Name: quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies
Uploaded: 2022-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies at JoVE.com

Ringraziamo Carlos Mas, María Pilar Crespo e Cecilia Sampedro di CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) per l'assistenza nella microscopia confocale, a Soledad Miró e Victoria Blanco per la cura dedicata degli animali e Laura Gatica per l'assistenza istologica. Ringraziamo anche Victor Diaz (Pro-Segretario della Comunicazione Istituzionale di FCQ) per la produzione e l'edizione video e Paul Hobson per la sua lettura critica e revisione linguistica del manoscritto.
Questo articolo è stato finanziato da sovvenzioni di Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (all to M.C.S.).

I topi C57BL / 6J sono stati gestiti secondo le linee guida della dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva. Le procedure sperimentali sono state progettate e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (CICUAL) della Facoltà di Scienze Chimiche, Università Nazionale di Córdoba (Res. HCD 1216/18).
1. Preparazione di soluzioni tampone e reagenti
<ol><li>Preparazione di 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS): A...

<ol>
	<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease.">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li><li>McDougal, D. H., Gamlin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+control+of+the+eye.">Autonomic control of the eye.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).</li><li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease.">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+alterations+in+the+retinal+microvasculature,+microcirculation,+and+microstructure.">Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).</li><li>Lavia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vessel+density+in+the+superficial+and+deep+plexuses+in+diabetic+retinopathy+is+associated+with+structural+changes+in+corresponding+retinal+layers.">Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers.</a> PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).</li><li>Rosenblatt, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+in+a+rigorous+longitudinal+image-based+assessment+of+retinopathy+of+prematurity.">Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).</li><li>Edwards, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Funduscopic+examination+of+patients+with+diabetes+who+are+admitted+to+hospital.">Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital.</a> Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).</li><li>Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+associated+with+diabetic+retinopathy.">The pathology associated with diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 7-14 (2017).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=angiography+metrics+predict+progression+of+diabetic+retinopathy+and+development+of+diabetic+macular+edema:+A+prospective+study.">angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study.</a> Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+coherence+tomography+angiography+of+vascular+abnormalities+in+the+living+human+eye.">Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).</li><li>Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+vascular+changes+in+macular+telangiectasia+type+2:+comparison+between+SD-OCT+and+OCT+angiography.">Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).</li><li>Gammons, M. V., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+oxygen+induced+retinopathy+in+rodents.">Models of oxygen induced retinopathy in rodents.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-203a-3p+inhibits+retinal+angiogenesis+and+alleviates+proliferative+diabetic+retinopathy+in+oxygen-induced+retinopathy+(OIR)+rat+model+via+targeting+VEGFA+and+HIF-1&#945;.">MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1&#945;.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).</li><li>Paz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+syndrome+triggered+by+fructose+diet+impairs+neuronal+function+and+vascular+integrity+in+ApoE-KO+mouse+retinas:+Implications+of+autophagy+deficient+activation.">Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li><li>Zarb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ossified+blood+vessels+in+primary+familial+brain+calcification+elicit+a+neurotoxic+astrocyte+response.">Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response.</a> Brain. 142 (4), 885-902 (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+autophagy+modulators+on+vascular,+glial,+and+neuronal+alterations+in+the+oxygen-induced+retinopathy+mouse+model.">Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).</li><li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye.">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li><li>Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+mouse+model+of+oxygen-induced+retinopathy.">Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy.</a> Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).</li><li>Guaiquil, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+retinopathy+of+prematurity+identifies+endothelial+cell+proliferation+as+a+potential+mechanism+for+plus+disease.">A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).</li><li>Mezu-Ndubuisi, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+angiography+quantifies+oxygen-induced+retinopathy+vascular+recovery.">In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery.</a> Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).</li><li>Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+vascular+tortuosity+as+an+early+outcome+measure+in+oxygen+induced+retinopathy+(OIR).">Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR).</a> Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microvascular+density+and+morphology+in+diabetic+retinopathy+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography+angiography.">Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 362 (2016).</li><li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ocular+angiogenesis:+from+development+to+pathologies.">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+diabetic+retinopathy:+Contribution+and+limitations+of+laboratory+research.">Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research.</a> Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).</li><li>Lorenc, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1R+regulates+the+extracellular+level+of+active+MMP-2,+pathological+neovascularization,+and+functionality+in+retinas+of+OIR+mouse+model.">IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model.</a> Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).</li><li>Ma, N., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+microglia+as+passenger+leukocytes+to+the+fate+of+intraocular+neuronal+retinal+grafts.">Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).</li><li>Mazzaferri, J., Larriv&#233;e, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+machine+learning+approach+for+automated+assessment+of+retinal+vasculature+in+the+oxygen+induced+retinopathy+model.">A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).</li><li>Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+in+3D:+quantification+of+vascular+growth+and+remodeling.">The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+indirect+contact+coculture+decrease+integrity+of+inner+blood-retina+barrier+model+in+vitro+by+upgrading+MMP-2/9+activity.">Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity.</a> Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).</li><li>Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDF-deficient+mice+exhibit+an+enhanced+rate+of+retinal+vascular+expansion+and+are+more+sensitive+to+hyperoxia-mediated+vessel+obliteration.">PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).</li><li>Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+D-amino+acid+oxidase+prevents+retinal+neurovascular+pathologies+in+diabetic+rats.">Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats.</a> Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).</li></ol>

