Name: quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies
Uploaded: 2022-03-12T15:00:00
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Nous remercions Carlos Mas, María Pilar Crespo et Cecilia Sampedro du CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentine) pour leur assistance en microscopie confocale, Soledad Miró et Victoria Blanco pour les soins dédiés aux animaux et Laura Gatica pour l’assistance histologique. Nous remercions également Victor Diaz (Pro-Secrétaire à la Communication Institutionnelle de la FCQ) pour la production et l’édition vidéo et Paul Hobson pour sa lecture critique et sa révision linguistique du manuscrit.
Cet article a été financé par des subventions de Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (tous à M.C.S.).

Les souris C57BL/6J ont été manipulées conformément aux lignes directrices de la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Les procédures expérimentales ont été conçues et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (CICUAL) de la Faculté des sciences chimiques de l’Université nationale de Cordoue (Rés. HCD 1216/18).
1. Préparation de solutions tampons et de réactifs<...

<ol>
	<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease.">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li><li>McDougal, D. H., Gamlin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+control+of+the+eye.">Autonomic control of the eye.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).</li><li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease.">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+alterations+in+the+retinal+microvasculature,+microcirculation,+and+microstructure.">Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).</li><li>Lavia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vessel+density+in+the+superficial+and+deep+plexuses+in+diabetic+retinopathy+is+associated+with+structural+changes+in+corresponding+retinal+layers.">Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers.</a> PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).</li><li>Rosenblatt, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+in+a+rigorous+longitudinal+image-based+assessment+of+retinopathy+of+prematurity.">Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).</li><li>Edwards, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Funduscopic+examination+of+patients+with+diabetes+who+are+admitted+to+hospital.">Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital.</a> Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).</li><li>Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+associated+with+diabetic+retinopathy.">The pathology associated with diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 7-14 (2017).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=angiography+metrics+predict+progression+of+diabetic+retinopathy+and+development+of+diabetic+macular+edema:+A+prospective+study.">angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study.</a> Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+coherence+tomography+angiography+of+vascular+abnormalities+in+the+living+human+eye.">Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).</li><li>Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+vascular+changes+in+macular+telangiectasia+type+2:+comparison+between+SD-OCT+and+OCT+angiography.">Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).</li><li>Gammons, M. V., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+oxygen+induced+retinopathy+in+rodents.">Models of oxygen induced retinopathy in rodents.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-203a-3p+inhibits+retinal+angiogenesis+and+alleviates+proliferative+diabetic+retinopathy+in+oxygen-induced+retinopathy+(OIR)+rat+model+via+targeting+VEGFA+and+HIF-1&#945;.">MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1&#945;.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).</li><li>Paz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+syndrome+triggered+by+fructose+diet+impairs+neuronal+function+and+vascular+integrity+in+ApoE-KO+mouse+retinas:+Implications+of+autophagy+deficient+activation.">Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li><li>Zarb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ossified+blood+vessels+in+primary+familial+brain+calcification+elicit+a+neurotoxic+astrocyte+response.">Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response.</a> Brain. 142 (4), 885-902 (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+autophagy+modulators+on+vascular,+glial,+and+neuronal+alterations+in+the+oxygen-induced+retinopathy+mouse+model.">Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).</li><li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye.">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li><li>Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+mouse+model+of+oxygen-induced+retinopathy.">Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy.</a> Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).</li><li>Guaiquil, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+retinopathy+of+prematurity+identifies+endothelial+cell+proliferation+as+a+potential+mechanism+for+plus+disease.">A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).</li><li>Mezu-Ndubuisi, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+angiography+quantifies+oxygen-induced+retinopathy+vascular+recovery.">In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery.</a> Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).</li><li>Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+vascular+tortuosity+as+an+early+outcome+measure+in+oxygen+induced+retinopathy+(OIR).">Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR).</a> Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microvascular+density+and+morphology+in+diabetic+retinopathy+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography+angiography.">Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 362 (2016).</li><li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ocular+angiogenesis:+from+development+to+pathologies.">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+diabetic+retinopathy:+Contribution+and+limitations+of+laboratory+research.">Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research.</a> Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).</li><li>Lorenc, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1R+regulates+the+extracellular+level+of+active+MMP-2,+pathological+neovascularization,+and+functionality+in+retinas+of+OIR+mouse+model.">IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model.</a> Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).</li><li>Ma, N., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+microglia+as+passenger+leukocytes+to+the+fate+of+intraocular+neuronal+retinal+grafts.">Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).</li><li>Mazzaferri, J., Larriv&#233;e, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+machine+learning+approach+for+automated+assessment+of+retinal+vasculature+in+the+oxygen+induced+retinopathy+model.">A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).</li><li>Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+in+3D:+quantification+of+vascular+growth+and+remodeling.">The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+indirect+contact+coculture+decrease+integrity+of+inner+blood-retina+barrier+model+in+vitro+by+upgrading+MMP-2/9+activity.">Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity.</a> Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).</li><li>Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDF-deficient+mice+exhibit+an+enhanced+rate+of+retinal+vascular+expansion+and+are+more+sensitive+to+hyperoxia-mediated+vessel+obliteration.">PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).</li><li>Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+D-amino+acid+oxidase+prevents+retinal+neurovascular+pathologies+in+diabetic+rats.">Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats.</a> Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).</li></ol>

