Name: quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies
Uploaded: 2022-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies at JoVE.com

We danken Carlos Mas, María Pilar Crespo en Cecilia Sampedro van CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentinië) voor hulp bij confocale microscopie, aan Soledad Miró en Victoria Blanco voor toegewijde dierenverzorging en Laura Gatica voor histologische hulp. We danken ook Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication van FCQ) voor de videoproductie en -editie en Paul Hobson voor zijn kritische lezing en taalrevisie van het manuscript.
Dit artikel werd gefinancierd door subsidies van Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (allemaal naar M.C.S.).

C57BL/6J-muizen werden behandeld volgens de richtlijnen van de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek. Experimentele procedures werden ontworpen en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (CICUAL) van de Faculteit chemische Wetenschappen, Nationale Universiteit van Córdoba (Res. HCD 1216/18).
1. Bereiding van bufferoplossingen en reagentia
<ol><li>Bereiding van 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS): Voeg 8 g natr...

<ol>
	<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease.">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li><li>McDougal, D. H., Gamlin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+control+of+the+eye.">Autonomic control of the eye.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).</li><li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease.">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+alterations+in+the+retinal+microvasculature,+microcirculation,+and+microstructure.">Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).</li><li>Lavia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vessel+density+in+the+superficial+and+deep+plexuses+in+diabetic+retinopathy+is+associated+with+structural+changes+in+corresponding+retinal+layers.">Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers.</a> PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).</li><li>Rosenblatt, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+in+a+rigorous+longitudinal+image-based+assessment+of+retinopathy+of+prematurity.">Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).</li><li>Edwards, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Funduscopic+examination+of+patients+with+diabetes+who+are+admitted+to+hospital.">Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital.</a> Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).</li><li>Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+associated+with+diabetic+retinopathy.">The pathology associated with diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 7-14 (2017).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=angiography+metrics+predict+progression+of+diabetic+retinopathy+and+development+of+diabetic+macular+edema:+A+prospective+study.">angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study.</a> Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+coherence+tomography+angiography+of+vascular+abnormalities+in+the+living+human+eye.">Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).</li><li>Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+vascular+changes+in+macular+telangiectasia+type+2:+comparison+between+SD-OCT+and+OCT+angiography.">Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).</li><li>Gammons, M. V., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+oxygen+induced+retinopathy+in+rodents.">Models of oxygen induced retinopathy in rodents.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-203a-3p+inhibits+retinal+angiogenesis+and+alleviates+proliferative+diabetic+retinopathy+in+oxygen-induced+retinopathy+(OIR)+rat+model+via+targeting+VEGFA+and+HIF-1&#945;.">MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1&#945;.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).</li><li>Paz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+syndrome+triggered+by+fructose+diet+impairs+neuronal+function+and+vascular+integrity+in+ApoE-KO+mouse+retinas:+Implications+of+autophagy+deficient+activation.">Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li><li>Zarb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ossified+blood+vessels+in+primary+familial+brain+calcification+elicit+a+neurotoxic+astrocyte+response.">Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response.</a> Brain. 142 (4), 885-902 (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+autophagy+modulators+on+vascular,+glial,+and+neuronal+alterations+in+the+oxygen-induced+retinopathy+mouse+model.">Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).</li><li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye.">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li><li>Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+mouse+model+of+oxygen-induced+retinopathy.">Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy.</a> Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).</li><li>Guaiquil, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+retinopathy+of+prematurity+identifies+endothelial+cell+proliferation+as+a+potential+mechanism+for+plus+disease.">A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).</li><li>Mezu-Ndubuisi, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+angiography+quantifies+oxygen-induced+retinopathy+vascular+recovery.">In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery.</a> Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).</li><li>Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+vascular+tortuosity+as+an+early+outcome+measure+in+oxygen+induced+retinopathy+(OIR).">Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR).</a> Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microvascular+density+and+morphology+in+diabetic+retinopathy+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography+angiography.">Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 362 (2016).</li><li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ocular+angiogenesis:+from+development+to+pathologies.">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+diabetic+retinopathy:+Contribution+and+limitations+of+laboratory+research.">Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research.</a> Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).</li><li>Lorenc, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1R+regulates+the+extracellular+level+of+active+MMP-2,+pathological+neovascularization,+and+functionality+in+retinas+of+OIR+mouse+model.">IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model.</a> Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).</li><li>Ma, N., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+microglia+as+passenger+leukocytes+to+the+fate+of+intraocular+neuronal+retinal+grafts.">Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).</li><li>Mazzaferri, J., Larriv&#233;e, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+machine+learning+approach+for+automated+assessment+of+retinal+vasculature+in+the+oxygen+induced+retinopathy+model.">A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).</li><li>Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+in+3D:+quantification+of+vascular+growth+and+remodeling.">The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+indirect+contact+coculture+decrease+integrity+of+inner+blood-retina+barrier+model+in+vitro+by+upgrading+MMP-2/9+activity.">Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity.</a> Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).</li><li>Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDF-deficient+mice+exhibit+an+enhanced+rate+of+retinal+vascular+expansion+and+are+more+sensitive+to+hyperoxia-mediated+vessel+obliteration.">PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).</li><li>Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+D-amino+acid+oxidase+prevents+retinal+neurovascular+pathologies+in+diabetic+rats.">Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats.</a> Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).</li></ol>

