Name: quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies
Uploaded: 2022-03-12T15:00:00
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Wir danken Carlos Mas, María Pilar Crespo und Cecilia Sampedro von CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentinien) für die Unterstützung in der konfokalen Mikroskopie, Soledad Miró und Victoria Blanco für die engagierte Tierpflege und Laura Gatica für die histologische Unterstützung. Wir danken auch Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication of FCQ) für die Videoproduktion und -edition und Paul Hobson für seine kritische Lektüre und sprachliche Überarbeitung des Manuskripts.
Dieser Artikel wurde durch Stipendien von Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alle an M.C.S.) finanziert.

C57BL/6J-Mäuse wurden gemäß den Richtlinien des ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research behandelt. Die experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (CICUAL) der Fakultät für Chemische Wissenschaften der Nationalen Universität Córdoba entworfen und genehmigt (Res. HCD 1216/18).
1. Herstellung von Pufferlösungen und Reagenzien
<ol><li>Herstellung von 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS): 8 g Natrium...

<ol>
	<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease.">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li><li>McDougal, D. H., Gamlin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+control+of+the+eye.">Autonomic control of the eye.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).</li><li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease.">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+alterations+in+the+retinal+microvasculature,+microcirculation,+and+microstructure.">Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).</li><li>Lavia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vessel+density+in+the+superficial+and+deep+plexuses+in+diabetic+retinopathy+is+associated+with+structural+changes+in+corresponding+retinal+layers.">Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers.</a> PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).</li><li>Rosenblatt, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+in+a+rigorous+longitudinal+image-based+assessment+of+retinopathy+of+prematurity.">Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).</li><li>Edwards, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Funduscopic+examination+of+patients+with+diabetes+who+are+admitted+to+hospital.">Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital.</a> Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).</li><li>Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+associated+with+diabetic+retinopathy.">The pathology associated with diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 7-14 (2017).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=angiography+metrics+predict+progression+of+diabetic+retinopathy+and+development+of+diabetic+macular+edema:+A+prospective+study.">angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study.</a> Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+coherence+tomography+angiography+of+vascular+abnormalities+in+the+living+human+eye.">Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).</li><li>Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+vascular+changes+in+macular+telangiectasia+type+2:+comparison+between+SD-OCT+and+OCT+angiography.">Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).</li><li>Gammons, M. V., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+oxygen+induced+retinopathy+in+rodents.">Models of oxygen induced retinopathy in rodents.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-203a-3p+inhibits+retinal+angiogenesis+and+alleviates+proliferative+diabetic+retinopathy+in+oxygen-induced+retinopathy+(OIR)+rat+model+via+targeting+VEGFA+and+HIF-1&#945;.">MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1&#945;.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).</li><li>Paz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+syndrome+triggered+by+fructose+diet+impairs+neuronal+function+and+vascular+integrity+in+ApoE-KO+mouse+retinas:+Implications+of+autophagy+deficient+activation.">Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li><li>Zarb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ossified+blood+vessels+in+primary+familial+brain+calcification+elicit+a+neurotoxic+astrocyte+response.">Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response.</a> Brain. 142 (4), 885-902 (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+autophagy+modulators+on+vascular,+glial,+and+neuronal+alterations+in+the+oxygen-induced+retinopathy+mouse+model.">Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).</li><li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye.">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li><li>Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+mouse+model+of+oxygen-induced+retinopathy.">Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy.</a> Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).</li><li>Guaiquil, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+retinopathy+of+prematurity+identifies+endothelial+cell+proliferation+as+a+potential+mechanism+for+plus+disease.">A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).</li><li>Mezu-Ndubuisi, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+angiography+quantifies+oxygen-induced+retinopathy+vascular+recovery.">In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery.</a> Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).</li><li>Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+vascular+tortuosity+as+an+early+outcome+measure+in+oxygen+induced+retinopathy+(OIR).">Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR).</a> Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microvascular+density+and+morphology+in+diabetic+retinopathy+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography+angiography.">Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 362 (2016).</li><li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ocular+angiogenesis:+from+development+to+pathologies.">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+diabetic+retinopathy:+Contribution+and+limitations+of+laboratory+research.">Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research.</a> Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).</li><li>Lorenc, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1R+regulates+the+extracellular+level+of+active+MMP-2,+pathological+neovascularization,+and+functionality+in+retinas+of+OIR+mouse+model.">IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model.</a> Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).</li><li>Ma, N., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+microglia+as+passenger+leukocytes+to+the+fate+of+intraocular+neuronal+retinal+grafts.">Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).</li><li>Mazzaferri, J., Larriv&#233;e, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+machine+learning+approach+for+automated+assessment+of+retinal+vasculature+in+the+oxygen+induced+retinopathy+model.">A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).</li><li>Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+in+3D:+quantification+of+vascular+growth+and+remodeling.">The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+indirect+contact+coculture+decrease+integrity+of+inner+blood-retina+barrier+model+in+vitro+by+upgrading+MMP-2/9+activity.">Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity.</a> Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).</li><li>Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDF-deficient+mice+exhibit+an+enhanced+rate+of+retinal+vascular+expansion+and+are+more+sensitive+to+hyperoxia-mediated+vessel+obliteration.">PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).</li><li>Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+D-amino+acid+oxidase+prevents+retinal+neurovascular+pathologies+in+diabetic+rats.">Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats.</a> Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).</li></ol>

