Name: quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies
Uploaded: 2022-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies at JoVE.com

Мы благодарим Карлоса Маса, Марию Пилар Креспо и Сесилию Сампедро из CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Кордова, Аргентина) за помощь в конфокальной микроскопии, Соледад Миро и Викторию Бланко за специализированный уход за животными и Лауру Гатику за гистологическую помощь. Мы также благодарим Виктора Диаса (просекретаря по институциональной коммуникации FCQ) за производство и издание видео и Пола Хобсона за его критическое чтение и языковой пересмотр рукописи.
Эта статья финансировалась за счет грантов Секретариата по вопросам науки и технологии, Национального университета Кордовы (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Фонда научных исследований и технологий (FONCyT), Проекта исследований в области науки и технологии (PICT) 2015 N° 1314 (все до M.C.S.).

С мышами C57BL/6J обращались в соответствии с руководящими принципами ArVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Экспериментальные процедуры были разработаны и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (CICUAL) факультета химических наук Национального унив...

<ol>
	<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease.">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li><li>McDougal, D. H., Gamlin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+control+of+the+eye.">Autonomic control of the eye.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).</li><li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease.">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+alterations+in+the+retinal+microvasculature,+microcirculation,+and+microstructure.">Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).</li><li>Lavia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vessel+density+in+the+superficial+and+deep+plexuses+in+diabetic+retinopathy+is+associated+with+structural+changes+in+corresponding+retinal+layers.">Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers.</a> PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).</li><li>Rosenblatt, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+in+a+rigorous+longitudinal+image-based+assessment+of+retinopathy+of+prematurity.">Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).</li><li>Edwards, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Funduscopic+examination+of+patients+with+diabetes+who+are+admitted+to+hospital.">Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital.</a> Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).</li><li>Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+associated+with+diabetic+retinopathy.">The pathology associated with diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 7-14 (2017).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=angiography+metrics+predict+progression+of+diabetic+retinopathy+and+development+of+diabetic+macular+edema:+A+prospective+study.">angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study.</a> Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+coherence+tomography+angiography+of+vascular+abnormalities+in+the+living+human+eye.">Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).</li><li>Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+vascular+changes+in+macular+telangiectasia+type+2:+comparison+between+SD-OCT+and+OCT+angiography.">Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).</li><li>Gammons, M. V., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+oxygen+induced+retinopathy+in+rodents.">Models of oxygen induced retinopathy in rodents.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-203a-3p+inhibits+retinal+angiogenesis+and+alleviates+proliferative+diabetic+retinopathy+in+oxygen-induced+retinopathy+(OIR)+rat+model+via+targeting+VEGFA+and+HIF-1&#945;.">MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1&#945;.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).</li><li>Paz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+syndrome+triggered+by+fructose+diet+impairs+neuronal+function+and+vascular+integrity+in+ApoE-KO+mouse+retinas:+Implications+of+autophagy+deficient+activation.">Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li><li>Zarb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ossified+blood+vessels+in+primary+familial+brain+calcification+elicit+a+neurotoxic+astrocyte+response.">Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response.</a> Brain. 142 (4), 885-902 (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+autophagy+modulators+on+vascular,+glial,+and+neuronal+alterations+in+the+oxygen-induced+retinopathy+mouse+model.">Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).</li><li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye.">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li><li>Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+mouse+model+of+oxygen-induced+retinopathy.">Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy.</a> Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).</li><li>Guaiquil, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+retinopathy+of+prematurity+identifies+endothelial+cell+proliferation+as+a+potential+mechanism+for+plus+disease.">A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).</li><li>Mezu-Ndubuisi, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+angiography+quantifies+oxygen-induced+retinopathy+vascular+recovery.">In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery.</a> Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).</li><li>Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+vascular+tortuosity+as+an+early+outcome+measure+in+oxygen+induced+retinopathy+(OIR).">Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR).</a> Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microvascular+density+and+morphology+in+diabetic+retinopathy+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography+angiography.">Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 362 (2016).</li><li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ocular+angiogenesis:+from+development+to+pathologies.">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+diabetic+retinopathy:+Contribution+and+limitations+of+laboratory+research.">Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research.</a> Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).</li><li>Lorenc, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1R+regulates+the+extracellular+level+of+active+MMP-2,+pathological+neovascularization,+and+functionality+in+retinas+of+OIR+mouse+model.">IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model.</a> Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).</li><li>Ma, N., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+microglia+as+passenger+leukocytes+to+the+fate+of+intraocular+neuronal+retinal+grafts.">Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).</li><li>Mazzaferri, J., Larriv&#233;e, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+machine+learning+approach+for+automated+assessment+of+retinal+vasculature+in+the+oxygen+induced+retinopathy+model.">A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).</li><li>Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+in+3D:+quantification+of+vascular+growth+and+remodeling.">The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+indirect+contact+coculture+decrease+integrity+of+inner+blood-retina+barrier+model+in+vitro+by+upgrading+MMP-2/9+activity.">Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity.</a> Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).</li><li>Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDF-deficient+mice+exhibit+an+enhanced+rate+of+retinal+vascular+expansion+and+are+more+sensitive+to+hyperoxia-mediated+vessel+obliteration.">PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).</li><li>Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+D-amino+acid+oxidase+prevents+retinal+neurovascular+pathologies+in+diabetic+rats.">Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats.</a> Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).</li></ol>

