Name: quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies
Uploaded: 2022-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies at JoVE.com

Vi takker Carlos Mas, María Pilar Crespo og Cecilia Sampedro fra CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) for hjælp til konfokal mikroskopi, til Soledad Miró og Victoria Blanco for dedikeret dyrepleje og Laura Gatica for histologisk bistand. Vi takker også Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication of FCQ) for videoproduktion og udgave og Paul Hobson for hans kritiske læsning og sprog revision af manuskriptet.
Denne artikel er finansieret af tilskud fra Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alt til M.C.S.).

C57BL/6J mus blev håndteret i henhold til retningslinjerne i ARVO erklæring om brug af dyr i oftalmiske og Vision Research. Forsøgsprocedurerne blev udformet og godkendt af Det Institutionelle Udvalg for Dyrepleje og Anvendelse (CICUAL) ved Det Kemiske Fakultet, Córdobas nationale universitet (Res. HCD 1216/18).
1. Udarbejdelse af bufferløsninger og reagenser
<ol><li>Fremstilling af 1x fosfatbuffer saltvand (PBS): Tilsæt 8 g natriumchlorid (NaCl), 0,2 g kaliumchlorid (...

<ol>
	<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease.">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li><li>McDougal, D. H., Gamlin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+control+of+the+eye.">Autonomic control of the eye.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).</li><li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease.">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+alterations+in+the+retinal+microvasculature,+microcirculation,+and+microstructure.">Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).</li><li>Lavia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vessel+density+in+the+superficial+and+deep+plexuses+in+diabetic+retinopathy+is+associated+with+structural+changes+in+corresponding+retinal+layers.">Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers.</a> PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).</li><li>Rosenblatt, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+in+a+rigorous+longitudinal+image-based+assessment+of+retinopathy+of+prematurity.">Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).</li><li>Edwards, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Funduscopic+examination+of+patients+with+diabetes+who+are+admitted+to+hospital.">Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital.</a> Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).</li><li>Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+associated+with+diabetic+retinopathy.">The pathology associated with diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 7-14 (2017).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=angiography+metrics+predict+progression+of+diabetic+retinopathy+and+development+of+diabetic+macular+edema:+A+prospective+study.">angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study.</a> Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+coherence+tomography+angiography+of+vascular+abnormalities+in+the+living+human+eye.">Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).</li><li>Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+vascular+changes+in+macular+telangiectasia+type+2:+comparison+between+SD-OCT+and+OCT+angiography.">Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).</li><li>Gammons, M. V., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+oxygen+induced+retinopathy+in+rodents.">Models of oxygen induced retinopathy in rodents.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-203a-3p+inhibits+retinal+angiogenesis+and+alleviates+proliferative+diabetic+retinopathy+in+oxygen-induced+retinopathy+(OIR)+rat+model+via+targeting+VEGFA+and+HIF-1&#945;.">MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1&#945;.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).</li><li>Paz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+syndrome+triggered+by+fructose+diet+impairs+neuronal+function+and+vascular+integrity+in+ApoE-KO+mouse+retinas:+Implications+of+autophagy+deficient+activation.">Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li><li>Zarb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ossified+blood+vessels+in+primary+familial+brain+calcification+elicit+a+neurotoxic+astrocyte+response.">Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response.</a> Brain. 142 (4), 885-902 (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+autophagy+modulators+on+vascular,+glial,+and+neuronal+alterations+in+the+oxygen-induced+retinopathy+mouse+model.">Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).</li><li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye.">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li><li>Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+mouse+model+of+oxygen-induced+retinopathy.">Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy.</a> Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).</li><li>Guaiquil, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+retinopathy+of+prematurity+identifies+endothelial+cell+proliferation+as+a+potential+mechanism+for+plus+disease.">A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).</li><li>Mezu-Ndubuisi, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+angiography+quantifies+oxygen-induced+retinopathy+vascular+recovery.">In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery.</a> Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).</li><li>Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+vascular+tortuosity+as+an+early+outcome+measure+in+oxygen+induced+retinopathy+(OIR).">Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR).</a> Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microvascular+density+and+morphology+in+diabetic+retinopathy+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography+angiography.">Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 362 (2016).</li><li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ocular+angiogenesis:+from+development+to+pathologies.">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+diabetic+retinopathy:+Contribution+and+limitations+of+laboratory+research.">Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research.</a> Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).</li><li>Lorenc, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1R+regulates+the+extracellular+level+of+active+MMP-2,+pathological+neovascularization,+and+functionality+in+retinas+of+OIR+mouse+model.">IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model.</a> Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).</li><li>Ma, N., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+microglia+as+passenger+leukocytes+to+the+fate+of+intraocular+neuronal+retinal+grafts.">Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).</li><li>Mazzaferri, J., Larriv&#233;e, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+machine+learning+approach+for+automated+assessment+of+retinal+vasculature+in+the+oxygen+induced+retinopathy+model.">A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).</li><li>Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+in+3D:+quantification+of+vascular+growth+and+remodeling.">The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+indirect+contact+coculture+decrease+integrity+of+inner+blood-retina+barrier+model+in+vitro+by+upgrading+MMP-2/9+activity.">Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity.</a> Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).</li><li>Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDF-deficient+mice+exhibit+an+enhanced+rate+of+retinal+vascular+expansion+and+are+more+sensitive+to+hyperoxia-mediated+vessel+obliteration.">PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).</li><li>Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+D-amino+acid+oxidase+prevents+retinal+neurovascular+pathologies+in+diabetic+rats.">Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats.</a> Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).</li></ol>