Tiermodelle von Retinopathien sind leistungsfähige Werkzeuge zur Untersuchung der Gefäßentwicklung, des Remodelings oder der pathologischen Angiogenese. Der Erfolg dieser Studien auf diesem Gebiet beruht auf dem einfachen Zugang zum Gewebe, der es ermöglicht, eine Vielzahl von Techniken durchzuführen und Daten von In-vivo- und postmortalen Mäusen zu liefern26,27. Darüber hinaus wurde eine große Korrelation zwischen In-vivo-Studien</e...

Die Augen werden von zwei arterio-venösen Systemen genährt: dem choroidalen Gefäßsystem, einem externen vaskulären Netzwerk, das retinales pigmentiertes Epithel und Photorezeptoren bewässert; und das neuroretinale Gefäßsystem, das die Ganglienzellschicht und die innere Kernschicht der Netzhaut bewässert1. Das retinale Gefäßsystem ist ein organisiertes Netzwerk von Gefäßen, die Nährstoffe und Sauerstoff an die Netzhautzellen liefern und Abfallprodukte ernten, um eine ordnungsgemäße visuelle Signalübertragung zu gewährleisten. Dieses Gefäßsystem weist einige Besonderheiten auf, darunter: das Fehlen einer autonomen Innervation, die Regulierung des Gefäßtonus durch intrinsische Netzhautmechanismen und den Besitz einer komplexen Netzhaut-Blut-Schranke2. Daher stand das retinale Gefäßsystem im Mittelpunkt vieler Forscher, die nicht nur die Vaskulogenese während der Entwicklung, sondern auch die Veränderungen und die pathologische Angiogenese, die diese Gefäße bei Krankheiten durchlaufen, umfassend untersucht haben3. Die häufigsten vaskulären Veränderungen, die bei Retinopathien beobachtet werden, sind Gefäßdilatation, Neovaskularisation, Verlust der vaskulären Arborisierung und Deformation der netzhautlichen Hauptgefäße, was sie zickzaggiger macht4,5,6. Eine oder mehrere der beschriebenen Veränderungen sind die frühesten Anzeichen, die von Ärzten erkannt werden können. Die vaskuläre Visualisierung bietet eine schnelle, nicht-invasive und kostengünstige Screening-Methode7. Die umfangreiche Untersuchung der im Gefäßbaum beobachteten Veränderungen wird bestimmen, ob die Retinopathie nicht proliferativ oder proliferativ ist und die weitere Behandlung. Die nicht-proliferativen Retinopathien können sich unter anderem mit abweichender vaskulärer Morphologie, verminderter Gefäßdichte, azellulären Kapillaren, Perizytentod, Makulaödemen manifestieren. Darüber hinaus entwickeln proliferative Retinopathien auch eine erhöhte vaskuläre Permeabilität, extrazelluläres Remodeling und die Bildung von vaskulären Büscheln in Richtung der Glaskörperhöhle, die leicht abbauen oder eine Netzhautablösung induzieren8.
Einmal erkannt, kann die Retinopathie durch ihre Gefäßveränderungen überwacht werden9,10. Das Fortschreiten der Pathologie kann durch die strukturellen Veränderungen der Gefäße verfolgt werden, die die Stadien der Krankheit klar definieren11. Die Quantifizierung von Gefäßveränderungen in diesen Modellen ermöglichte es, Gefäßveränderungen und neuronalen Tod zu korrelieren und pharmakologische Therapien für Patienten in verschiedenen Phasen der Krankheit zu testen.
Im Lichte der obigen Aussagen sind wir der Ansicht, dass die Erkennung und Quantifizierung von Gefäßveränderungen in Retinopathiestudien von grundlegender Bedeutung ist. In dieser Arbeit werden wir zeigen, wie man verschiedene vaskuläre Parameter misst. Dazu werden wir zwei Tiermodelle einsetzen. Eines davon ist das Sauerstoff-induzierte Retinopathie-Mausmodell12, das die Retinopathie der Frühgeburtlichkeit und einige Aspekte der proliferativen diabetischen Retinopathie nachahmt13,14. In diesem Modell werden wir avaskuläre Bereiche, neovaskuläre Bereiche und die Dilatation und Tortuosität der Hauptgefäße messen. In unserem Labor wurde ein Mausmodell für das Metabolische Syndrom (MetS) entwickelt, das eine nicht-proliferative Retinopathie induziert15. Hier werden wir die Gefäßdichte und Verzweigung bewerten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminuim foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4503</td>
			<td>quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>9632.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope FV1200</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td>with motorized plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covers</td>
			<td>Paul Marienfeld GmnH &#38; Co.</td>
			<td>111520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>119753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L&#160; tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z316121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA5201090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker GyroMini</td>
			<td>LabNet International</td>
			<td>S0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>SANXIN</td>
			<td>PHS-3D-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Analysis Fiji software</td>
			<td>Mai Elfarnawany</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Vessel_Analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies

Retinopathien sind eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, die das neurosensorische Gewebe des Auges betreffen. Sie sind gekennzeichnet durch Neurodegeneration, Gliose und eine fortschreitende Veränderung der Gefäßfunktion und -struktur. Obwohl der Beginn der Retinopathien durch subtile Störungen der visuellen Wahrnehmung gekennzeichnet ist, sind die Veränderungen im Gefäßplexus die ersten Anzeichen, die von Klinikern festgestellt werden. Das Fehlen oder Vorhandensein einer Neovaskularisation bestimmt, ob die Retinopathie entweder als nicht-proliferativ (NPDR) oder proliferativ (PDR) klassifiziert wird. In diesem Sinne versuchten mehrere Tiermodelle, spezifische vaskuläre Merkmale jedes Stadiums nachzuahmen, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu bestimmen, die an Endothelveränderungen, neuronalem Tod und anderen Ereignissen in der Netzhaut beteiligt sind. In diesem Artikel werden wir eine vollständige Beschreibung der Verfahren bereitstellen, die für die Messung der retinalen vaskulären Parameter bei Erwachsenen und Frühgeburtsmäusen am postnatalen Tag (P) 17 erforderlich sind. Wir werden die Protokolle zur Durchführung der retinalen Gefäßfärbung mit Isolectin GSA-IB4 in ganzen Halterungen für die spätere mikroskopische Visualisierung detailliert beschreiben. Wichtige Schritte für die Bildverarbeitung mit der Software Image J Fiji werden ebenfalls bereitgestellt, daher können die Leser Gefäßdichte, Durchmesser und Tortuosität, vaskuläre Verzweigung sowie avaskuläre und neovaskuläre Bereiche messen. Diese Werkzeuge sind sehr hilfreich, um vaskuläre Veränderungen sowohl bei nicht-proliferativen als auch bei proliferativen Retinopathien zu bewerten und zu quantifizieren.