Животные модели ретинопатий являются мощными инструментами для изучения развития сосудов, ремоделирования или патологического ангиогенеза. Успех этих исследований в этой области зависит от легкого доступа к тканям, что позволяет выполнять широкий спектр методов, предоставляя данны?...

Глаза питаются двумя артерио-венозными системами: сосудисто-сосудистой, внешней сосудистой сетью, орошающей пигментированный эпителий сетчатки и фоторецепторы; и сосудисто-нервно-ретинальные сосуды, которые орошают слой ганглиозных клеток и внутренний ядерный слой сетчатки1. Сосудистая система сетчатки представляет собой организованную сеть сосудов, которые доставляют питательные вещества и кислород к клеткам сетчатки и собирают отходы для обеспечения надлежащей визуальной сигнальной трансдукции. Эта сосудистая система имеет некоторые отличительные особенности, в том числе: отсутствие автономной иннервации, регуляция сосудистого тонуса внутренними механизмами сетчатки и наличие сложного сетчаточно-гематоэнцефалического барьера2. Поэтому сосудистая система сетчатки была в центре внимания многих исследователей, которые широко изучали не только васкулогенез во время развития, но и изменения и патологический ангиогенез, которым подвергаются эти сосуды при заболеваниях3. Наиболее распространенными сосудистыми изменениями, наблюдаемыми при ретинопатиях, являются дилатация сосудов, неоваскуляризация, потеря сосудистой арборизации и деформация магистральных сосудов сетчатки, что делает их более зигзагообразными4,5,6. Одно или несколько из описанных изменений являются самыми ранними признаками, которые будут обнаружены клиницистами. Визуализация сосудов обеспечивает быстрый, неинвазивный и недорогой метод скрининга7. Обширное изучение изменений, наблюдаемых в сосудистом дереве, определит, является ли ретинопатия непролиферативной или пролиферативной, и дальнейшее лечение. Непролиферативные ретинопатии могут проявляться аберрантной морфологией сосудов, снижением плотности сосудов, бесклеточными капиллярами, гибелью перицитов, макулярным отеком и др. Кроме того, пролиферативные ретинопатии также развивают повышенную проницаемость сосудов, внеклеточное ремоделирование и образование сосудистых пучков к полости стекловидного тела, которые легко разрушаются или индуцируют отслоение сетчатки8.
После обнаружения ретинопатию можно контролировать через ее сосудистые изменения9,10. За прогрессированием патологии можно следить через структурные изменения сосудов, которые четко определяют стадии заболевания11. Количественная оценка сосудистых изменений в этих моделях позволила соотнести изменения сосудов и гибель нейронов и протестировать фармакологическую терапию для пациентов в разных фазах заболевания.
В свете вышеуказанных утверждений мы считаем, что распознавание и количественная оценка сосудистых изменений являются фундаментальными в исследованиях ретинопатий. В этой работе мы покажем, как измерять различные сосудистые параметры. Для этого мы будем использовать две модели животных. Одним из них является модель мышиной ретинопатии, индуцированная кислородом12, которая имитирует ретинопатию недоношенных и некоторые аспекты пролиферативной диабетической ретинопатии13,14. В этой модели мы будем измерять аваскулярные области, неоваскулярные области, а также дилатацию и извилистость магистральных сосудов. В нашей лаборатории была разработана модель мыши метаболического синдрома (MetS), которая индуцирует непролиферативную ретинопатию15. Здесь мы оценим плотность сосудов и ветвление.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminuim foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4503</td>
			<td>quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>9632.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope FV1200</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td>with motorized plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covers</td>
			<td>Paul Marienfeld GmnH &#38; Co.</td>
			<td>111520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>119753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L&#160; tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z316121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA5201090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker GyroMini</td>
			<td>LabNet International</td>
			<td>S0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>SANXIN</td>
			<td>PHS-3D-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Analysis Fiji software</td>
			<td>Mai Elfarnawany</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Vessel_Analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies

Ретинопатии представляют собой гетерогенную группу заболеваний, которые поражают нейросенсорную ткань глаза. Для них характерны нейродегенерация, глиоз и прогрессирующее изменение сосудистой функции и структуры. Хотя начало ретинопатий характеризуется тонкими нарушениями зрительного восприятия, модификации в сосудистом сплетении являются первыми признаками, обнаруженными клиницистами. Отсутствие или наличие неоваскуляризации определяет, классифицируется ли ретинопатия как непролиферативная (NPDR) или пролиферативная (PDR). В этом смысле несколько животных моделей пытались имитировать специфические сосудистые особенности каждой стадии, чтобы определить основные механизмы, участвующие в изменениях эндотелия, гибели нейронов и других событиях, происходящих в сетчатке. В этой статье мы предоставим полное описание процедур, необходимых для измерения сосудистых параметров сетчатки у взрослых и мышей с ранними родами на послеродовой день (P)17. Мы подробно расскажем о протоколах проведения окрашивания сосудов сетчатки изолектином GSA-IB4 в целых креплениях для последующей микроскопической визуализации. Также предусмотрены ключевые этапы обработки изображений с помощью программного обеспечения Image J Fiji, поэтому считыватели смогут измерять плотность сосудов, диаметр и извилистость сосудов, ветвление сосудов, а также аваскулярные и неоваскулярные области. Эти инструменты очень полезны для оценки и количественной оценки сосудистых изменений как при непролиферативных, так и при пролиферативных ретинопатиях.

Как описано в разделе протокола, из одного флуоресцентного окрашивания можно получить морфологию сосудов и количественно оценить несколько интересующих параметров. Поиск конкретного изменения будет зависеть от типа изучаемой ретинопатии. В этой статье аваскулярные и неоваскулярные...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies at JoVE.com

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

В данной статье описан хорошо зарекомендовавший себя и воспроизводимый анализ лектиновых пятен для всего препарата сетчатки и протоколы, необходимые для количественного измерения сосудистых параметров, часто изменяющихся при пролиферативных и непролиферативных ретинопатиях.

Количественная оценка сосудистых параметров у целых сетчаток мышей с непролиферативными и пролиферативными ретинопатиями

