Name: quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies
Uploaded: 2022-03-12T15:00:00
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카를로스 마스, 마리아 필라르 크레스포, CEMINCO의 세실리아 삼페드로(센트로 드 마이크로 이 나노스코피아 코르도바, 코니스트-UNC, 코르도바, 아르헨티나)에게 공초점 현미경 검사법을 지원해 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 빅터 디아즈 (FCQ의 기관 커뮤니케이션의 프로 장관)와 원고의 비판적 인 읽기 및 언어 개정에 대한 폴 홉슨에게 감사드립니다.
이 문서는 Secretaría de Ciencia y Tecnología의 보조금에 의해 지원되었으며, 유니버시다드 나시오날 드 코르도바 (SECyT-UNC) 콘솔더 2018-2021, 폰도 파라 라 Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), 프로익토 데 Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015..C N4.

C57BL/6J 마우스는 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용을 위한 ARVO 성명서의 지침에 따라 처리되었다. 실험 절차는 코르도바 국립 화학 과학 학부의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (CICUAL)에 의해 설계 및 승인되었습니다 (Res. HCD 1216/18).
1. 완충 솔루션 및 시약 준비
<ol><li>1x 인산염 완충식식염(PBS): 염화나트륨 8g(NaCl), 염화칼륨 0.2g(KCl), 디나트륨-수소포 14.4g 추가 증류...

<ol>
	<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease.">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li><li>McDougal, D. H., Gamlin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+control+of+the+eye.">Autonomic control of the eye.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).</li><li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease.">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+alterations+in+the+retinal+microvasculature,+microcirculation,+and+microstructure.">Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).</li><li>Lavia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vessel+density+in+the+superficial+and+deep+plexuses+in+diabetic+retinopathy+is+associated+with+structural+changes+in+corresponding+retinal+layers.">Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers.</a> PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).</li><li>Rosenblatt, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+in+a+rigorous+longitudinal+image-based+assessment+of+retinopathy+of+prematurity.">Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).</li><li>Edwards, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Funduscopic+examination+of+patients+with+diabetes+who+are+admitted+to+hospital.">Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital.</a> Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).</li><li>Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+associated+with+diabetic+retinopathy.">The pathology associated with diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 7-14 (2017).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=angiography+metrics+predict+progression+of+diabetic+retinopathy+and+development+of+diabetic+macular+edema:+A+prospective+study.">angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study.</a> Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+coherence+tomography+angiography+of+vascular+abnormalities+in+the+living+human+eye.">Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).</li><li>Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+vascular+changes+in+macular+telangiectasia+type+2:+comparison+between+SD-OCT+and+OCT+angiography.">Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).</li><li>Gammons, M. V., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+oxygen+induced+retinopathy+in+rodents.">Models of oxygen induced retinopathy in rodents.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-203a-3p+inhibits+retinal+angiogenesis+and+alleviates+proliferative+diabetic+retinopathy+in+oxygen-induced+retinopathy+(OIR)+rat+model+via+targeting+VEGFA+and+HIF-1&#945;.">MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1&#945;.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).</li><li>Paz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+syndrome+triggered+by+fructose+diet+impairs+neuronal+function+and+vascular+integrity+in+ApoE-KO+mouse+retinas:+Implications+of+autophagy+deficient+activation.">Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li><li>Zarb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ossified+blood+vessels+in+primary+familial+brain+calcification+elicit+a+neurotoxic+astrocyte+response.">Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response.</a> Brain. 142 (4), 885-902 (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+autophagy+modulators+on+vascular,+glial,+and+neuronal+alterations+in+the+oxygen-induced+retinopathy+mouse+model.">Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).</li><li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye.">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li><li>Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+mouse+model+of+oxygen-induced+retinopathy.">Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy.</a> Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).</li><li>Guaiquil, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+retinopathy+of+prematurity+identifies+endothelial+cell+proliferation+as+a+potential+mechanism+for+plus+disease.">A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).</li><li>Mezu-Ndubuisi, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+angiography+quantifies+oxygen-induced+retinopathy+vascular+recovery.">In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery.</a> Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).</li><li>Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+vascular+tortuosity+as+an+early+outcome+measure+in+oxygen+induced+retinopathy+(OIR).">Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR).</a> Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microvascular+density+and+morphology+in+diabetic+retinopathy+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography+angiography.">Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 362 (2016).</li><li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ocular+angiogenesis:+from+development+to+pathologies.">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+diabetic+retinopathy:+Contribution+and+limitations+of+laboratory+research.">Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research.</a> Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).</li><li>Lorenc, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1R+regulates+the+extracellular+level+of+active+MMP-2,+pathological+neovascularization,+and+functionality+in+retinas+of+OIR+mouse+model.">IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model.</a> Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).</li><li>Ma, N., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+microglia+as+passenger+leukocytes+to+the+fate+of+intraocular+neuronal+retinal+grafts.">Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).</li><li>Mazzaferri, J., Larriv&#233;e, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+machine+learning+approach+for+automated+assessment+of+retinal+vasculature+in+the+oxygen+induced+retinopathy+model.">A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).</li><li>Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+in+3D:+quantification+of+vascular+growth+and+remodeling.">The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+indirect+contact+coculture+decrease+integrity+of+inner+blood-retina+barrier+model+in+vitro+by+upgrading+MMP-2/9+activity.">Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity.</a> Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).</li><li>Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDF-deficient+mice+exhibit+an+enhanced+rate+of+retinal+vascular+expansion+and+are+more+sensitive+to+hyperoxia-mediated+vessel+obliteration.">PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).</li><li>Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+D-amino+acid+oxidase+prevents+retinal+neurovascular+pathologies+in+diabetic+rats.">Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats.</a> Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).</li></ol>