Wie im Protokollabschnitt beschrieben, können Sie aus einem einzigen Fluoreszenzfärbungsassay die vaskuläre Morphologie erhalten und mehrere Parameter von Interesse quantitativ bewerten. Die Suche nach einer spezifischen Veränderung hängt von der Art der untersuchten Retinopathie ab. In diesem Artikel wurden avaskuläre und neovaskuläre Bereiche, Tortuosität und Dilatation in einem Mausmodell der proliferativen Retinopathie bewertet, während die vaskuläre Verzweigung und Dichte in einem MetS-Mausmodell analysier...

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Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Dieser Artikel beschreibt einen gut etablierten und reproduzierbaren Lektin-Färbungsassay für die gesamten Netzhautpräparate und die Protokolle, die für die quantitative Messung von Gefäßparametern erforderlich sind, die bei proliferativen und nicht-proliferativen Retinopathien häufig verändert sind.

Quantifizierung vaskulärer Parameter in der gesamten Netzhaut von Mäusen mit nicht-proliferativen und proliferativen Retinopathien

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

Bei Retinopathien sind vaskuläre Veränderungen das erste Anzeichen, das von Klinikern erkannt wird. Sie folgen dem Fortschreiten der Krankheit und wählen eine Behandlung entsprechend diesen Veränderungen. Mehrere Tiermodelle wurden entwickelt, um verschiedene Stadien der Pathologie zu untersuchen.In dieser Arbeit werden wir zeigen, wie man verschiedene vaskuläre Veränderungen misst. Dafür werden wir zwei Tiermodelle einsetzen. Eines davon ist das Mausmodell der sauerstoffinduzierten Retinopathie, das die Retinopathie der Frühgeburtlichkeit und einige Aspekte der proliferativen diabetischen Retinopathie reproduziert.Hier werden wir avaskuläre Bereiche, neovaskuläre Bereiche und die Dilatation und Tortuosität der Arteriolen messen. In unserem Labor wurde ein Mausmodell für das metabolische Syndrom entwickelt, das eine nichtproliferative Retinopathie induziert. Gefäßdichte und Verzweigung wurden in dieser Arbeit evaluiert.Wenn Mäuse opfern, enukleatieren Sie mit einer Schere. Enukleierte Augen mit frisch zubereitetem Paraformaldehyd für eine Stunde bei Raumtemperatur fixieren. Entfernen Sie unter dem Seziermikroskop die Hornhaut mit einer Schere, indem Sie entlang des Limbus schneiden und die gesamte Netzhaut sezieren.Verwerfen Sie das vordere Segment des Auges und trennen Sie dann die Netzhaut von der RPE-Aderhaut. Legen Sie die Netzhaut in 200 Mikroliter-Röhrchen. Dann blockieren und permeabilisieren Sie die Netzhaut in 100 Mikrolitern TBS mit 5% Rinderserumalbumin Triton während sechs Stunden bei vier Grad mit sanfter Bewegung im Shaker.Dann drehen Sie die Tube um, um die Netzhaut in die Tasse zu legen und die blockierende Lösung mit Pipette zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter Lösung hinzu, die Isolektin enthält. Wickeln Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie ein, um die Proben vor Licht zu schützen.Inkubieren Sie die Netzhaut mit Lektinlösung über Nacht bei vier Grad mit sanfter Bewegung im Shaker. Waschen Sie die Netzhaut mit 100 Mikrolitern TBS-Triton für 20 Minuten mit sanfter Bewegung im Shaker. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.Legen Sie die Netzhaut in einen Objektträger und fügen Sie einen Tropfen PBS hinzu. Führen Sie unter dem Seziermikroskop vier gleich weit entfernte Schnitte von den Rändern der Netzhaut in Richtung Sehnerv durch. Um die Blütenblätter der Netzhaut zu entfalten, verwenden Sie eine Pinzette oder kleine Stücke Filterpapier.Stellen Sie sicher, dass die Photorezeptorseite nach unten zeigt. Entfernen Sie die restliche PBS mit Filterpapier von der Folie. Fügen Sie dann einen Montagemedian und einen Deckglas hinzu.Lassen Sie es eine Stunde bei Raumtemperatur trocknen. Bewahren Sie Die Dias bei vier Grad lichtgeschützt auf. Legen Sie am konfokalen Mikroskop den Objektträger mit der Vorderseite nach unten in die Platte.Fokussieren Sie den oberen Plexus des retinalen Gefäßsystems und wählen Sie einen Bereich aus, um die Bildaufnahme zu starten. Stellen Sie allgemeine Laserparameter in der Software ein. Legen Sie die Koordinaten in X-, Y- und Z-Achse fest.Initialisieren Sie den Scanvorgang. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, öffnen Sie das Bild und speichern Sie es mit einer bevorzugten Erweiterung. Gehen Sie in der ImageJ FIJI-Software zur Menüleiste und klicken Sie auf Datei, Öffnen.Wählen Sie das zu bearbeitende Bild aus. Wählen Sie im Fenster Importoption für Bioformate die Option OME-XML-Metadaten anzeigen aus, und klicken Sie auf OK.In Fenster OME-Metadaten nach Pixelgrößeninformationen suchen. Kopieren Sie diese Daten.Gehen Sie zur Bildkalibrierung zur Menüleiste und wählen Sie Bildeigenschaften. Kopieren Sie die Informationen und klicken Sie auf OK. Weisen Sie dem Bild eine bevorzugte Lut zu. Um alle Stapel in einem einzigen Bild zu visualisieren, gehen Sie zur Menüleiste und wählen Sie Bild, Stapel, Z-Projekt.Wählen Sie im angezeigten Projektionsfenster alle Stapel aus, in denen Gefäße visualisiert werden. Wählen Sie unter Projektionstyp die Option Durchschnittliche Intensität und klicken Sie auf OK. Gehen Sie zur Menüleiste, Bild, Anpassen, Helligkeit / Kontrast. Klicken Sie auf Übernehmen und speichern Sie die Änderungen.Kopieren Sie die für Helligkeit und Kontrast ausgewählten Parameter. Diese müssen für alle Bilder identisch sein. Wählen Sie in der Menüleiste das Werkzeug Zauberstab aus.Wählen Sie den Netzhautbereich aus, in dem keine gebildeten Gefäße vorhanden sind. Drücken Sie T auf der Tastatur, um die ausgewählten Bereiche im ROI Manager aufzuzeichnen. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen, um die Informationen zum avaskulären Bereich abzurufen.Wiederholen Sie diese Schritte, um die Gesamtfläche der Netzhaut zu messen. Wählen Sie in der Menüleiste das Werkzeug Zauberstab aus. Zoomen Sie in das Bild, um Neoschiffe besser zu visualisieren.Wählen Sie die Neoschiffe nacheinander mit dem Zauberstab-Werkzeug aus. Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen, um die Bereichsdaten abzurufen.Wählen Sie in der Menüleiste das Gerade-Linie-Werkzeug aus. Zoomen Sie in das Bild, um die Gefäßwand besser zu visualisieren. Führen Sie vor dem ersten Zweig drei Querlinien zum Hauptschiff durch.Drücken Sie T auf der Tastatur, um die ausgewählten Bereiche im ROI Manager aufzuzeichnen. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen, um die Entfernungsdaten abzurufen. Klicken Sie in der Menüleiste mit der rechten Maustaste auf das Werkzeugsymbol gerade Linie und wählen Sie Segmentierte Linie.Zeichnen Sie eine Linie innerhalb des Gefäßes vom Sehnerv bis zur ersten Gefäßverzweigung, die der Gefäßform folgt. Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen. Wählen Sie in der Menüleiste das Gerade-Linie-Werkzeug aus.Zeichnen Sie eine Linie vom Sehnerv bis zur ersten Gefäßverzweigung. Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen, um die Entfernungsdaten abzurufen.Definieren Sie mit dem Oval-Werkzeug der Menüleiste einen Bereich, der auf alle experimentellen Bedingungen gleichermaßen angewendet wird. Der ausgewählte Bereich muss ein konzentrischer Kreis sein, der um den Sehnerv gezogen wird. Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen.Zählen Sie manuell die Anzahl der primären Zweige, die aus hauptschiffen innerhalb des Auswahlbereichs entstehen. Transformieren Sie das Bild in den 8-Bit-Modus. Gehen Sie in der Menüleiste zu Plugins und wählen Sie Gefäßanalyse, Gefäßdichte.Definieren Sie mit dem Quadrat-Werkzeug der Menüleiste einen Bereich, in dem Sie die Gefäßdichte messen möchten. Klicken Sie auf OK. Das Programm zeigt ein neues Fenster mit den erforderlichen Informationen an. Im ersten experimentellen Beispiel wurde das Mausmodell der sauerstoffinduzierten Retinopathie verwendet.Intravitreale Injektionen wurden am postnatalen Tag 12 durchgeführt, um die Wirksamkeit eines Medikaments als Antiangiogen zu bestimmen. Mäuse, denen Vehikel injiziert wurden, wurden als Kontrolle eingesetzt. Die avaskulären Bereiche sind definiert als die Zonen, denen retinale Blutgefäße fehlen.Aus den aufgenommenen Bildern können avaskuläre Flächen quantifiziert werden, da die Summe der Regionen ohne Gefäße die Gesamtfläche der Netzhaut dividiert. Bereiche mit mechanischen Beschädigungen zeigen auch das Fehlen von Schiffen. Um beschädigte Bereiche zu identifizieren, analysieren Sie die Integrität neuronaler Schichten mit Hoechst-Färbung.Neoschiffe sind kleinkalibrige Gefäße, die aus bereits bestehenden Gefäßen des Plexus vaskula superior stammen. Wir berechneten die von Neogefäßbüscheln eingenommene Fläche, indem wir den neovaskulären Bereich der Netzhaut quantifizierten, der von der Gesamtfläche der Netzhaut eingenommen wurde. Da die Form und Größe von Neoschiffen variabel ist, können sie gelegentlich Trümmern und Artefakten ähneln.Um Neoschiffe zu unterscheiden, überprüfen Sie, ob das Büschel aus einem reifen Gefäß wächst. Für die Analyse der Dilatation haben wir den Hauptgefäßdurchmesser in drei Höhen vor dem ersten Ast gemessen. Forscher müssen eine vorbestimmte Entfernung definieren, um den Gefäßdurchmesser zu messen, um die Variabilität zwischen den Ergebnissen zu reduzieren.Idealerweise sollte der am weitesten vom Sehnerv entfernte Punkt etwa 300 Mikrometer betragen. Wir schlagen vor, die Analyse durchzuführen und später durchschnittlich mindestens sechs Tiere pro Zustand durchzuführen. In Bezug auf die Tortuosität messen wir die Entfernung, die das Hauptgefäß nach seiner Form zurücklegt, in Bezug auf den geradlinigen Abstand zwischen dem Sehnerv und dem ersten Verzweigungspunkt.Wie wir im Bild sehen können, gibt es Heterogenität in der Geschmeidigkeit der Hauptgefäße. Um ein repräsentatives Ergebnis zu erhalten, müssen mindestens sechs Mäuse pro Bedingung quantifiziert werden. Die neuesten Parameter, vaskuläre Verzweigung und Dichte, wurden in einem metabolischen Syndrommodell analysiert, das eine nicht-proliferative Retinopathie aufweist.Für die Messung der Gefäßverzweigung definierten wir den Quantifizierungsbereich, indem wir einen konzentrischen Kreis zeichneten, und dann zählten wir nacheinander die primären Zweige, die aus einem zentralen Hauptgefäß hervorgingen. Aus den aufgenommenen Bildern wurde die Gefäßdichte als die von Gefäßen eingenommene Fläche dividiert durch die Fläche des ROI quantifiziert, die an verschiedenen Stellen in jeder Mikrofotografie positioniert war. Vermeiden Sie die Quantifizierung von Bereichen mit mechanischen Beschädigungen.Wenn es mehr als zwei Bereiche mit Einstiche gibt, muss die Netzhaut verworfen werden. Zusammenfassend haben wir in diesem Artikel klassische, etablierte und reproduzierbare Techniken gezeigt, um einige der relevantesten Parameter unter Berücksichtigung der klinischen Praxis zu quantifizieren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

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Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung<em&gt; Drosophila</em&gt; Netzhäute

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

Ganze Berge Kennzeichnung von Cilia im Hauptriechsystem der Mäuse

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV-Mediated Transgene Expression von chimären Konstrukten Behavioral Funktion von GPCR Heteromeren bei Mäusen zu studieren

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...