Diermodellen van retinopathieën zijn krachtige hulpmiddelen voor het bestuderen van vasculaire ontwikkeling, remodellering of pathologische angiogenese. Het succes van deze studies in het veld is afhankelijk van de gemakkelijke toegang tot het weefsel dat het mogelijk maakt om een breed scala aan technieken uit te voeren, waarbij gegevens van in vivo en postmortale muizen worden verstrekt26,27. Bovendien is er een grote correlatie gevonden tuss...

De ogen worden gevoed door twee arterio-veneuze systemen: de choroïdale vasculatuur, een extern vasculair netwerk dat retinaal gepigmenteerd epitheel irrigeert en fotoreceptoren; en de neuro-retinale vasculatuur die de ganglioncellenlaag irrigeert en de binnenste nucleaire laag van het netvlies1. De retinale vasculatuur is een georganiseerd netwerk van bloedvaten die voedingsstoffen en zuurstof leveren aan de retinale cellen en afvalproducten oogsten om een goede visuele signaaltransductie te garanderen. Deze vasculatuur heeft een aantal onderscheidende kenmerken, waaronder: het ontbreken van autonome innervatie, de regulatie van de vasculaire tonus door intrinsieke retinale mechanismen en het bezit van een complexe retinale bloedbarrière2. Daarom is retinale vasculatuur de focus geweest van veel onderzoekers die niet alleen vasculogenese tijdens de ontwikkeling uitgebreid hebben bestudeerd, maar ook de veranderingen en de pathologische angiogenese die deze bloedvaten ondergaan bij ziekten3. De meest voorkomende vasculaire veranderingen waargenomen bij retinopathieën zijn vaatdilatatie, neovascularisatie, verlies van vasculaire arborisatie en vervorming van de retinale hoofdvaten, waardoor ze meer ziggaggy worden4,5,6. Een of meer van de beschreven veranderingen zijn de vroegste tekenen die door clinici worden gedetecteerd. Vasculaire visualisatie biedt een snelle, niet-invasieve en goedkope screeningsmethode7. De uitgebreide studie van de waargenomen veranderingen in de vasculaire boom zal bepalen of de retinopathie niet-proliferatief of proliferatief is en de verdere behandeling. De niet-proliferatieve retinopathieën kunnen zich manifesteren met afwijkende vasculaire morfologie, verminderde vasculaire dichtheid, acellulaire haarvaten, pericytendood, macula-oedeem, onder anderen. Bovendien ontwikkelen proliferatieve retinopathieën ook een verhoogde vasculaire permeabiliteit, extracellulaire remodellering en de vorming van vasculaire plukjes naar de glasvochtholte die gemakkelijk afbreken of netvliesloslating veroorzaken8.
Eenmaal gedetecteerd, kan de retinopathie worden gecontroleerd door middel van zijn vasculaire veranderingen9,10. De progressie van de pathologie kan worden gevolgd door de structurele veranderingen van de bloedvaten, die duidelijk de stadia van de ziekte definiëren11. De kwantificering van vasculaire veranderingen in deze modellen maakte het mogelijk om vaatveranderingen en neuronale dood te correleren en farmacologische therapieën te testen voor patiënten in verschillende fasen van de ziekte.
In het licht van de bovenstaande verklaringen zijn wij van mening dat de herkenning en kwantificering van vasculaire veranderingen fundamenteel zijn in retinopathieënstudies. In dit werk zullen we laten zien hoe verschillende vasculaire parameters kunnen worden gemeten. Daarvoor gebruiken we twee diermodellen. Een daarvan is het zuurstofgeïnduceerde retinopathiemuismodel12, dat retinopathie van prematuriteit en sommige aspecten van proliferatieve diabetische retinopathie nabootst13,14. In dit model meten we avasculaire gebieden, neovasculaire gebieden en de dilatatie en tortuositeit van hoofdvaten. In ons laboratorium is een metabool syndroom (MetS) muismodel ontwikkeld, dat een niet-proliferatieve retinopathie induceert15. Hier zullen we de vasculaire dichtheid en vertakking evalueren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminuim foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4503</td>
			<td>quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>9632.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope FV1200</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td>with motorized plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covers</td>
			<td>Paul Marienfeld GmnH &#38; Co.</td>
			<td>111520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>119753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L&#160; tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z316121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA5201090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker GyroMini</td>
			<td>LabNet International</td>
			<td>S0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>SANXIN</td>
			<td>PHS-3D-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Analysis Fiji software</td>
			<td>Mai Elfarnawany</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Vessel_Analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies

