Name: quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies
Uploaded: 2022-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies at JoVE.com

אנו מודים לקרלוס מאס, מריה פילאר קרספו וססיליה סמפדרו מ- CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, קורדובה, ארגנטינה) על הסיוע במיקרוסקופיה קונפוקלית, לסולדד מירו וויקטוריה בלנקו על טיפול מסור בבעלי חיים ולורה גטיקה על סיוע היסטולוגי. אנו מודים גם לויקטור דיאז (פרו-מזכיר התקשורת המוסדית של FCQ) על הפקת הווידאו והמהדורה ופול הובסון על הקריאה הביקורתית שלו ותיקון השפה של כתב היד.
מאמר זה מומן על ידי מענקים מ Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (all to M.C.S.).

עכברי C57BL/6J טופלו על פי הנחיות של הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. הליכי הניסוי תוכננו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (CICUAL) של הפקולטה למדעי הכימיה, האוניברסיטה הלאומית של קורדובה (מיל' HCD 1216/18).
1. הכנת פתרונות חוצצים ורגנטים
<ol><li...

<ol>
	<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease.">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li><li>McDougal, D. H., Gamlin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+control+of+the+eye.">Autonomic control of the eye.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).</li><li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease.">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+alterations+in+the+retinal+microvasculature,+microcirculation,+and+microstructure.">Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).</li><li>Lavia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vessel+density+in+the+superficial+and+deep+plexuses+in+diabetic+retinopathy+is+associated+with+structural+changes+in+corresponding+retinal+layers.">Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers.</a> PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).</li><li>Rosenblatt, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+in+a+rigorous+longitudinal+image-based+assessment+of+retinopathy+of+prematurity.">Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).</li><li>Edwards, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Funduscopic+examination+of+patients+with+diabetes+who+are+admitted+to+hospital.">Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital.</a> Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).</li><li>Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+associated+with+diabetic+retinopathy.">The pathology associated with diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 7-14 (2017).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=angiography+metrics+predict+progression+of+diabetic+retinopathy+and+development+of+diabetic+macular+edema:+A+prospective+study.">angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study.</a> Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+coherence+tomography+angiography+of+vascular+abnormalities+in+the+living+human+eye.">Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).</li><li>Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+vascular+changes+in+macular+telangiectasia+type+2:+comparison+between+SD-OCT+and+OCT+angiography.">Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).</li><li>Gammons, M. V., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+oxygen+induced+retinopathy+in+rodents.">Models of oxygen induced retinopathy in rodents.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-203a-3p+inhibits+retinal+angiogenesis+and+alleviates+proliferative+diabetic+retinopathy+in+oxygen-induced+retinopathy+(OIR)+rat+model+via+targeting+VEGFA+and+HIF-1&#945;.">MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1&#945;.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).</li><li>Paz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+syndrome+triggered+by+fructose+diet+impairs+neuronal+function+and+vascular+integrity+in+ApoE-KO+mouse+retinas:+Implications+of+autophagy+deficient+activation.">Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li><li>Zarb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ossified+blood+vessels+in+primary+familial+brain+calcification+elicit+a+neurotoxic+astrocyte+response.">Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response.</a> Brain. 142 (4), 885-902 (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+autophagy+modulators+on+vascular,+glial,+and+neuronal+alterations+in+the+oxygen-induced+retinopathy+mouse+model.">Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).</li><li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye.">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li><li>Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+mouse+model+of+oxygen-induced+retinopathy.">Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy.</a> Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).</li><li>Guaiquil, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+retinopathy+of+prematurity+identifies+endothelial+cell+proliferation+as+a+potential+mechanism+for+plus+disease.">A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).</li><li>Mezu-Ndubuisi, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+angiography+quantifies+oxygen-induced+retinopathy+vascular+recovery.">In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery.</a> Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).</li><li>Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+vascular+tortuosity+as+an+early+outcome+measure+in+oxygen+induced+retinopathy+(OIR).">Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR).</a> Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microvascular+density+and+morphology+in+diabetic+retinopathy+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography+angiography.">Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 362 (2016).</li><li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ocular+angiogenesis:+from+development+to+pathologies.">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+diabetic+retinopathy:+Contribution+and+limitations+of+laboratory+research.">Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research.</a> Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).</li><li>Lorenc, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1R+regulates+the+extracellular+level+of+active+MMP-2,+pathological+neovascularization,+and+functionality+in+retinas+of+OIR+mouse+model.">IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model.</a> Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).</li><li>Ma, N., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+microglia+as+passenger+leukocytes+to+the+fate+of+intraocular+neuronal+retinal+grafts.">Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).</li><li>Mazzaferri, J., Larriv&#233;e, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+machine+learning+approach+for+automated+assessment+of+retinal+vasculature+in+the+oxygen+induced+retinopathy+model.">A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).</li><li>Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+in+3D:+quantification+of+vascular+growth+and+remodeling.">The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+indirect+contact+coculture+decrease+integrity+of+inner+blood-retina+barrier+model+in+vitro+by+upgrading+MMP-2/9+activity.">Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity.</a> Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).</li><li>Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDF-deficient+mice+exhibit+an+enhanced+rate+of+retinal+vascular+expansion+and+are+more+sensitive+to+hyperoxia-mediated+vessel+obliteration.">PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).</li><li>Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+D-amino+acid+oxidase+prevents+retinal+neurovascular+pathologies+in+diabetic+rats.">Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats.</a> Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).</li></ol>

