformu erken T hücre sinyali sırasında immünolojik sinaps içindeki tek moleküllü kuvvet olaylarını ölçmemize izin verdi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Kantitatif SENP1 Proteaz Kinetik Belirlenmesi (Förster rezonans enerji transferi) Analizi FRET

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Kardiyak İlaç güvenlik Taraması için insan mühendisliği kalp dokusunun Otomatik Büzülme Analizi

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...