Retinopathieën zijn een heterogene groep ziekten die het neurosensorische weefsel van het oog aantasten. Ze worden gekenmerkt door neurodegeneratie, gliose en een progressieve verandering in vasculaire functie en structuur. Hoewel het begin van de retinopathieën wordt gekenmerkt door subtiele verstoringen in de visuele waarneming, zijn de wijzigingen in de vasculaire plexus de eerste tekenen die door clinici worden gedetecteerd. De afwezigheid of aanwezigheid van neovascularisatie bepaalt of de retinopathie wordt geclassificeerd als niet-proliferatief (NPDR) of proliferatief (PDR). In die zin probeerden verschillende diermodellen specifieke vasculaire kenmerken van elke fase na te bootsen om de onderliggende mechanismen te bepalen die betrokken zijn bij endotheelveranderingen, neuronale dood en andere gebeurtenissen die plaatsvinden in het netvlies. In dit artikel zullen we een volledige beschrijving geven van de procedures die nodig zijn voor het meten van retinale vasculaire parameters bij volwassenen en vroeggeboorte muizen op postnatale dag (P) 17. We zullen de protocollen beschrijven om retinale vasculaire kleuring uit te voeren met Isolectine GSA-IB4 in hele mounts voor latere microscopische visualisatie. Belangrijke stappen voor beeldverwerking met Image J Fiji-software worden ook verstrekt, daarom kunnen de lezers de vaatdichtheid, diameter en tortuositeit, vasculaire vertakking, evenals avasculaire en neovasculaire gebieden meten. Deze hulpmiddelen zijn zeer nuttig om vasculaire veranderingen in zowel niet-proliferatieve als proliferatieve retinopathieën te evalueren en te kwantificeren.