Dyremodeller af retinopatier er kraftfulde værktøjer til at studere vaskulær udvikling, ombygning eller patologisk angiogenese. Succesen af disse undersøgelser på området afhænger af den nemme adgang til vævet, der gør det muligt at udføre en bred vifte af teknikker, der giver data fra in vivo og postmortem mice26,27. Desuden er der fundet stor korrelation mellem in vivo-undersøgelser og klinisk analyse, hvilket giver solid s...

Øjnene næres af to arterio-venøse system: choroidal vaskulatur, et eksternt vaskulært netværk, der vander retinal pigmenteret epitel og fotoreceptorer; og neuro-retinal vaskulatur, der vander ganglion celler lag og det indre nukleare lag af nethinden1. Den retinale vaskulatur er et organiseret netværk af fartøjer, der leverer næringsstoffer og ilt til retinale celler og høste affaldsprodukter for at sikre korrekt visuel signalering transduktion. Denne vaskulatur har nogle forskellige funktioner, herunder: manglen på autonome innervation, regulering af vaskulær tone ved iboende retinale mekanismer og besiddelse af en kompleks retinal-blod barriere2. Derfor har retinal vaskulatur været i fokus for mange forskere, der i vid udstrækning har studeret ikke kun vasculogenese under udviklingen, men også de ændringer og den patologiske angiogenese, som disse fartøjer gennemgår i sygdomme3. De mest almindelige vaskulære ændringer observeret i retinopatier er fartøjsudvidelse, neovascularization, tab af vaskulær arborisering og deformation af de retinale hovedbeholdere, hvilket gør dem mere ziggaggy4,5,6. En eller flere af de beskrevne ændringer er de tidligste tegn, der skal opdages af klinikere. Vaskulær visualisering giver en hurtig, ikke-invasiv og billig screeningsmetode7. Den omfattende undersøgelse af de ændringer, der observeres i det vaskulære træ, vil afgøre, om retinopatien er ikke-proliferativ eller proliferativ og den videre behandling. De ikke-proliferative retinopatier kan manifestere sig med afvigende vaskulær morfologi, nedsat vaskulær tæthed, acellulære kapillærer, pericytter død, makulaødem, blandt andre. Hertil kommer, proliferative retinopatier også udvikle øget vaskulær permeabilitet, ekstracellulære remodeling, og dannelsen af vaskulære totter mod glaslegeme hulrum, der let nedbryde eller fremkalde nethinde løsrivelse8.
Når det er opdaget, retinopati kan overvåges gennem sine vaskulære ændringer9,10. Patologiens progression kan følges gennem de strukturelle ændringer af fartøjerne, som klart definerer stadier af sygdommen11. Kvantificeringen af vaskulære ændringer i disse modeller gjorde det muligt at korrelere fartøjsændringer og neuronal død og teste farmakologiske behandlinger for patienter i forskellige faser af sygdommen.
I lyset af ovenstående udsagn mener vi, at anerkendelse og kvantificering af vaskulære ændringer er grundlæggende i retinopatier undersøgelser. I dette arbejde vil vi vise, hvordan man måler forskellige vaskulære parametre. For at gøre det vil vi anvende to dyremodeller. En af dem er oxygen-induceret retinopati mus model12, som efterligner Retinopati af Præmaturitet og nogle aspekter af proliferative diabetisk Retinopati13,14. I denne model vil vi måle avaskulære områder, neovaskulære områder og udvidelse og tortuositet af hovedfartøjer. I vores laboratorium er der udviklet en metabolisk syndrom (MetS) musemodel, som fremkalder en ikke-proliferativ retinopati15. Her vil vi evaluere vaskulær tæthed og forgrening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminuim foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4503</td>
			<td>quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>9632.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope FV1200</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td>with motorized plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covers</td>
			<td>Paul Marienfeld GmnH &#38; Co.</td>
			<td>111520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>119753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L&#160; tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z316121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA5201090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker GyroMini</td>
			<td>LabNet International</td>
			<td>S0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>SANXIN</td>
			<td>PHS-3D-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Analysis Fiji software</td>
			<td>Mai Elfarnawany</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Vessel_Analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies

Retinopatier er en heterogen gruppe af sygdomme, der påvirker det neurosensoriske væv i øjet. De er karakteriseret ved neurodegeneration, glioose og en progressiv ændring i vaskulær funktion og struktur. Selvom retinopatiernes begyndelse er karakteriseret ved subtile forstyrrelser i visuel opfattelse, er ændringerne i vaskulær plexus de første tegn, der opdages af klinikere. Fraværet eller tilstedeværelsen af neovascularization bestemmer, om retinopatien er klassificeret som enten ikke-proliferativ (NPDR) eller proliferativ (PDR). I denne forstand forsøgte flere dyremodeller at efterligne specifikke vaskulære træk ved hvert trin for at bestemme de underliggende mekanismer, der er involveret i endotelændringer, neuronal død og andre begivenheder, der finder sted i nethinden. I denne artikel vil vi give en komplet beskrivelse af de procedurer, der kræves til måling af retinale vaskulære parametre hos voksne og tidlige fødselsmus på postnatal dag (P)17. Vi vil detaljer protokollerne til at udføre retinal vaskulær farvning med Isolectin GSA-IB4 i hele mounts til senere mikroskopisk visualisering. Vigtige trin til billedbehandling med Image J Fiji-software leveres også, derfor vil læserne være i stand til at måle fartøjstæthed, diameter og tortuositet, vaskulær forgrening samt avaskulære og neovaskulære områder. Disse værktøjer er meget nyttige til at evaluere og kvantificere vaskulære ændringer i både ikke-proliferative og proliferative retinopatier.

Som beskrevet i protokolafsnittet, fra en enkelt fluorescerende farvning assay kan du få vaskulær morfologi og evaluere flere parametre af interesse kvantitativt. Søgningen af en specifik ændring vil afhænge af den type retinopati undersøgt. I denne artikel blev avaskulære og neovaskulære områder, tortuositet og dilatation evalueret i en musemodel af proliferativ retinopati, mens vaskulær forgrening og tæthed blev analyseret i en MetS-musemodel, hvilket fremkalder en ikke-proliferativ retinopati.
<p class=...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies at JoVE.com

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Denne artikel beskriver en veletableret og reproducerbar lectin plet assay for hele mount retinal præparater og de protokoller, der kræves for den kvantitative måling af vaskulære parametre ofte ændret i proliferative og ikke-proliferative retinopatier.

Kvantificering af vaskulære parametre i hele Mount Retinas af mus med ikke-proliferative og proliferative retinopatier