Les modèles animaux de rétinopathies sont des outils puissants pour étudier le développement vasculaire, le remodelage ou l’angiogenèse pathologique. Le succès de ces études sur le terrain repose sur la facilité d’accès au tissu qui permet d’effectuer une grande variété de techniques, fournissant des données provenant de souris in vivo et post-mortem26,27. De plus, une grande corrélation a été trouvée entre les études ...

Les yeux sont nourris par deux systèmes artério-veineux : le système vasculaire choroïdien, un réseau vasculaire externe qui irrigue l’épithélium pigmenté rétinien et les photorécepteurs ; et le système vasculaire neuro-rétinien qui irrigue la couche des cellules ganglionnaires et la couche nucléaire interne de la rétine1. Le système vasculaire rétinien est un réseau organisé de vaisseaux qui fournissent des nutriments et de l’oxygène aux cellules rétiniennes et récoltent des déchets pour assurer une transduction de signalisation visuelle appropriée. Cette vascularisation présente des caractéristiques distinctes, notamment : l’absence d’innervation autonome, la régulation du tonus vasculaire par des mécanismes rétiniens intrinsèques et la possession d’une barrière sanguine rétinienne complexe2. Par conséquent, le système vasculaire rétinien a été au centre de nombreux chercheurs qui ont étudié de manière approfondie non seulement la vasculogenèse au cours du développement, mais aussi les altérations et l’angiogenèse pathologique que ces vaisseaux subissent dans les maladies3. Les changements vasculaires les plus courants observés dans les rétinopathies sont la dilatation des vaisseaux, la néovascularisation, la perte d’arborisation vasculaire et la déformation des vaisseaux principaux de la rétine, ce qui les rend plus ziggaggy4,5,6. Une ou plusieurs des altérations décrites sont les premiers signes détectés par les cliniciens. La visualisation vasculaire fournit une méthode de dépistage rapide, non invasive et peu coûteuse7. L’étude approfondie des altérations observées dans l’arbre vasculaire déterminera si la rétinopathie est non proliférative ou proliférative et le traitement ultérieur. Les rétinopathies non prolifératives peuvent se manifester par une morphologie vasculaire aberrante, une diminution de la densité vasculaire, des capillaires acellulaires, la mort des péricytes, un œdème maculaire, entre autres. En outre, les rétinopathies prolifératives développent également une perméabilité vasculaire accrue, un remodelage extracellulaire et la formation de touffes vasculaires vers la cavité vitréenne qui se décomposent facilement ou induisent un décollement de la rétine8.
Une fois détectée, la rétinopathie peut être surveillée par ses changements vasculaires9,10. La progression de la pathologie peut être suivie à travers les changements structurels des vaisseaux, qui définissent clairement les stades de la maladie11. La quantification des altérations vasculaires dans ces modèles a permis de corréler les changements vasculaires et la mort neuronale et de tester des thérapies pharmacologiques pour les patients dans différentes phases de la maladie.
À la lumière des déclarations ci-dessus, nous considérons que la reconnaissance et la quantification des altérations vasculaires sont fondamentales dans les études sur les rétinopathies. Dans ce travail, nous allons montrer comment mesurer différents paramètres vasculaires. Pour ce faire, nous utiliserons deux modèles animaux. L’un d’eux est le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène12, qui imite la rétinopathie de prématurité et certains aspects de la rétinopathie diabétique proliférative13,14. Dans ce modèle, nous mesurerons les zones avasculaires, les zones néovasculaires et la dilatation et la tortuosité des vaisseaux principaux. Dans notre laboratoire, un modèle murin de syndrome métabolique (MetS) a été développé, qui induit une rétinopathie non proliférative15. Ici, nous allons évaluer la densité vasculaire et la ramification.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminuim foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4503</td>
			<td>quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>9632.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope FV1200</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td>with motorized plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covers</td>
			<td>Paul Marienfeld GmnH &#38; Co.</td>
			<td>111520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>119753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L&#160; tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z316121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA5201090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker GyroMini</td>
			<td>LabNet International</td>
			<td>S0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>SANXIN</td>
			<td>PHS-3D-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Analysis Fiji software</td>
			<td>Mai Elfarnawany</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Vessel_Analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies

Les rétinopathies sont un groupe hétérogène de maladies qui affectent le tissu neurosensoriel de l’œil. Ils sont caractérisés par une neurodégénérescence, une gliose et un changement progressif de la fonction et de la structure vasculaires. Bien que l’apparition des rétinopathies soit caractérisée par de subtiles perturbations de la perception visuelle, les modifications du plexus vasculaire sont les premiers signes détectés par les cliniciens. L’absence ou la présence de néovascularisation détermine si la rétinopathie est classée comme non proliférative (NPDR) ou proliférative (PDR). En ce sens, plusieurs modèles animaux ont tenté d’imiter des caractéristiques vasculaires spécifiques de chaque stade pour déterminer les mécanismes sous-jacents impliqués dans les altérations de l’endothélium, la mort neuronale et d’autres événements se produisant dans la rétine. Dans cet article, nous fournirons une description complète des procédures requises pour la mesure des paramètres vasculaires rétiniens chez les adultes et les souris de naissance précoce au jour postnatal (P) 17. Nous détaillerons les protocoles pour effectuer la coloration vasculaire rétinienne avec Isolectin GSA-IB4 dans des montures entières pour une visualisation microscopique ultérieure. Les étapes clés pour le traitement de l’image avec le logiciel Image J Fiji sont également fournies, par conséquent, les lecteurs seront en mesure de mesurer la densité des vaisseaux, le diamètre et la tortuosité, la ramification vasculaire, ainsi que les zones avasculaires et néovasculaires. Ces outils sont très utiles pour évaluer et quantifier les altérations vasculaires dans les rétinopathies non prolifératives et prolifératives.

Comme décrit dans la section du protocole, à partir d’un seul test de coloration fluorescente, vous pouvez obtenir la morphologie vasculaire et évaluer quantitativement plusieurs paramètres d’intérêt. La recherche d’une altération spécifique dépendra du type de rétinopathie étudié. Dans cet article, les zones avasculaires et néovasculaires, la tortuosité et la dilatation ont été évaluées dans un modèle murin de rétinopathie proliférative, tandis que la ramification vasculaire et la densité ont...

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Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Cet article décrit un test de coloration à la lectine bien établi et reproductible pour l’ensemble des préparations rétiniennes de monture et les protocoles requis pour la mesure quantitative des paramètres vasculaires fréquemment modifiés dans les rétinopathies prolifératives et non prolifératives.

Quantification des paramètres vasculaires dans les rétines montagnards entières de souris atteintes de rétinopathies non prolifératives et prolifératives