Zoals beschreven in de protocolsectie, kunt u uit een enkele fluorescerende kleuringstest de vasculaire morfologie verkrijgen en verschillende parameters van belang kwantitatief evalueren. Het zoeken naar een specifieke verandering zal afhangen van het type retinopathie dat wordt bestudeerd. In dit artikel werden avasculaire en neovasculaire gebieden, tortuositeit en dilatatie geëvalueerd in een muismodel van proliferatieve retinopathie, terwijl de vasculaire vertakking en dichtheid werden geanalyseerd in een MetS-muism...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies at JoVE.com

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Dit artikel beschrijft een gevestigde en reproduceerbare lectinevlekkentest voor de gehele retinale preparaten van mount en de protocollen die nodig zijn voor de kwantitatieve meting van vasculaire parameters die vaak worden gewijzigd in proliferatieve en niet-proliferatieve retinopathieën.

Kwantificering van vasculaire parameters in whole mount retinas van muizen met niet-proliferatieve en proliferatieve retinopathieën

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

Bij retinopathieën zijn vasculaire veranderingen het eerste teken dat door clinici wordt gedetecteerd. Ze volgen de progressie van de ziekte en ze kiezen een behandeling op basis van deze veranderingen. Verschillende diermodellen zijn ontwikkeld om verschillende stadia van de pathologie te bestuderen.In dit werk gaan we laten zien hoe we verschillende vasculaire veranderingen kunnen meten. Daarvoor gaan we twee diermodellen inzetten. Een daarvan is het zuurstof-geïnduceerde retinopathie muismodel, dat de retinopathie van prematuriteit en sommige aspecten van de proliferatieve diabetische retinopathie reproduceert.Hier gaan we avasculaire gebieden, neovasculaire gebieden en de dilatatie en tortuositeit van de arteriolen meten. In ons laboratorium werd een muismodel met het metabool syndroom ontwikkeld, dat een niet-proliferatieve retinopathie induceert. Vasculaire dichtheid en vertakking werden in dit werk geëvalueerd.Bij muizenoffer, enucleatize met een schaar. Fixeer geëucleeerde ogen met vers bereid paraformaldehyde gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verwijder onder de ontleedmicroscoop de hoornvliezen met een schaar door langs de limbus te snijden en ontleed het hele netvlies.Gooi het voorste segment van het oog weg en scheid vervolgens het netvlies van het RPE-vaatvlies. Plaats het netvlies in 200 microliter buisjes. Blokkeer en permeabiliseer vervolgens de netvliezen in 100 microliter TBS met 5% runderserumalbumine Triton gedurende zes uur bij vier graden met zachte agitatie in shaker.Keer vervolgens de buis om om het netvlies in de beker te plaatsen en verwijder de blokkerende oplossing met pipet. Voeg 100 microliter oplossing toe die isolectine bevat. Wikkel de buizen met aluminiumfolie om monsters tegen licht te beschermen.Incubeer het netvlies met lectine-oplossing 's nachts bij vier graden met zachte agitatie in shaker. Was de netvliezen met 100 microliter TBS-Triton gedurende 20 minuten met zachte agitatie in shaker. Herhaal deze stap drie keer.Plaats het netvlies in een dia en voeg een druppel PBS toe. Voer onder de ontleedmicroscoop vier even verre sneden uit van de randen van het netvlies naar de oogzenuw. Om de bloemblaadjes van het netvlies uit te vouwen, gebruikt u een tang of kleine stukjes filterpapier.Zorg ervoor dat de fotoreceptorzijde naar beneden is gericht. Verwijder de resterende PBS van de dia met filterpapier. Voeg vervolgens een bevestigingsmediaan en coverslip toe.Laat het een uur drogen bij kamertemperatuur. Bewaar dia's op vier graden beschermd tegen licht. Plaats bij de confocale microscoop de dia in de plaat met de voorkant naar beneden.Focus de superieure plexus van de retinale vasculatuur en selecteer een gebied om de beeldverwerving te starten. Stel algemene