망막병증의 동물 모델은 혈관 발달, 리모델링 또는 병리학 적 혈관 신생을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 현장에서 이러한 연구의 성공은 생체 내 및 사후 마우스26,27에서 데이터를 제공하는 다양한 기술을 수행 할 수있는 조직에 쉽게 접근할 수 있습니다. 더욱이, 생체 내 연구와 임상 분석 사이에 큰 상관관계가 발견되어 이러?...

눈은 두 개의 arterio 정맥 시스템에 의해 양육된다: choroidal 혈관 분과, 망막 색소 상피 및 광수용체를 관성 외부 혈관 네트워크; 및 신경망막 혈관분과 는 신경절 세포 층과 망막1의 내부 핵 층을 관개합니다. 망막 혈관은 망막 세포에 영양분과 산소를 전달하고 적절한 시각적 신호 전달을 보장하기 위해 폐기물을 수확하는 혈관의 조직된 네트워크입니다. 이 혈관분피는 자율적 인 내적 눈부기의 부족, 본질적인 망막 메커니즘에 의한 혈관 톤의 조절 및 복잡한 망막 혈액 장벽2의 소유를 포함하여 몇 가지 뚜렷한 특징을 가지고 있습니다. 따라서 망막 혈관증은 발달 중 혈관 발생뿐만 아니라 이러한 혈관이 질병에서 겪는 변화 및 병리학 적 혈관 신생을 광범위하게 연구한 많은 연구자의 초점이었습니다3. 망막병증에서 관찰되는 가장 흔한 혈관 변화는 혈관 팽창, 난혈관화, 혈관 절단 손실 및 망막 주요 혈관의 변형으로 인해 더 지그게4,5,6입니다. 설명된 변경의 하나 이상은 임상의에 의해 검출될 초기 표시입니다. 혈관 시각화는 신속하고 비침습적이며 저렴한 스크리닝 방법을 제공합니다7. 혈관 나무에서 관찰 된 변경의 광범위한 연구는 망막증이 비 증식 또는 증식 및 추가 치료인지 여부를 결정합니다. 비 증식 망막병증은 비정상적인 혈관 형태, 감소 된 혈관 밀도, 세포 세포 모세 혈관, 백혈구 죽음, 황반 부종, 다른 사람의 사이에서 자신을 나타낼 수 있습니다. 또한, 증식성 망막병증은 또한 혈관 투과성, 세포외 리모델링 및 혈관 터프트의 형성을 쉽게 분해하거나 망막 분리를 유도하는 유리체 구멍을 향한 형성을 개발한다8.
일단 검출되면, 망막병증은 혈관 변경을 통해 감시될 수 있습니다9,10. 병리학의 진행은 질병의 단계를 명확하게 정의하는 혈관의 구조적 변화를 통해 따를 수 있습니다11. 이 모형에 있는 혈관 변경의 정량화는 혈관 변경 및 신경 죽음을 상관연관하고 질병의 다른 단계에서 환자를 위한 약리학 치료를 시험하는 것을 허용했습니다.
위의 진술에 비추어 볼 때, 우리는 혈관 변경의 인식과 정량화가 망막 병증 연구에서 근본적이라고 생각한다. 이 작품에서는 다양한 혈관 매개 변수를 측정하는 방법을 보여줍니다. 이를 위해 두 가지 동물 모델을 사용할 것입니다. 그 중 하나는 미숙아의 망막병증과 증식 당뇨병 성 망막증의 일부 측면을 모방 산소 유발 망막병마우스 model12입니다13,14. 이 모델에서는 혈관 영역, 난바혈관 지역 및 주요 선박의 팽창 및 불법성을 측정합니다. 우리의 실험실에서, 신진 대사 증후군 (MetS) 마우스 모델이 개발되었습니다, 이는 비 증식 성 망막증을 유도15. 여기에서 혈관 밀도와 분기를 평가합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminuim foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4503</td>
			<td>quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>9632.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope FV1200</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td>with motorized plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covers</td>
			<td>Paul Marienfeld GmnH &#38; Co.</td>
			<td>111520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>119753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L&#160; tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z316121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA5201090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker GyroMini</td>
			<td>LabNet International</td>
			<td>S0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>SANXIN</td>
			<td>PHS-3D-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Analysis Fiji software</td>
			<td>Mai Elfarnawany</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Vessel_Analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies

망막병증은 눈의 신경 감각 조직에 영향을 미치는 질병의 이질적인 그룹입니다. 그(것)들은 신경 변성, 글리오오스 및 혈관 기능 및 구조물에 있는 진보적인 변경에 의해 특징입니다. 망막증의 발병은 시각적 지각에 있는 미묘한 교란에 있는 특징이더라도, 혈관 신경병의 수정은 임상의에 의해 검출된 첫번째 표시입니다. 신생 혈관화의 부재 또는 존재는 망막병증이 비 증식 (NPDR) 또는 증식 (PDR)으로 분류되는지 여부를 결정합니다. 이러한 의미에서, 몇몇 동물 모형은 각 단계의 특정 혈관 특징을 모방하기 위하여 망막에서 일어나는 내피성 변경, 신경 죽음 및 그밖 사건에 관련되었던 근본적인 기계장치를 결정하기 위하여 시도했습니다. 본 기사에서는 산후일(P)17시에 성인 및 조기 출생 마우스의 망막 혈관 파라미터 측정에 필요한 절차에 대한 완전한 설명을 제공할 것입니다. 우리는 나중에 현미경 시각화를위한 전체 마운트에 이솔록틴 GSA-IB4와 망막 혈관 염색을 수행하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. Image J Fiji 소프트웨어로 이미지 처리를 위한 주요 단계도 제공되므로 독자는 혈관 밀도, 직경 및 불법성, 혈관 분기뿐만 아니라 혈관 및 외반 영역을 측정할 수 있습니다. 이러한 도구는 비증식 및 증식 성 망막병모두에서 혈관 변화를 평가하고 정량화하는 데 매우 유용합니다.

프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이, 단일 형광 염색 분석에서 혈관 형태를 얻고 여러 파라미터의 이자파라미터를 정량적으로 평가할 수 있다. 특정 변경의 검색은 연구 된 망막병증의 유형에 따라 달라집니다. 본 기사에서는 혈관 및 중혈관 부위, 대망막 및 팽창이 증식 망막증의 마우스 모델에서 평가된 반면, 혈관 분진 및 밀도는 비증식 망막증을 유도하는 MetS 마우스 모델에서 분석되었다.
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Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

이 문서에서는 전체 마운트 망막 제제및 증식 및 비증식 망막병에서 자주 변경되는 혈관 매개 변수의 정량적 측정에 필요한 프로토콜에 대해 잘 확립되고 재현 가능한 렉틴 얼룩 분석법에 대해 설명합니다.