מודלים מן החי של רטינופתיות הם כלים רבי עוצמה לחקר התפתחות כלי הדם, שיפוץ או אנגיוגנזה פתולוגית. ההצלחה של מחקרים אלה בתחום מסתמכת על הגישה הקלה לרקמה המאפשרת לבצע מגוון רחב של טכניקות, ומספקת נתונים מ- in vivo ועכברים לאחר המוות26,27. יתר על כן, נמצא מתא?...

העיניים ניזונות משני מערכת עורקים-ורידים: כלי הדם הכורואידיים, רשת כלי דם חיצונית המשקה אפיתל פיגמנטי ברשתית ופוטותרפטורים; ואת כלי הדם הנוירו-רשתיים המשקים את שכבת תאי הגנגליון ואת השכבה הגרעינית הפנימית של הרשתית1. כלי הדם ברשתית היא רשת מאורגנת של כלי שיט המספקים חומרים מזינים וחמצן לתאי הרשתית ומוצרי פסולת קציר כדי להבטיח העברת איתות חזותית נכונה. כלי דם זה יש כמה תכונות ברורות, כולל: חוסר innervation אוטונומי, הרגולציה של טון כלי הדם על ידי מנגנוני רשתית פנימית והחזקת מחסום דם רשתית מורכב2. לכן, כלי דם ברשתית היה המוקד של חוקרים רבים אשר חקרו בהרחבה לא רק vasculogenesis במהלך הפיתוח, אלא גם את השינויים ואת אנגיוגנזה פתולוגית כי כלי אלה עוברים במחלות3. השינויים הסקולריים הנפוצים ביותר שנצפו ברטינופתיות הם הרחבת כלי דם, ניאווסקולריזציה, אובדן ארבוריזציה וסקולרית ועיוות של כלי הדם הראשיים ברשתית, מה שהופך אותם יותר זיגאגי4,5,6. אחד או יותר מהשינויים המתוארים הם הסימנים המוקדמים ביותר שזוהו על ידי רופאים. הדמיה וסקולרית מספקת שיטת סינון מהירה, לא פולשנית וזולה7. המחקר הנרחב של השינויים שנצפו בעץ כלי הדם יקבע אם הרטינופתיה אינה מתרבה או מתרבה והטיפול הנוסף. רטינופתיות שאינן מתרבות יכולות להתבטא עם מורפולוגיה כלי דם חריגה, ירידה בצפיפות כלי הדם, נימים תאיים, מוות pericytes, בצקת מקולרית, בין היתר. בנוסף, רטינופתיות שגשוג גם לפתח חדירות כלי דם מוגברת, שיפוץ חוץ תאי, ואת היווצרות של tufts כלי דם לכיוון חלל הזגוגית כי בקלות התמוטטות או לגרום ניתוק רשתית8.
לאחר שזוהה, ניתן לעקוב אחר רטינופתיה באמצעות שינויי כלי הדם שלה9,10. התקדמות הפתולוגיה ניתן לעקוב אחר שינויים מבניים של כלי הדם, אשר מגדירים בבירור את שלבי המחלה11. הכימות של שינויים בכלי הדם במודלים אלה אפשר לתאם שינויים בכלי הדם ומוות עצבי ולבדוק טיפולים תרופתיים לחולים בשלבים שונים של המחלה.
לאור ההצהרות לעיל, אנו רואים כי ההכרה והכימות של שינויים בכלי הדם הם בסיסיים במחקרי רטינופתיה. בעבודה זו, נראה כיצד למדוד פרמטרים שונים של כלי הדם. כדי לעשות זאת, נשתמש בשני מודלים של בעלי חיים. אחד מהם הוא מודל העכבר רטינופתיה המושרה חמצן12, אשר מחקה רטינופתיה של פגות וכמה היבטים של רטינופתיה סוכרתית מתרבה13,14. במודל זה, נמדוד אזורים וסקולריים, אזורים ניאו-וסקולריים והרחבה וטורטואוזיות של כלי הדם העיקריים. במעבדה שלנו, פותח מודל עכבר תסמונת מטבולית (MetS), אשר גורם רטינופתיה לא שגשוג15. כאן, נעריך את צפיפות כלי הדם ואת ההסתעפות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminuim foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4503</td>