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

I retinopatier er vaskulære ændringer det første tegn, der opdages af klinikere. De følger sygdommens progression, og de vælger en behandling i henhold til disse ændringer. Flere dyremodeller er blevet udviklet for at studere forskellige stadier af patologien.I dette arbejde vil vi vise, hvordan man måler forskellige vaskulære ændringer. Til det formål vil vi anvende to dyremodeller. En af disse er oxygen-induceret retinopati mus model, som gengiver retinopati af præmaturitet og nogle aspekter af den proliferative diabetisk retinopati.Her skal vi måle avaskulære områder, neovaskulære områder og dilatationen og tortuositeten af arterierne. I vores laboratorium blev der udviklet en metabolisk syndrom musemodel, som fremkalder en ikke-proliferativ retinopati. Vaskulær tæthed og forgrening blev evalueret i dette arbejde.På mus offer, indsucleatisere med en saks. Fix enucleated øjne med frisklavet paraformaldehyd i en time ved stuetemperatur. Under dissekeremikroskopet fjernes hornhinder med en saks ved at skære langs limbus og dissekere hele nethinden.Kassér det forreste segment af øjet, og adskil derefter nethinden fra RPE-choroiden. Placer nethinden i 200 mikroliter rør. Derefter blokere og permeabilize nethinden i 100 mikroliter af TBS indeholder 5% kvæg serum albumin Triton i løbet af seks timer ved fire grader med blid agitation i shaker.Vend derefter røret for at placere nethinden i koppen og fjern blokeringsopløsningen med pipette. Der tilsættes 100 mikroliteropløsning, der indeholder isolectin. Wrap rørene med aluminiumsfolie for at beskytte prøver mod lys.Inkuber nethinden med lectinopløsning natten over ved fire grader med blid agitation i shaker. Vask nethinden med 100 mikroliter tbs-Triton i 20 minutter med blid agitation i shaker. Gentag dette trin tre gange.Placer nethinden i et dias og tilføje en dråbe PBS. Under dissekere mikroskop, udføre fire lige så fjerne nedskæringer fra kanterne af nethinden mod synsnerven. For at udfolde kronbladene på nethinden skal du bruge sammentak eller små stykker filterpapir.Sørg for, at fotoreceptorsiden vender nedad. Fjern den resterende PBS fra diaset med filterpapir. Tilsæt derefter en monteringsmedian og coverlip.Lad det tørre i en time ved stuetemperatur. Opbevar dias ved fire grader beskyttet mod lys. Ved det konfokale mikroskop skal du placere diaset i pladen med forsiden nedad.Fokuser den overlegne plexus af retinal vaskulatur og vælg et område for at starte billedet erhvervelse. Angiv generelle laserparametre i softwaren. Angiv koordinaterne i X-, Y- og Z-akser.Initialiser scanningen. Når scanningsprocessen er færdig, skal du åbne billedet og gemme det med en foretrukken udvidelse. Gå til menulinjen i ImageJ FIJI-softwaren, og klik på Åbn.Vælg det billede, der skal behandles. Vælg Vis OME-XML-metadata i vinduet Importindstilling for bioformater, og klik på OK.In vinduet OME-metadata, søg efter oplysninger om pixelstørrelse. Kopier disse data.Gå til menulinjen og vælg Egenskaber for billede ved billedkalibrering. Kopier oplysningerne, og klik på OK. Tildel et foretrukket lut til billedet. Hvis du vil visualisere alle stakke i et enkelt billede, skal du gå til menulinjen og vælge Billede, Stakke, Z Project.Vælg alle de stakke, hvor fartøjer visualiseres, i det viste projektionsvindue. Vælg Gennemsnitlig intensitet i projektionstype, og klik på OK. Gå til menulinjen, Billedet, Juster, Lysstyrke/Kontrast. Klik på Anvend og gem ændringer.Kopier de parametre, der er valgt for lysstyrke og kontrast. Disse skal være identiske for alle billeder. Vælg værktøjet Wand i menulinjen.Vælg det retinale område, der mangler dannede fartøjer. Tryk på T på tastaturet for at registrere de udvalgte områder i ROI Manager. Klik på Målpunkt i ROI Manager for at få oplysninger om det avaskulære område.Gentag disse trin for at måle det samlede område af nethinden. Vælg værktøjet Wand i menulinjen. Zoom ind på billedet for bedre at visualisere neovessels.Vælg neovessels en efter en med Wand-værktøjet. Tryk på T-bogstavet på tastaturet for at optage det markerede område i ROI Manager. Klik på Målpunkt i ROI Manager for at hente områdedataene.Vælg værktøjet Lige linje på menulinjen. Zoom ind på billedet for bedre at visualisere karvæggen. Udfør tre tværgående linjer til hovedfartøjet før den første gren.Tryk på T på tastaturet for at registrere de markerede områder i ROI Manager. Klik på Målpunkt i ROI Manager for at hente afstandsdataene. Klik på ikonet Lige linje med musens højre knap på menulinjen, og vælg Segmenteret linje.Tegn en linje inde i fartøjet fra synsnerven indtil det første fartøj forgrening, efter vaskulær form. Tryk på T-bogstavet på