비증식 및 증식 망막증을 가진 마우스의 전체 산 망막에 있는 혈관 매개변수의 정량화

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

망막병증에서 혈관 변경은 임상의에 의해 검출되는 첫번째 표시입니다. 그(것)들은 질병의 진행을 따르고, 그(것)들은 이 변경에 따라 처리를 선택합니다. 여러 동물 모델은 병리학의 다른 단계를 연구하기 위해 개발되었습니다.이 작품에서, 우리는 다른 혈관 변경을 측정하는 방법을 보여 줄 것입니다. 이를 위해, 우리는 두 개의 동물 모델을 고용 할 것입니다. 이들 중 하나는 미숙아의 망막병증과 증식 당뇨병 성 망막증의 일부 측면을 재현하는 산소 유도 망막병증 마우스 모델입니다.여기서 우리는 혈관 지역, 난바혈관 지역, 동맥의 팽창과 불법성을 측정할 것입니다. 우리의 실험실에서는, 비증식 망막증을 유도하는 신진 대사 증후군 마우스 모형이 개발되었습니다. 이 작업에서 혈관 밀도 및 분기를 평가하였다.마우스 희생시, 가위로 방출한다. 실온에서 1시간 동안 갓 준비된 파라포름알데히드로 에뉴클레오드 눈을 고정합니다. 해부 현미경에서, 림부를 따라 절단하여 가위로 각막을 제거하고 전체 망막을 해부.눈의 전방 세그먼트를 버리고 망막을 RPE-choroid에서 분리합니다. 망막을 200 마이크로리터 튜브에 놓습니다. 그런 다음 5%의 소 세럼 알부민 트리톤이 함유된 100마이크로리터의 망막을 4도에서 4도에서 쉐이커에서 부드럽게 교반합니다.그런 다음 튜브를 반전하여 망막을 컵에 넣고 파이펫으로 차단 용액을 제거합니다. 이솔록틴을 함유한 100마이크로리터 용액을 추가합니다. 알루미늄 호일로 튜브를 감싸서 샘플을 빛으로부터 보호합니다.레티나에 레티나를 4도에서 4도에서 배양하고 셰이커에 부드러운 동요를 가린다. 100 마이크로리터의 TBS-트리톤으로 망막을 20분간 씻어 내며 쉐이커에 부드러운 교반을 합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.망막을 슬라이드에 넣고 PBS 한 방울을 추가합니다. 해부 현미경에서, 시신경을 향해 망막의 가장자리에서 4 개의 동등하게 먼 상처를 수행. 망막의 꽃잎을 펼치려면 집게 또는 작은 필터 용지를 사용하십시오.광수용체 측이 아래로 향하고 있는지 확인합니다. 필터 용지로 슬라이드에서 나머지 PBS를 제거합니다. 그런 다음 마운팅 중앙분리대와 커버슬립을 추가합니다.실온에서 1시간 동안 건조시키세요. 조명으로부터 보호된 4도에 슬라이드를 저장합니다. 공초점 현미경에서 슬라이드를 아래로 향하게 놓습니다.망막 혈관의 우수한 신경총에 초점을 맞추고 이미지 수집을 시작하는 영역을 선택합니다. 소프트웨어에서 일반 레이저 매개 변수를 설정합니다. 좌표를 X, Y 및 Z 축으로 설정합니다.스캔을 초기화합니다. 검색 프로세스가 완료되면 이미지를 열고 선호하는 확장으로 저장합니다. ImageJ FIJI 소프트웨어에서 메뉴 표시줄로 이동하여 파일을 클릭하고 엽니다.처리할 이미지를 선택합니다. 바이오 포맷 가져오기 옵션 창에서 OME-XML 메타데이터 표시를 선택하고 OME 메타데이터 창 OK.In 클릭하여 픽셀 크기 정보를 검색합니다. 이 데이터를 복사합니다.이미지 보정을 위해 메뉴 모음으로 이동하여 이미지 속성을 선택합니다. 정보를 복사하고 확인을 클릭합니다. 이미지에 선호하는 루트를 할당합니다. 단일 이미지에서 모든 스택을 시각화하려면 메뉴 모음으로 이동하여 이미지, 스택, Z 프로젝트를 선택합니다.표시된 투영 창에서 용기가 시각화되는 모든 스택을 선택합니다. 프로젝션 유형에서 평균 강도를 선택하고 확인을 클릭합니다. 메뉴 표시줄, 이미지, 조정, 밝기/대비로 이동합니다. 적용을 클릭하고 변경 내용을 저장합니다.밝기 및 대비를 위해 선택한 매개 변수를 복사합니다. 모든 이미지에 대해 동일해야 합니다. 메뉴 모음에서 지팡이 도구를 선택합니다.형성된 혈관이 부족한 망막 영역을 선택합니다. 키보드에서 T를 눌러 ROI 관리자의 선택 영역을 기록합니다. ROI 관리자에서 측정값을 클릭하여 변색 영역 정보를 얻습니다.망막의 총 면적을 측정하기 위해 이러한 단계를 반복합니다. 메뉴 모음에서 지팡이 도구를 선택합니다. 이미지를 확대하여 네오카를 더 잘 시각화합니다.지팡이 도구를 사용하여 네오카를 하나씩 선택합니다. 키보드의 T 문자를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다. ROI 관리자에서 측정값을 클릭하여 영역 데이터를 가져옵니다.메뉴 표시줄에서 직선 도구를 선택합니다. 이미지를 확대하여 용기 벽을 더 잘 시각화합니다. 