laserparameters in de software in. Stel de coördinaten in op X-, Y- en Z-assen.Initialiseer het scannen. Zodra het scanproces is voltooid, opent u de afbeelding en slaat u deze op met een voorkeursextensie. Ga in de ImageJ FIJI-software naar de menubalk en klik op Bestand, openen.Selecteer de afbeelding die u wilt verwerken. Selecteer in het venster Optie voor importeren van bio-indelingen de optie OME-XML-metagegevens weergeven en klik OK.In het venster OME-metagegevens naar informatie over de pixelgrootte. Kopieer deze gegevens.Ga voor beeldkalibratie naar de menubalk en selecteer Afbeeldingseigenschappen. Kopieer de informatie en klik op OK. Wijs een voorkeursluit toe aan de afbeelding. Als u alle stapels in één afbeelding wilt visualiseren, gaat u naar de menubalk en selecteert u Afbeelding, Stapels, Z-project.Selecteer in het weergegeven projectievenster alle stapels waar schepen worden gevisualiseerd. Kies in Projectietype de optie Gemiddelde intensiteit en klik op OK. Ga naar de menubalk, afbeelding, aanpassen, helderheid / contrast. Klik op Wijzigingen toepassen en opslaan.Kopieer de parameters die zijn geselecteerd voor helderheid en contrast. Deze moeten voor alle afbeeldingen identiek zijn. Kies in de menubalk het gereedschap Toverstaf.Selecteer het retinale gebied dat geen gevormde vaten heeft. Druk op T op het toetsenbord om de geselecteerde gebieden in de ROI Manager vast te leggen. Klik op Meten in de ROI Manager om de avasculaire gebiedsinformatie te verkrijgen.Herhaal deze stappen om het totale gebied van het netvlies te meten. Kies in de menubalk het gereedschap Toverstaf. Zoom in op de afbeelding om neovessels beter te visualiseren.Selecteer de neovessels één voor één met het gereedschap Toverstok. Druk op de T-letter op het toetsenbord om het geselecteerde gebied in de ROI Manager vast te leggen. Klik op Meten in de ROI Manager om de gebiedsgegevens op te halen.Selecteer in de menubalk het gereedschap Rechte lijn. Zoom in op de afbeelding om de vaatwand beter te visualiseren. Voer drie transversale lijnen uit naar het hoofdvat vóór de eerste tak.Druk op T op het toetsenbord om de geselecteerde gebieden in de ROI Manager vast te leggen. Klik op Meten in de ROI Manager om de afstandsgegevens op te halen. Klik in de menubalk met de rechtermuisknop op het pictogram van het gereedschap Rechte lijn en selecteer Gesegmenteerde lijn.Trek een lijn in het vat van de oogzenuw tot de eerste vaatvertakking, volgens de vasculaire vorm. Druk op de T-letter op het toetsenbord om het geselecteerde gebied in de ROI Manager vast te leggen. Selecteer in de menubalk het gereedschap Rechte lijn.Trek een lijn van de oogzenuw tot de eerste vaatvertakking. Druk op de T-letter op het toetsenbord om het geselecteerde gebied in de ROI Manager vast te leggen. Klik op Meten in de ROI Manager om de afstandsgegevens te verkrijgen.Definieer met het gereedschap Ovaal van de menubalk een gebied dat op gelijke wijze wordt toegepast op alle experimentele omstandigheden. Het geselecteerde gebied moet een concentrische cirkel zijn die rond de oogzenuw is getekend. Druk op de T-letter op het toetsenbord om het geselecteerde gebied in de ROI Manager vast te leggen.Tel handmatig het aantal primaire vertakkingen dat voortvloeit uit hoofdvaten binnen het selectiegebied. Transformeer de afbeelding naar de 8-bits modus. Ga naar Plug-ins in de menubalk, selecteer Vessel Analysis, Vascular Density.Definieer een gebied met het gereedschap Vierkant van de menubalk waar u de vatdichtheid wilt meten. Klik op OK. Het programma geeft een nieuw venster weer met de vereiste informatie. In het eerste experimentele voorbeeld werd het oxygen-induced retinopathy mouse model gebruikt.Intravitreale injecties werden uitgevoerd op postnatale dag 12 om de effectiviteit van een geneesmiddel als antiangiogeen te bepalen. Muizen geïnjecteerd met voertuig werden gebruikt