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

При ретинопатиях сосудистые изменения являются первым признаком, который обнаруживается клиницистами. Они следят за прогрессированием заболевания и выбирают лечение в соответствии с этими изменениями. Несколько животных моделей были разработаны для изучения различных стадий патологии.В этой работе мы покажем, как измерять различные сосудистые изменения. Для этого мы собираемся использовать две модели животных. Одним из них является модель мыши, индуцированная кислородом ретинопатия, которая воспроизводит ретинопатию недоношенных и некоторые аспекты пролиферативной диабетической ретинопатии.Здесь мы собираемся измерить аваскулярные области, неоваскулярные области, а также дилатацию и извилистость артериол. В нашей лаборатории была разработана модель метаболического синдрома мыши, которая индуцирует непролиферативную ретинопатию. В этой работе оценивали плотность сосудов и ветвление.После жертвоприношения мышей энуклеатизируйте ножницами. Зафиксируйте энуклеированные глаза свежеприготовленным параформальдегидом в течение одного часа при комнатной температуре. Под рассекающим микроскопом удаляют роговицы ножницами, разрезая вдоль лимбуса и рассекая всю сетчатку.Отбросьте передний сегмент глаза, а затем отделите сетчатку от RPE-сосудистой оболочки. Поместите сетчатку в 200 микролитровые трубки. Затем блокируют и пермеабилизируют сетчатку в 100 микролитрах TBS, содержащей 5%-ный бычий сывороточный альбумин Тритон в течение шести часов при четырех градусах с мягким перемешиванием в шейкере.Затем переверните трубку, чтобы поместить сетчатку в чашку и удалите блокирующий раствор пипеткой. Добавьте 100 микролитр раствора, содержащего изолектин. Оберните трубки алюминиевой фольгой для защиты образцов от света.Инкубировать сетчатку раствором лектина на ночь при четырех градусах с мягким перемешиванием в шейкере. Промыть сетчатку 100 микролитрами TBS-Triton в течение 20 минут с мягким перемешиванием в шейкере. Повторите этот шаг три раза.Поместите сетчатку в слайд и добавьте каплю PBS. Под рассекающим микроскопом выполните четыре одинаково удаленных разреза от краев сетчатки в сторону зрительного нерва. Чтобы развернуть лепестки сетчатки, используйте щипцы или небольшие кусочки фильтровальной бумаги.Убедитесь, что сторона фоторецептора обращена вниз. Удалите оставшуюся PBS со слайда с помощью фильтровальной бумаги. Затем добавьте медиану крепления и крышку.Дайте высохнуть в течение одного часа при комнатной температуре. Храните слайды под четырьмя градусами, защищенными от света. В конфокальном микроскопе поместите слайд в пластину лицевой стороной вниз.Сфокусируйте верхнее сплетение сосудистой системы сетчатки и выберите область для начала получения изображения. Задайте общие параметры лазера в программном обеспечении. Задайте координаты по осям X, Y и Z.Инициализируйте сканирование. После завершения процесса сканирования откройте изображение и сохраните его с предпочтительным расширением. В программном обеспечении ImageJ FIJI перейдите в строку меню и нажмите файл, открыть.Выберите изображение для обработки. В окне Параметр импорта биоформатов выберите Отображать метаданные OME-XML и нажмите кнопку OK.In окне Метаданные OME выполните поиск информации о размере пикселя. Скопируйте эти данные.Для калибровки изображения перейдите в строку меню и выберите Свойства изображения. Скопируйте информацию и нажмите кнопку ОК. Присвойте изображению предпочтительный lut. Чтобы визуализировать весь стек в одном изображении, перейдите в строку меню и выберите Изображение, Стеки, Z Project.В появившемся окне проекции выберите все стеки, где визуализируются сосуды. В поле Тип проекции выберите Средняя интенсивность и нажмите кнопку ОК. Перейдите в строку меню, Изображение, Настройка, Яркость/Контрастность. Нажмите кнопку Применить и сохраните изменения.Скопируйте параметры, выбранные для яркости и контрастности. Они должны быть одинаковыми для всех изображений. В строке меню выберите инструмент «Палочка».Выделяют область сетчатки, в которой отсутствуют сформированные сосуды. Нажмите клавишу T на клавиатуре, чтобы записать выбранные области в диспетчере ROI. Щелкните Измерить в диспетчере ROI, чтобы получить информацию об аваскулярной области.Повторите эти шаги, чтобы измерить общую площадь сетчатки. В строке меню выберите инструмент «Палочка». Увеличьте масштаб изображения, чтобы лучше визуализировать неососуды.Выделите неососуды один за другим с помощью инструмента «Палочка». Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI. Щелкните Измерить в диспетчере ROI, чтобы получить данные области.В строке меню выберите инструмент «Прямая линия». Увеличьте изображение, чтобы лучше визуализировать стену сосуда. Выполните три поперечные линии к основному судну перед первой веткой.Нажмите клавишу T на клавиатуре, чтобы записать выбранные области в диспетчере ROI. Щелкните Измерить в диспетчере ROI, чтобы получить данные о расстоянии. В строке меню щелкните правой кнопкой мыши значок инструмента «Прямая линия» и выберите «Сегментированная линия».Проведите линию внутри сосуда от зрительного нерва до первого разветвления сосуда, следуя сосудистой форме. Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI. В строке меню выберите инструмент «Прямая линия».Проведите линию от зрительного нерва до первого разветвления сосуда. Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI. Щелкните Измерить на диспетчере ROI, чтобы получить данные о расстояниях.С помощью инструмента «Овал» строки меню определите область, применяемую одинаково ко всем экспериментальным условиям. Выбранная область должна представлять собой концентрический круг, нарисованный вокруг зрительного нерва. Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI.Вручную подсчитайте количество первичных ветвей, возникающих из основных сосудов внутри зоны выбора. Преобразуйте изображение в 8-битный режим. Перейдите в плагины в строке меню, выберите Анализ сосудов, Плотность сосудов.Определите область с помощью инструмента «Квадрат» строки меню, в которой требуется измерить плотность сосудов. Нажмите кнопку ОК. Программа отобразит новое окно с необходимой информацией. В первом экспериментальном примере была использована модель мыши с кислородно-индуцированной ретинопатией.Интравитреальные инъекции проводили на 12-й послеродовой день для определения эффективности препарата как антиангиогенного. Мыши, которым вводили транспортное средство, использовались в качестве контроля. Аваскулярные области определяются как зоны, в которых отсутствуют кровеносные сосуды сетчатки.Из полученных изображений аваскулярные области могут быть количественно определены как сумма областей без сосудов, разделенных общей площадью сетчатки. Участки с механическими повреждениями также показывают отсутствие сосудов. Чтобы выявить поврежденные участки, проанализируйте целостность нейронных слоев с помощью пятна Hoechst.Неовсосуды представляют собой сосуды малого калибра, которые происходят из ранее существовавших сосудов верхнего сосудистого сплетения. Мы рассчитали площадь, занимаемую пучками неосколков, путем количественной оценки неоваскулярной области сетчатки, занятой общей площадью сетчатки. Поскольку форма и размер неосуходов варьируются, иногда они могут выглядеть похожими на обломки и артефакты.Чтобы отличить неосмешники, убедитесь, что хохолок растет из зрелого сосуда. Для анализа дилатации мы измерили диаметр основного сосуда на трех высотах перед первой ветвью. Исследователи должны определить заранее определенное расстояние для измерения диаметра сосуда, чтобы уменьшить изменчивость результатов.В идеале самая дальняя точка от зрительного нерва должна составлять около 300 микрометров. Мы предлагаем провести анализ, а позже, в среднем не менее шести животных на состояние. Что касается извилистости, мы измеряем расстояние, пройденное главным сосудом по его форме, относительно прямолинейного расстояния между зрительным нервом и первой точкой ветвления.Как мы видим на изображении, существует неоднородность в извилистости основных сосудов. Для получения репрезентативного результата необходимо количественно оценить не менее шести мышей на каждое состояние. Последние параметры, ветвление и плотность сосудов, были проанализированы в модели метаболического синдрома, демонстрирующей непролиферативную ретинопатию.Для измерения ветвления сосудов мы определили площадь количественного определения, нарисовав концентрический круг, а затем подсчитали, одну за другой, первичные ветви, возникающие из главного центрального сосуда. Из полученных изображений плотность сосудов была количественно определена как площадь, занимаемая сосудами, разделенная на площадь ROI, которая была расположена в разных местах на каждой микрофотографии. Избегайте количественной оценки областей с механическими повреждениями.Если есть более двух областей с проколами, сетчатку необходимо отбросить. Таким образом, в этой статье мы показали классические, хорошо зарекомендовавшие себя и воспроизводимые методы количественной оценки некоторых наиболее релевантных параметров с учетом в клинической практике.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Визуализация Эмбриональные нервной системы в целом монтажа Drosophila Эмбрионы

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Препарирование Мышь Око за полного горе пигментный эпителий сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Вскрытие и иммуногистохимического личинок, куколок и взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Сетчатки

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Всего Гора иммунного обонятельных рецепторов нейронов в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Антенны

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Всего монтажа Визуализация эмбриона мыши Сенсорная Axon прогнозам

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

Всего горе Маркировка ресничек в Главном обонятельной системе мышей

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Одновременный<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Функциональное тестирование двух сетчатки по<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Система электроретинограммы

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Всего горе Вскрытие и Иммунофлуоресценции взрослых мышей улитки

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV-опосредованной Transgene экспрессия химерных конструктов для изучения поведенческой Функция GPCR гетеромеров у мышей

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Простой Одношаговый Вскрытие Протокол целом монтажа подготовки взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Мозги

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...