첫 번째 분기 전에 주 선박에 세 개의 횡단 선을 수행합니다.키보드에서 T를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다. ROI 관리자에서 측정값을 클릭하여 거리 데이터를 가져옵니다. 메뉴 표시줄에서 마우스의 오른쪽 버튼이 있는 직선 도구 아이콘을 클릭하고 분할된 선을 선택합니다.혈관 모양에 따라 첫 번째 용기파급까지 시신경에서 용기 내부의 선을 그립니다. 키보드의 T 문자를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다. 메뉴 표시줄에서 직선 도구를 선택합니다.시신경에서 첫 번째 용기파급효과까지 선을 그립니다. 키보드의 T 문자를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다. ROI 관리자를 측정하여 거리 데이터를 가져옵니다.메뉴 모음의 타원형 도구를 사용하여 모든 실험 조건에 동일하게 적용된 영역을 정의합니다. 선택한 영역은 시신경 주위에 그려진 동심 원이어야 합니다. 키보드의 T 문자를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다.수동으로 선택 영역 내부의 주요 선박에서 발생하는 기본 분기 수를 계산합니다. 이미지를 8비트 모드로 변환합니다. 메뉴 표시줄의 플러그인으로 이동하여 선박 분석, 혈관 밀도를 선택합니다.선박 밀도를 측정하려는 메뉴 모음의 사각형 도구를 사용하여 영역을 정의합니다. 확인을 클릭합니다. 프로그램에 필요한 정보가 있는 새 창이 표시됩니다. 첫 번째 실험 예에서, 산소 유도 망막병증 마우스 모델이 사용되었다.인트라비탈 주사는 항 혈관 신생약물로서의 약물의 효과를 결정하기 위해 산후 12일째에 수행되었다. 차량에 주입된 마우스는 제어로 사용되었습니다. 변기 부위는 망막 혈관이 결여된 영역으로 정의됩니다.획득한 이미지로부터, 혈관이 없는 영역의 합으로 혈관영역을 정량화할 수 있다. 기계적 손상이 있는 영역도 선박의 부재를 보여줍니다. 손상된 부위를 식별하려면 Hoechst 얼룩으로 신경 층의 무결성을 분석하십시오.네오선박은 우수한 혈관 신경발의 기존 선박에서 유래하는 작은 구경 혈관입니다. 우리는 망막의 총 면적에 의해 점유된 망막의 신생 혈관 영역을 정량화하여 신혈관의 터프가 점유하는 지역을 계산했습니다. 네오선박의 모양과 크기가 가변적이기 때문에 때때로 파편과 유물과 비슷하게 보일 수 있습니다.네오선박을 구별하려면, 터프트가 성숙한 용기에서 자라는지 확인한다. 팽창의 분석을 위해, 우리는 첫 번째 분기 전에 세 높이에서 주요 선박 직경을 측정했다. 연구원은 결과 중 가변성을 감소시키기 위하여 선박 직경을 측정하기 위하여 미리 정해진 거리를 정의해야 합니다.이상적으로, 시신경에서 가장 먼 지점은 약 300 마이크로 미터이어야한다. 우리는 조건 당 적어도 6 개의 동물의 분석, 그리고 나중에 평균을 수행하는 것이 좋습니다. 고문에 관해서는, 우리는 시신경과 제 1 분기 지점 사이의 직선 거리에 대하여, 그 모양에 따라 주요 선박에 의해 이동 거리를 측정합니다.우리가 이미지에서 볼 수 있듯이, 주요 선박의 부추도에 이질성이있다. 대표적인 결과를 얻으려면 조건당 6개 미만의 마우스를 정량화해야 합니다. 최신 파라미터, 혈관 분진 및 밀도는 비증식 망막증을 나타내는 대사 증후군 모델에서 분석되었다.혈관 분지의 측정을 위해 동심원을 그려 정량화 영역을 정의한 다음, 중앙 선박에서 발생하는 기본 분기를 하나씩 계산했습니다. 획득한 이미지에서 혈관 밀도는 각 마이크로사진의 상이한 장소에 위치한 ROI 의 영역으로 나뉘어진 용기에 의해 점유된 영역으로 정량화되었다. 기계적 손상으로 영역을 정량화하지 마십시오.펑크가 있는 두 개 이상의 영역이 있는 경우 망막은 폐기해야 합니다. 요약하자면, 이 기사에서는 임상 실습에서 가장 관련성이 있는 매개 변수를 정량화하기 위해 고전적으로 확립된 재현 가능한 기술을 보여주었습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

연구

신경과학

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

마우스의 메인 후각 시스템의 섬모의 전체 마운트 라벨링

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

키메라를 구축의 HSV-중재 형질 전환 유전자의 발현은 마우스의 GPCR Heteromers의 행동 기능을 연구하는

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...