I modelli animali di retinopatie sono potenti strumenti per studiare lo sviluppo vascolare, il rimodellamento o l'angiogenesi patologica. Il successo di questi studi sul campo si basa sul facile accesso al tessuto che consente di eseguire un'ampia varietà di tecniche, fornendo dati da topi in vivo e post mortem26,27. Inoltre, è stata trovata una grande correlazione tra studi in vivo e analisi cliniche, fornendo una solida tracciabilit...

Gli occhi sono nutriti da due sistemi arterio-venosi: la vascolarizzazione coroidale, una rete vascolare esterna che irriga l'epitelio pigmentato retinico e i fotorecettori; e la vascolarizzazione neuro-retinica che irriga lo strato di cellule gangliari e lo strato nucleare interno della retina1. La vascolarizzazione retinica è una rete organizzata di vasi che forniscono nutrienti e ossigeno alle cellule retiniche e raccolgono prodotti di scarto per garantire una corretta trasduzione della segnalazione visiva. Questa vascolarizzazione ha alcune caratteristiche distinte, tra cui: la mancanza di innervazione autonoma, la regolazione del tono vascolare da meccanismi retinici intrinseci e il possesso di una complessa barriera retinico-ematica2. Pertanto, la vascolarizzazione retinica è stata al centro di molti ricercatori che hanno ampiamente studiato non solo la vasculogenesi durante lo sviluppo, ma anche le alterazioni e l'angiogenesi patologica che questi vasi subiscono nelle malattie3. I cambiamenti vascolari più comuni osservati nelle retinopatie sono la dilatazione dei vasi, la neovascolarizzazione, la perdita di arborizzazione vascolare e la deformazione dei vasi principali della retina, che li rende più ziggaggy4,5,6. Una o più delle alterazioni descritte sono i primi segni che devono essere rilevati dai medici. La visualizzazione vascolare fornisce un metodo di screening rapido, non invasivo ed economico7. Lo studio approfondito delle alterazioni osservate nell'albero vascolare determinerà se la retinopatia non è proliferativa o proliferativa e l'ulteriore trattamento. Le retinopatie non proliferative possono manifestarsi con morfologia vascolare aberrante, diminuzione della densità vascolare, capillari acellulari, morte dei periciti, edema maculare, tra gli altri. Inoltre, le retinopatie proliferative sviluppano anche una maggiore permeabilità vascolare, rimodellamento extracellulare e formazione di ciuffi vascolari verso la cavità vitrea che facilmente si rompono o inducono il distacco della retina8.
Una volta rilevata, la retinopatia può essere monitorata attraverso i suoi cambiamenti vascolari9,10. La progressione della patologia può essere seguita attraverso i cambiamenti strutturali dei vasi, che definiscono chiaramente le fasi della malattia11. La quantificazione delle alterazioni vascolari in questi modelli ha permesso di correlare i cambiamenti vascolari e la morte neuronale e di testare terapie farmacologiche per pazienti in diverse fasi della malattia.
Alla luce delle affermazioni di cui sopra, riteniamo che il riconoscimento e la quantificazione delle alterazioni vascolari siano fondamentali negli studi sulle retinopatie. In questo lavoro, mostreremo come misurare diversi parametri vascolari. Per fare ciò, impiegheremo due modelli animali. Uno di questi è il modello murino di retinopatia indotta da ossigeno12, che imita la retinopatia della prematurità e alcuni aspetti della retinopatia diabetica proliferativa13,14. In questo modello, misureremo le aree avascolare, le aree neovascolari e la dilatazione e la tortuosità dei vasi principali. Nel nostro laboratorio è stato sviluppato un modello murino di Sindrome Metabolica (MetS), che induce una retinopatia non proliferativa15. Qui, valuteremo la densità vascolare e la ramificazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminuim foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4503</td>
			<td>quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>9632.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope FV1200</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td>with motorized plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covers</td>
			<td>Paul Marienfeld GmnH &#38; Co.</td>
			<td>111520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>119753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L&#160; tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z316121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA5201090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker GyroMini</td>
			<td>LabNet International</td>
			<td>S0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>SANXIN</td>
			<td>PHS-3D-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Analysis Fiji software</td>
			<td>Mai Elfarnawany</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Vessel_Analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies

Le retinopatie sono un gruppo eterogeneo di malattie che colpiscono il tessuto neurosensoriale dell'occhio. Sono caratterizzati da neurodegenerazione, gliosi e un progressivo cambiamento della funzione e della struttura vascolare. Sebbene l'insorgenza delle retinopatie sia caratterizzata da sottili disturbi nella percezione visiva, le modifiche nel plesso vascolare sono i primi segni rilevati dai medici. L'assenza o la presenza di neovascolarizzazione determina se la retinopatia è classificata come non proliferativa (NPDR) o proliferativa (PDR). In questo senso, diversi modelli animali hanno cercato di imitare specifiche caratteristiche vascolari di ogni stadio per determinare i meccanismi sottostanti coinvolti nelle alterazioni dell'endotelio, nella morte neuronale e in altri eventi che si verificano nella retina. In questo articolo, forniremo una descrizione completa delle procedure necessarie per la misurazione dei parametri vascolari retinici negli adulti e nei topi di parto precoce al giorno postnatale (P)17. Descriveremo in dettaglio i protocolli per eseguire la colorazione vascolare retinica con Isolectina GSA-IB4 in supporti interi per una successiva visualizzazione microscopica. Vengono inoltre forniti passaggi chiave per l'elaborazione delle immagini con il software Image J Fiji, pertanto i lettori saranno in grado di misurare la densità del vaso, il diametro e la tortuosità, la ramificazione vascolare e le aree avascolari e neovascolari. Questi strumenti sono molto utili per valutare e quantificare le alterazioni vascolari sia nelle retinopatie non proliferative che in quelle proliferative.

Come descritto nella sezione protocollo, da un singolo test di colorazione fluorescente è possibile ottenere la morfologia vascolare e valutare quantitativamente diversi parametri di interesse. La ricerca di un'alterazione specifica dipenderà dal tipo di retinopatia studiata. In questo articolo, le aree avascolare e neovascolare, la tortuosità e la dilatazione sono state valutate in un modello murino di retinopatia proliferativa, mentre la ramificazione e la densità vascolare sono state analizzate in un modello murin...

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Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Questo articolo descrive un saggio di colorazione lectina ben consolidato e riproducibile per l'intero monte di preparati retinici e i protocolli necessari per la misurazione quantitativa di parametri vascolari frequentemente alterati nelle retinopatie proliferative e non proliferative.

Quantificazione dei parametri vascolari nelle retine a montaggio intero di topi con retinopatie non proliferative e proliferative