			<td>quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>9632.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope FV1200</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td>with motorized plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covers</td>
			<td>Paul Marienfeld GmnH &#38; Co.</td>
			<td>111520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>119753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L&#160; tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z316121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA5201090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker GyroMini</td>
			<td>LabNet International</td>
			<td>S0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>SANXIN</td>
			<td>PHS-3D-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Analysis Fiji software</td>
			<td>Mai Elfarnawany</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Vessel_Analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies

רטינופתיות הן קבוצה הטרוגנית של מחלות המשפיעות על הרקמה הנוירו-חושית של העין. הם מאופיינים על ידי ניוון עצבי, גליוזיס ושינוי הדרגתי בתפקוד כלי הדם ובמבנה. למרות תחילת הרטינופתיות מאופיינת בהפרעות עדינות בתפיסה החזותית, השינויים בקליעת כלי הדם הם הסימנים הראשונים שזוהו על ידי קלינאים. היעדר או נוכחות של ניאווסקולריזציה קובע אם הרטינופתיה מסווגת כלא-התפשטות (NPDR) או להתרבות (PDR). במובן זה, מספר מודלים של בעלי חיים ניסו לחקות תכונות כלי דם ספציפיות של כל שלב כדי לקבוע את המנגנונים הבסיסיים המעורבים בשינויים אנדותל, מוות עצבי ואירועים אחרים המתרחשים ברשתית. במאמר זה, אנו נספק תיאור מלא של ההליכים הנדרשים למדידת הפרמטרים של כלי הדם ברשתית אצל מבוגרים ועכברי לידה מוקדמת ביום שלאחר הלידה (P)17. אנו נפרט את הפרוטוקולים לביצוע כתמי כלי דם ברשתית עם Isolectin GSA-IB4 בהרים שלמים להדמיה מיקרוסקופית מאוחרת יותר. צעדים מרכזיים לעיבוד תמונה עם תוכנת Image J Fiji מסופקים גם הם, ולכן, הקוראים יוכלו למדוד את צפיפות כלי הדם, הקוטר והטורטואוזיות, הסתעפות כלי הדם, כמו גם אזורים וסקולריים וניאווסקולריים. כלים אלה מועילים מאוד כדי להעריך ולכמת שינויים בכלי הדם הן רטינופתיות שאינן מתרבות והן התפשטות.

כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול, מתוך בדיקת כתמים פלואורסצנטית אחת אתה יכול להשיג את המורפולוגיה של כלי הדם ולהעריך כמה פרמטרים של עניין כמותי. החיפוש אחר שינוי מסוים יהיה תלוי בסוג הרטינופתיה שנחקרה. במאמר זה, אזורים וסקולריים וניאו-וסקולריים, טורטואוזיות והרחבה הוערכו במודל עכבר של רטינופת?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies at JoVE.com

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

מאמר זה מתאר בדיקת כתמי לציטין מבוססת וניתן לשחזור עבור כל ההכנות לרשתית ההר ואת הפרוטוקולים הנדרשים למדידה כמותית של פרמטרים וסקולריים משתנים לעתים קרובות ברטינופתיות שגשוג ולא מתרבות.

כימות של פרמטרי כלי דם ברשתיות הר שלמות של עכברים עם רטינופתיות שאינן מתרבות ושגשוגות

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

ברטינופתיות, שינויים בכלי הדם הם הסימן הראשון שזוהה על ידי רופאים. הם עוקבים אחר התקדמות המחלה, והם בוחרים טיפול על פי שינויים אלה. מספר מודלים של בעלי חיים פותחו על מנת לחקור שלבים שונים של הפתולוגיה.בעבודה זו, אנחנו הולכים להראות כיצד למדוד שינויים שונים בכלי הדם. בשביל זה, אנחנו הולכים להעסיק שני מודלים בעלי חיים. אחד מהם הוא מודל עכבר רטינופתיה המושרה בחמצן, אשר משחזר את הרטינופתיה של פגות וכמה היבטים של רטינופתיה סוכרתית מתרבה.כאן, אנחנו הולכים למדוד אזורים וסקולריים, אזורים ניאו-וסקולריים, ואת הרחבה וטורטואוזיות של העורקים. במעבדה שלנו, פותח מודל עכבר תסמונת מטבולית, אשר גורם רטינופתיה nonproliferative. צפיפות כלי הדם והסתעפות הוערכו בעבודה זו.על הקרבת עכברים, enucleatize עם מספריים. תקן עיניים מפונקות עם paraformaldehyde מוכן טרי במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. תחת המיקרוסקופ המנתח, להסיר את הקרניות עם מספריים על ידי חיתוך לאורך הלימבוס ולנתח את הרשתיות כולה.השלך את המקטע הקדמי של העין ולאחר מכן הפרד את הרשתית מה- RPE-choroid. מניחים את הרשתיות ב-200 צינורות מיקרוליטר. לאחר מכן לחסום ולחלחל את הרשתיות ב 100 microliters של TBS המכיל 5% אלבומין סרום בקר טריטון במהלך שש שעות בארבע מעלות עם תסיסה עדינה בשייקר.לאחר מכן להפוך את הצינור כדי למקם את הרשתית בכוס ולהסיר את פתרון החסימה עם פיפטה. הוסף פתרון 100 מיקרוליטר המכיל איזולקטין. לעטוף את הצינורות עם רדיד אלומיניום כדי להגן על דגימות מפני אור.לדגור את הרשתיות עם פתרון לציטין לילה בארבע מעלות עם תסיסה עדינה בשייקר. לשטוף את הרשתיות עם 100 מיקרוליטרים של TBS-טריטון במשך 20 דקות עם תסיסה עדינה בשייקר. חזור על שלב זה שלוש פעמים.מניחים את הרשתית בשקופית ומוסיפים טיפה של PBS. תחת מיקרוסקופ ניתוח, בצע ארבעה חתכים רחוקים באותה מידה משולי הרשתית לכיוון עצב הראייה. כדי לפתוח את עלי הכותרת של הרשתית, השתמש מלקחיים או חתיכות קטנות של נייר מסנן.ודא שצד קולטן האור פונה כלפי מטה. הסר את ה- PBS הנותר מהשקופית עם נייר סינון. לאחר מכן הוסיפו חציון הרכבה וכיסוי.