tastaturet for at optage det markerede område i ROI Manager. Vælg værktøjet Lige linje på menulinjen.Tegn en linje fra synsnerven, indtil det første fartøj forgrer. Tryk på T-bogstavet på tastaturet for at optage det markerede område i ROI Manager. Klik på Mål på ROI Manager for at få fjerndataene.Med menulinjens ovale værktøj defineres et område, der anvendes ligeligt på alle eksperimentelle forhold. Det valgte område skal være en koncentrisk cirkel tegnet rundt om synsnerven. Tryk på T-bogstavet på tastaturet for at optage det markerede område i ROI Manager.Optællingen af antallet af primære grene, der stammer fra hovedfartøjer inden for udvælgelsesområdet. Transformer billedet til 8-bit tilstand. Gå til Plugins i menulinjen, vælg Fartøjsanalyse, Vaskulær tæthed.Definer et område med værktøjet Square på menulinjen, hvor du vil måle kartætheden. Klik på OK. Der vises et nyt vindue med de nødvendige oplysninger. I det første eksperimentelle eksempel blev den iltinducerede retinopatimusmodel anvendt.Intravitreale injektioner blev udført på postnatal dag 12 for at bestemme effektiviteten af et lægemiddel som en antiangiogen. Mus injiceret med køretøjet blev anvendt som kontrol. De avaskulære områder er defineret som de zoner, der mangler retinale blodkar.Fra de erhvervede billeder kan avaskulære områder kvantificeres som summen af regionerne uden fartøjer opdelt det samlede areal af nethinden. Områder med mekaniske skader viser også fravær af fartøjer. For at identificere beskadigede områder skal du analysere integriteten af neuronale lag med Hoechst-plet.Neovessels er små kaliber fartøjer, der stammer fra allerede eksisterende fartøjer af den overlegne vaskulære plexus. Vi beregnede det areal, der er besat af neovessels'tufts ved at kvantificere det neovaskulære område af nethinden besat af det samlede område af nethinden. Da neovessels'form og størrelse er variabel, kan de lejlighedsvis ligne snavs og artefakter.For at skelne neovessels skal du kontrollere, at tuft vokser fra et modent fartøj. Til analyse af dilatationen målte vi hovedbeholderdiameteren i tre højder før den første gren. Forskere skal definere en forudbestemt afstand til at måle fartøjets diameter for at reducere variationen blandt resultaterne.Ideelt set bør det fjerneste punkt fra synsnerven være omkring 300 mikrometer. Vi foreslår at udføre analysen, og senere, gennemsnit på mindst seks dyr pr betingelse. Med hensyn til tortuositet måler vi den afstand, som hovedfartøjet tilbagelagte efter dets form, med hensyn til den lige linje mellem synsnerven og det første forgreningspunkt.Som vi kan se på billedet, er der heterogenitet i sinuosity af hovedfartøjer. For at opnå et repræsentativt resultat skal mindst seks mus pr. tilstand kvantificeres. De seneste parametre, vaskulær forgrening og tæthed, blev analyseret i en metabolisk syndrom model udviser ikke-proliferative retinopati.Til måling af vaskulær forgrening definerede vi kvantificeringsområdet ved at tegne en koncentrisk cirkel, og så talte vi en efter en de primære grene, der stammer fra et hovedcentralfartøj. Fra de erhvervede billeder blev den vaskulære tæthed kvantificeret som det areal, der var besat af fartøjer divideret med ROI-området, som var placeret forskellige steder i hvert mikrofotograf. Undgå at kvantificere områder med mekaniske skader.Hvis der er mere end to områder med punkteringer, skal nethinden kasseres. Sammenfattende har vi i denne artikel vist klassiske, veletablerede og reproducerbare teknikker til at kvantificere nogle af de mest relevante parametre under hensyntagen til den kliniske praksis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissektion og Immunhistokemi af Larvernes, Pupal og Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; Nethinder

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hele Mount immunolabeling af olfaktoriske receptor neuroner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Hele-mount Imaging af museembryo Sensory Axon Fremskrivninger

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

Hele Mount Mærkning af Cilia i Main Olfaktoriske System af mus

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidige<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functional Test af to nethinder af<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hele Mount Dissektion og Immunofluorescens af Voksen Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV-medieret transgene ekspression af kimære konstruktioner at undersøge adfærdsmæssige funktion GPCR heteromerer i mus

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En simpel en-trin Dissektion Protokol for Whole-mount Forberedelse af Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...