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

Nelle retinopatie, le alterazioni vascolari sono il primo segno che viene rilevato dai medici. Seguono la progressione della malattia e scelgono un trattamento in base a questi cambiamenti. Sono stati sviluppati diversi modelli animali per studiare le diverse fasi della patologia.In questo lavoro, mostreremo come misurare diverse alterazioni vascolari. Per questo, impiegheremo due modelli animali. Uno di questi è il modello murino di retinopatia indotta da ossigeno, che riproduce la retinopatia della prematurità e alcuni aspetti della retinopatia diabetica proliferativa.Qui, misureremo le aree avascolari, le aree neovascolari e la dilatazione e la tortuosità delle arteriole. Nel nostro laboratorio è stato sviluppato un modello murino di sindrome metabolica, che induce una retinopatia non proliferativa. In questo lavoro sono state valutate la densità vascolare e la ramificazione.Al sacrificio dei topi, enucleatizza con le forbici. Fissare gli occhi enucleati con paraformaldeide appena preparata per un'ora a temperatura ambiente. Sotto il microscopio sezionante, rimuovere le cornee con le forbici tagliando lungo il limbus e sezionare l'intera retina.Scartare il segmento anteriore dell'occhio e quindi separare la retina dalla coroide RPE. Posizionare le retine in 200 tubi microlitro. Quindi bloccare e permeabilizzare le retine in 100 microlitri di TBS contenenti il 5% di albumina sierica bovina Tritone per sei ore a quattro gradi con una delicata agitazione nello shaker.Quindi invertire il tubo per posizionare la retina nella tazza e rimuovere la soluzione bloccante con pipetta. Aggiungere 100 microlitri di soluzione contenente isolectina. Avvolgere i tubi con un foglio di alluminio per proteggere i campioni dalla luce.Incubare le retine con soluzione di lectina durante la notte a quattro gradi con una delicata agitazione nello shaker. Lavare le retine con 100 microlitri di TBS-Triton per 20 minuti con una delicata agitazione nello shaker. Ripetere questo passaggio tre volte.Posizionare la retina in un vetrino e aggiungere una goccia di PBS. Al microscopio di dissezione, eseguire quattro tagli ugualmente distanti dai bordi della retina verso il nervo ottico. Per aprire i petali della retina, utilizzare una pinza o piccoli pezzi di carta da filtro.Assicurarsi che il lato del fotorecettore sia rivolto verso il basso. Rimuovere il PBS rimanente dalla diapositiva con carta da filtro. Quindi aggiungere una mediana di montaggio e una coverslip.Lasciare asciugare per un'ora a temperatura ambiente. Conservare le diapositive a quattro gradi al riparo dalla luce. Al microscopio confocale, posizionare il vetrino nella piastra a faccia in giù.Focalizzare il plesso superiore della vascolarizzazione retinica e selezionare un'area per avviare l'acquisizione dell'immagine. Impostare i parametri laser generali nel software. Impostate le coordinate sugli assi X, Y e Z.Inizializzare la scansione. Al termine del processo di scansione, aprire l'immagine e salvarla con un'estensione preferita. Nel software ImageJ FIJI, vai alla barra dei menu e fai clic su File, Apri.Selezionare l'immagine da elaborare. Nella finestra Opzione di importazione bioformati, selezionare Visualizza metadati OME-XML e fare clic OK.In finestra Metadati OME, cercare informazioni sulle dimensioni dei pixel. Copiare questi dati.Per la calibrazione dell'immagine, vai alla barra dei menu e seleziona Proprietà immagine. Copiare le informazioni e fare clic su OK. Assegna una lut preferita all'immagine. Per visualizzare tutti gli stack in una singola immagine, vai alla barra dei menu e seleziona Immagine, Stack, Progetto Z.Nella finestra di proiezione visualizzata, selezionare tutte le pile in cui vengono visualizzate le navi. In Tipo proiezione (Projection Type), selezionate Intensità media (Average Intensity) e fate clic su OK. Vai alla barra dei menu, Immagine, Regola, Luminosità / Contrasto. Fare clic su Applica e salvare le modifiche.Copiare i parametri selezionati per luminosità e contrasto. Questi devono essere identici per tutte le immagini. Nella barra dei menu scegliere lo strumento bacchetta.Seleziona l'area retinica che manca di vasi formati. Premere T sulla tastiera per registrare le aree selezionate in ROI Manager. Fare clic su Misura nel ROI Manager per ottenere le informazioni sull'area avascolare.Ripetere questi passaggi per misurare l'area totale della retina. Nella barra dei menu scegliere lo strumento bacchetta. Ingrandisci l'immagine per visualizzare meglio i neovasi.Selezionate i neovasi uno per uno con lo strumento bacchetta. Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager. Fare clic su Misura nel ROI Manager per ottenere i dati dell'area.Nella barra dei menu, selezionate lo strumento Linea retta. Ingrandisci l'immagine per visualizzare meglio la parete della nave. Eseguire tre linee trasversali alla nave principale prima del primo ramo.Premere T sulla tastiera per registrare le aree selezionate nel ROI Manager. Fare clic su Misura in ROI Manager per ottenere i dati sulla distanza. Nella barra dei menu, fate clic sull'icona dello strumento Linea retta con il tasto destro del mouse e selezionate Linea segmentata.Tracciare una linea all'interno del vaso dal nervo ottico fino alla prima ramificazione del vaso, seguendo la forma vascolare. Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager. Nella barra dei menu, selezionate lo strumento Linea retta.Disegna una linea dal nervo ottico fino alla prima ramificazione del vaso. Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager. Fare clic su Misura nel ROI Manager per ottenere i dati sulle distanze.Con lo strumento Ovale della barra dei menu, definite un'area applicata equamente a tutte le condizioni sperimentali. L'area selezionata deve essere un cerchio concentrico disegnato attorno al nervo ottico. Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager.Contare manualmente il numero di rami primari derivanti dalle navi principali all'interno dell'area di selezione. Trasforma l'immagine in modalità a 8 bit. Vai a Plugin nella barra dei menu, seleziona Analisi dei vasi, Densità vascolare.Definite un'area con lo strumento quadrato della barra dei menu in cui desiderate misurare la densità del recipiente. Fare clic su OK. Il programma visualizzerà una nuova finestra con le informazioni richieste. Nel primo esempio sperimentale, è stato utilizzato il modello murino di retinopatia indotta da ossigeno.Le iniezioni intravitreali sono state eseguite al giorno 12 postnatale per determinare l'efficacia di un farmaco come antiangiogenico. I topi iniettati con il veicolo sono stati impiegati come controllo. Le aree avascolari sono definite come le zone che mancano di vasi sanguigni retinici.Dalle immagini acquisite, le aree avascolari possono essere quantificate come la somma delle regioni senza vasi divise l'area totale della retina. Le aree con danni meccanici mostrano anche l'assenza di navi. Per identificare le aree danneggiate, analizzare l'integrità degli strati neuronali con la macchia di Hoechst.I neovasi sono vasi di piccolo calibro che provengono da vasi preesistenti del plesso vascolare superiore. Abbiamo calcolato l'area occupata dai ciuffi dei neovasi quantificando l'area neovascolare della retina occupata dall'area totale della retina. Poiché la forma e le dimensioni dei neovasi sono variabili, occasionalmente possono sembrare simili a detriti e artefatti.Per distinguere i neovasi, verificare che il ciuffo cresca da una nave matura. Per l'analisi della dilatazione, abbiamo misurato il diametro principale del vaso a tre altezze prima del primo ramo. I ricercatori devono definire una distanza predeterminata per misurare il diametro del vaso al fine di ridurre la variabilità tra i risultati.Idealmente, il punto più lontano dal nervo ottico dovrebbe essere di circa 300 micrometri. Suggeriamo di eseguire l'analisi, e in seguito, la media di almeno sei animali per condizione. Per quanto riguarda la tortuosità, misuriamo la distanza percorsa dal vaso principale seguendo la sua forma, rispetto alla distanza in linea retta tra il nervo ottico e il primo punto di ramificazione.Come possiamo vedere nell'immagine, c'è eterogeneità nella sinuosità dei vasi principali. Per ottenere un risultato rappresentativo, devono essere quantificati non meno di sei topi per condizione. Gli ultimi parametri, ramificazione vascolare e densità, sono stati analizzati in un modello di sindrome metabolica che presenta retinopatia non proliferativa.Per la misura della ramificazione vascolare, abbiamo definito l'area di quantificazione disegnando un cerchio concentrico, e poi abbiamo contato, uno per uno, i rami primari derivanti da un vaso centrale principale. Dalle immagini acquisite, la densità vascolare è stata quantificata come l'area occupata dai vasi divisa per l'area del ROI, che è stata posizionata in luoghi diversi in ciascuna microfotografia. Evitare di quantificare le aree con danni meccanici.Se ci sono più di due aree con punture, la retina deve essere scartata. In sintesi, in questo articolo, abbiamo mostrato tecniche classiche, consolidate e riproducibili per quantificare alcuni dei parametri più rilevanti tenendo conto nella pratica clinica.

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