תן לו להתייבש במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. אחסן שקופיות בארבע מעלות מוגנות מפני אור. במיקרוסקופ הקונפוקלי, מקם את השקופית בצלחת עם הפנים כלפי מטה.למקד את מקלעת מעולה של כלי הרשתית ולבחור אזור כדי להתחיל את רכישת התמונה. הגדר פרמטרי לייזר כלליים בתוכנה. הגדר את הקואורדינטות בצירי X, Y ו- Z.אתחל את הסריקה. לאחר סיום תהליך הסריקה, פתח את התמונה ושמור אותה עם הרחבה מועדפת. בתוכנת ImageJ FIJI, עבור אל שורת התפריטים ולחץ על קובץ, פתח.בחר את התמונה לעיבוד. בחלון אפשרות ייבוא של תבניות ביולוגיות, בחר הצג מטה-נתונים של OME-XML ולחץ על OK.In חלון המטה-נתונים של OME, חפש מידע על גודל הפיקסלים. העתק נתונים אלה.לכיול תמונה, עברו לשורת התפריטים ובחרו 'מאפייני תמונה'. העתק את המידע ולחץ על אישור. הקצה פריט מועדף לתמונה. להצגה חזותית של כל הערימה בתמונה אחת, עבור אל שורת התפריטים ובחר תמונה, ערימות, Z Project.בחלון ההקרנה המוצג, בחר את כל הערימות שבהן מוצגים כלי שיט. בסוג הקרנה, בחרו 'עוצמה ממוצעת' ולחצו על הלחצן 'אשר'. עבור אל שורת התפריטים, תמונה, התאמה, בהירות/ניגודיות. לחץ על החל ושמור שינויים.העתק את הפרמטרים שנבחרו עבור בהירות וניגודיות. אלה חייבים להיות זהים לכל התמונות. בשורת התפריטים, בחרו בכלי שרביט.בחר את אזור הרשתית שחסרים לו כלי נגינה. הקש T בלוח המקשים כדי להקליט את האזורים הנבחרים במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ על מדוד במנהל ההחזר על ההשקעה כדי לקבל את המידע על אזור כלי הדם.חזור על שלבים אלה כדי למדוד את השטח הכולל של הרשתית. בשורת התפריטים, בחרו בכלי שרביט. הגדל את התצוגה של התמונה כדי לדמיין טוב יותר את neovessels.בחר את neovessels אחד אחד עם הכלי שרביט. הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ על מדוד במנהל החזר ההשקעות כדי לקבל את נתוני האזור.בשורת התפריטים, בחרו בכלי קו ישר. הגדל את התצוגה של התמונה כדי לדמיין טוב יותר את קיר כלי השיט. בצע שלושה קווים חוצים לכלי הראשי לפני הענף הראשון.הקש T בלוח המקשים כדי להקליט את האזורים הנבחרים במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ על מדוד במנהל החזר ההשקעות כדי לקבל את נתוני המרחק. בשורת התפריטים, לחץ על סמל הכלי קו ישר עם הלחצן השמאלי של העכבר ובחר קו מקוטע.צייר קו בתוך הכלי מעצב הראייה עד ההשפעה כלי השיט הראשון, בעקבות צורת כלי הדם. הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה. בשורת התפריטים, בחרו בכלי קו ישר.צייר קו מעצב הראייה עד השלכות כלי השיט הראשון. הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ על מדוד על מנהל ההחזר על ההשקעה כדי לקבל את נתוני המרחקים.בעזרת הכלי אליפסה של שורת התפריטים, הגדר אזור המוחל באופן שווה על כל תנאי הניסוי. האזור שנבחר חייב להיות עיגול קונצנטרי שצויר סביב עצב הראייה. הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה.באופן ידני, ספור את מספר הענפים הראשיים הנובעים מכלי שיט עיקריים בתוך אזור הבחירה. הפכו את התמונה למצב של 8 סיביות. עבור אל תוספים בשורת התפריטים, בחר ניתוח כלי דם, צפיפות כלי דם.הגדר אזור באמצעות הכלי ריבוע של שורת התפריטים שבו ברצונך למדוד את צפיפות כלי השיט. לחץ על אישור. התוכנית תציג חלון חדש עם המידע הנדרש. בדוגמה הניסיונית הראשונה, הועסק מודל עכבר רטינופתיה המושרה בחמצן.זריקות intravitreal בוצעו ביום שלאחר הלידה 12 כדי לקבוע את האפקטיביות של תרופה כמו אנטינגיוגני. עכברים שהוזרקו עם רכב הועסקו כבקרה. אזורי כלי הדם מוגדרים כאזורים חסרי כלי דם ברשתית.מן התמונות שנרכשו, אזורים וסקולריים ניתן לכמת כסכום של האזורים ללא כלי מחולק השטח הכולל של הרשתית. אזורים עם נזק מכני מראים גם היעדר כלי שיט. כדי לזהות אזורים פגומים, לנתח את השלמות של שכבות עצביות עם כתם Hoechst.Neovessels הם כלי קליבר קטנים שמקורם בכלי דם קיימים של מקלעת כלי הדם מעולה. חישבנו את האזור שנכבש על ידי הטאפטים של neovessels על ידי כימות האזור הניאו-וסקולרי של הרשתית שנכבשה על ידי השטח הכולל של הרשתית. מכיוון שצורתם וגודלם של neovessels משתנים, מדי פעם, הם יכולים להיראות דומים לפסולת וחפצים.כדי להבחין בין neovessels, ודא כי tuft גדל מכלי בוגר. לצורך ניתוח ההרחבה, מדדנו את קוטר הכלי העיקרי בשלושה גבהים לפני הענף הראשון. החוקרים חייבים להגדיר מרחק קבוע מראש כדי למדוד את קוטר הכלי על מנת להפחית את השונות בין התוצאות.באופן אידיאלי, הנקודה הרחוקה ביותר מעצב הראייה צריכה להיות סביב 300 מיקרומטרים. אנו מציעים לבצע את הניתוח, ומאוחר יותר, ממוצע של לפחות שישה בעלי חיים לכל מצב. לגבי טורטואוזיות, אנו מודדים את המרחק שעבר כלי השיט הראשי בעקבות צורתו, ביחס למרחק הקו הישר בין עצב הראייה לנקודת ההסתעפות הראשונה.כפי שאנו יכולים לראות בתמונה, יש הטרוגניות בסינוסיות של כלי הדם העיקריים. כדי להשיג תוצאה מייצגת, יש לכמת לא פחות משישה עכברים לכל תנאי. הפרמטרים האחרונים, הסתעפות כלי דם וצפיפות, נותחו במודל תסמונת מטבולית המציגה רטינופתיה לא מתרבות.לצורך מדידת הסתעפות כלי הדם, הגדרנו את אזור הכימות על ידי ציור מעגל קונצנטרי, ואז ספרנו, בזה אחר זה, את הענפים העיקריים הנובעים מכלי מרכזי ראשי. מהתמונות שנרכשו, צפיפות כלי הדם כונתה כשטח הכבוש על ידי כלי דם מחולקים על ידי שטח ההחזר על ההשקעה, אשר הוצב במקומות שונים בכל מיקרופוטוגרפיה. הימנע מכמת אזורים עם נזק מכני.אם יש יותר משני אזורים עם נקבים, יש להשליך את הרשתית. לסיכום, במאמר זה, הראינו טכניקות קלאסיות, מבוססות היטב ושחזור כדי לכמת כמה מהפרמטרים הרלוונטיים ביותר תוך התחשבות בפרקטיקה הקלינית.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתיות

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

הר תיוג כל צילה במערכת חוש הריח העיקרית של עכברים

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV בתיווך ביטוי transgene של מבנים Chimeric ללמוד לתפקד ההתנהגות של Heteromers GPCR עכברים

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...