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

Dans les rétinopathies, les altérations vasculaires sont le premier signe détecté par les cliniciens. Ils suivent la progression de la maladie et choisissent un traitement en fonction de ces changements. Plusieurs modèles animaux ont été développés afin d’étudier les différents stades de la pathologie.Dans ce travail, nous allons montrer comment mesurer différentes altérations vasculaires. Pour cela, nous allons utiliser deux modèles animaux. L’un d’eux est le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène, qui reproduit la rétinopathie de la prématurité et certains aspects de la rétinopathie diabétique proliférative.Ici, nous allons mesurer les zones avasculaires, les zones néovasculaires, ainsi que la dilatation et la tortuosité des artérioles. Dans notre laboratoire, un modèle murin de syndrome métabolique a été développé, qui induit une rétinopathie non proliférative. La densité vasculaire et la ramification ont été évaluées dans ce travail.Lors du sacrifice de souris, énucléatiser avec des ciseaux. Fixez les yeux énucléés avec du paraformaldéhyde fraîchement préparé pendant une heure à température ambiante. Sous le microscope à dissection, retirez les cornées avec des ciseaux en coupant le long des limbes et disséquez toute la rétine.Jetez le segment antérieur de l’œil, puis séparez la rétine de la choroïde RPE. Placez les rétines dans des tubes de 200 microlitres. Ensuite, bloquez et perméabilisez les rétines dans 100 microlitres de TBS contenant 5% d’albumine sérique bovine Triton pendant six heures à quatre degrés avec une légère agitation dans le shaker.Ensuite, inverser le tube pour placer la rétine dans la tasse et retirer la solution bloquante avec une pipette. Ajouter 100 microlitres contenant de l’isolectine. Enveloppez les tubes avec du papier d’aluminium pour protéger les échantillons de la lumière.Incuber les rétines avec une solution de lectine pendant la nuit à quatre degrés avec une agitation douce dans le shaker. Lavez les rétines avec 100 microlitres de TBS-Triton pendant 20 minutes avec une agitation douce dans le shaker. Répétez cette étape trois fois.Placez la rétine dans une lame et ajoutez une goutte de PBS. Au microscope à dissection, effectuez quatre coupes également éloignées des bords de la rétine vers le nerf optique. Pour déplier les pétales de la rétine, utilisez des pinces ou de petits morceaux de papier filtre.Assurez-vous que le côté photorécepteur est orienté vers le bas. Retirez le PBS restant de la diapositive avec du papier filtre. Ajoutez ensuite une médiane de montage et un couvercle.Laissez sécher pendant une heure à température ambiante. Rangez les diapositives à quatre degrés à l’abri de la lumière. Au microscope confocal, placez la lame dans la plaque face vers le bas.Focalisez le plexus supérieur du système vasculaire rétinien et sélectionnez une zone pour commencer l’acquisition de l’image. Définissez les paramètres généraux du laser dans le logiciel. Définissez les coordonnées dans les axes X, Y et Z.Initialisez l’analyse. Une fois le processus de numérisation terminé, ouvrez l’image et enregistrez-la avec une extension préférée. Dans le logiciel ImageJ FIJI, allez dans la barre de menus et cliquez sur Fichier, Ouvrir.Sélectionnez l’image à traiter. Dans la fenêtre Option d’importation des bioformats, sélectionnez Afficher les métadonnées OME-XML et cliquez sur OK.In la fenêtre Métadonnées OME, recherchez les informations sur la taille des pixels. Copiez ces données.Pour l’étalonnage de l’image, accédez à la barre de menus et sélectionnez Propriétés de l’image. Copiez les informations et cliquez sur OK. Attribuez un lut préféré à l’image. Pour visualiser toute la pile dans une seule image, accédez à la barre de menus et sélectionnez Image, Piles, Projet Z.Dans la fenêtre de projection affichée, sélectionnez toutes les piles où les navires sont visualisés. Dans Type de projection, choisissez Intensité moyenne et cliquez sur OK. Accédez à la barre de menus, Image, Réglage, Luminosité / Contraste. Cliquez sur Appliquer et enregistrez les modifications.Copiez les paramètres sélectionnés pour la luminosité et le contraste. Celles-ci doivent être identiques pour toutes les images. Dans la barre de menus, choisissez l’outil Baguette.Sélectionnez la zone rétinienne qui manque de vaisseaux formés. Appuyez sur T sur le clavier pour enregistrer les zones sélectionnées dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les informations de la zone avasculaire.Répétez ces étapes pour mesurer la surface totale de la rétine. Dans la barre de menus, choisissez l’outil Baguette. Zoomez sur l’image pour mieux visualiser les néovassels.Sélectionnez les neovessels un par un avec l’outil Baguette. Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Mesurer dans le Gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les données de zone.Dans la barre de menus, sélectionnez l’outil Ligne droite. Zoomez sur l’image pour mieux visualiser la paroi du navire. Effectuez trois lignes transversales jusqu’au navire principal avant la première branche.Appuyez sur T sur le clavier pour enregistrer les zones sélectionnées dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Mesurer dans le Gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les données de distance. Dans la barre de menus, cliquez sur l’icône de l’outil Ligne droite avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Ligne segmentée.Tracez une ligne à l’intérieur du vaisseau à partir du nerf optique jusqu’à la ramification du premier vaisseau, en suivant la forme vasculaire. Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Dans la barre de menus, sélectionnez l’outil Ligne droite.Tracez une ligne à partir du nerf optique jusqu’à la première ramification du vaisseau. Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les données de distances.Avec l’outil Ovale de la barre de menus, définissez une zone appliquée de manière égale à toutes les conditions expérimentales. La zone sélectionnée doit être un cercle concentrique dessiné autour du nerf optique. Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement.Comptez manuellement le nombre de branches primaires provenant des navires principaux à l’intérieur de la zone de sélection. Transformez l’image en mode 8 bits. Allez dans Plugins dans la barre de menus, sélectionnez Analyse des vaisseaux, Densité vasculaire.Définissez une zone avec l’outil Carré de la barre de menus où vous souhaitez mesurer la densité du navire. Cliquez sur OK. Le programme affichera une nouvelle fenêtre avec les informations requises. Dans le premier exemple expérimental, le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène a été utilisé.Des injections intravitréennes ont été effectuées au jour postnatal 12 pour déterminer l’efficacité d’un médicament en tant qu’antiangiogénique. Des souris injectées avec un véhicule ont été utilisées comme témoins. Les zones avasculaires sont définies comme les zones dépourvues de vaisseaux sanguins rétiniens.À partir des images acquises, les zones avasculaires peuvent être quantifiées comme la somme des régions sans vaisseaux divisées par la surface totale de la rétine. Les zones endommagées par des dommages mécaniques montrent également l’absence de navires. Pour identifier les zones endommagées, analysez l’intégrité des couches neuronales avec la tache de Hoechst.Les néovaisseaux sont des vaisseaux de petit calibre qui proviennent de vaisseaux préexistants du plexus vasculaire supérieur. Nous avons calculé la surface occupée par les touffes de néovassels en quantifiant l’aire néovasculaire de la rétine occupée par l’aire totale de la rétine. Comme la forme et la taille des néovaisseaux sont variables, ils peuvent parfois ressembler à des débris et à des artefacts.Pour distinguer les néovaisseaux, vérifiez que la touffe se développe à partir d’un récipient mature. Pour l’analyse de la dilatation, nous avons mesuré le diamètre du vaisseau principal à trois hauteurs avant la première branche. Les chercheurs doivent définir une distance prédéterminée pour mesurer le diamètre des vaisseaux afin de réduire la variabilité entre les résultats.Idéalement, le point le plus éloigné du nerf optique devrait être d’environ 300 micromètres. Nous suggérons d’effectuer l’analyse, et plus tard, en moyenne d’au moins six animaux par condition. En ce qui concerne la tortuosité, nous mesurons la distance parcourue par le vaisseau principal suivant sa forme, par rapport à la distance en ligne droite entre le nerf optique et le premier point de ramification.Comme nous pouvons le voir sur l’image, il y a une hétérogénéité dans la sinuosité des principaux vaisseaux. Pour obtenir un résultat représentatif, pas moins de six souris par condition doivent être quantifiées. Les derniers paramètres, la ramification vasculaire et la densité, ont été analysés dans un modèle de syndrome métabolique présentant une rétinopathie non proliférative.Pour la mesure de la ramification vasculaire, nous avons défini la zone de quantification en dessinant un cercle concentrique, puis nous avons compté, une par une, les branches primaires provenant d’un vaisseau central principal. À partir des images acquises, la densité vasculaire a été quantifiée comme la zone occupée par les vaisseaux divisée par la zone du ROI, qui était positionnée à différents endroits dans chaque microphotographie. Évitez de quantifier les zones avec des dommages mécaniques.S’il y a plus de deux zones avec des ponctions, la rétine doit être jetée. En résumé, dans cet article, nous avons montré des techniques classiques, bien établies et reproductibles pour quantifier certains des paramètres les plus pertinents en tenant compte dans la pratique clinique.

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