als controle. De avasculaire gebieden worden gedefinieerd als de zones zonder retinale bloedvaten.Uit de verkregen beelden kunnen avasculaire gebieden worden gekwantificeerd als de som van de regio's zonder vaten het totale gebied van het netvlies deelt. Gebieden met mechanische schade vertonen ook afwezigheid van schepen. Om beschadigde gebieden te identificeren, analyseert u de integriteit van neuronale lagen met Hoechst-vlek.Neovessels zijn kleine kaliber vaten die afkomstig zijn van reeds bestaande vaten van de superieure vasculaire plexus. We berekenden het gebied dat wordt ingenomen door de plukjes van neovessels door het neovasculaire gebied van het netvlies te kwantificeren dat wordt ingenomen door het totale gebied van het netvlies. Omdat de vorm en grootte van neovessels variabel is, kunnen ze af en toe lijken op puin en artefacten.Om neovessels te onderscheiden, controleert u of het plukje uit een volwassen vat groeit. Voor de analyse van de dilatatie hebben we de diameter van het hoofdvat gemeten op drie hoogten vóór de eerste tak. Onderzoekers moeten een vooraf bepaalde afstand definiëren om de diameter van het vat te meten om de variabiliteit tussen de resultaten te verminderen.Idealiter zou het verste punt van de oogzenuw ongeveer 300 micrometer moeten zijn. We raden aan om de analyse uit te voeren, en later, gemiddeld van ten minste zes dieren per aandoening. Met betrekking tot tortuositeit meten we de afstand die het hoofdvat aflegt volgens zijn vorm, ten opzichte van de rechte lijnafstand tussen de oogzenuw en het eerste vertakkingspunt.Zoals we in de afbeelding kunnen zien, is er heterogeniteit in de sinuositeit van de belangrijkste vaten. Om een representatief resultaat te verkrijgen, moeten niet minder dan zes muizen per aandoening worden gekwantificeerd. De nieuwste parameters, vasculaire vertakking en dichtheid, werden geanalyseerd in een metabool syndroommodel dat niet-proliferatieve retinopathie vertoont.Voor het meten van vasculaire vertakking definieerden we het kwantificeringsgebied door een concentrische cirkel te tekenen en vervolgens telden we één voor één de primaire takken die voortkwamen uit een centraal hoofdvat. Uit de verkregen beelden werd de vasculaire dichtheid gekwantificeerd als het gebied dat werd ingenomen door vaten gedeeld door het gebied van de ROI, dat op verschillende plaatsen in elke microfotofoto werd geplaatst. Vermijd het kwantificeren van gebieden met mechanische schade.Als er meer dan twee gebieden met puncties zijn, moet het netvlies worden weggegooid. Samenvattend hebben we in dit artikel klassieke, gevestigde en reproduceerbare technieken getoond om enkele van de meest relevante parameters te kwantificeren, rekening houdend met de klinische praktijk.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Ontleding van een muis Oog voor een hele berg van de retinaal pigment epitheel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissectie en Immunohistochemie van larven, popstadium en Volwassen<em&gt; Drosophila</em&gt; Netvliezen

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hele Mount immunolabeling van olfactorische receptor neuronen in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Whole-mount Imaging van Muis Embryo Sensory Axon Projecties

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

Hele Mount Labeling van Cilia in het Main Olfactorische Systeem van Muizen

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaan<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functioneel testen van Two netvliezen door<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hele Mount Dissection en Immunofluorescentie van de Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV-Mediated Transgene Expressie van Chimere constructen tot Behavioral functie van GPCR heteromeren in Muizen Studie

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...