Name: quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies
Uploaded: 2022-03-12T15:00:00
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Agradecemos a Carlos Mas, María Pilar Crespo y Cecilia Sampedro de CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) por su asistencia en microscopía confocal, a Soledad Miró y Victoria Blanco por el cuidado dedicado a los animales y a Laura Gatica por la asistencia histológica. También agradecemos a Víctor Díaz (Pro-Secretario de Comunicación Institucional de la FCQ) por la producción y edición del video y a Paul Hobson por su lectura crítica y revisión lingüística del manuscrito.
Este artículo fue financiado por subvenciones de la Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (todos a M.C.S.).

Los ratones C57BL / 6J se manejaron de acuerdo con las pautas de la Declaración ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los procedimientos experimentales fueron diseñados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUAL) de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Nacional de Córdoba (Res. HCD 1216/18).
1. Preparación de soluciones tampón y reactivos
<ol><li>Preparación de 1x solución salina...

<ol>
	<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease.">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li><li>McDougal, D. H., Gamlin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+control+of+the+eye.">Autonomic control of the eye.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).</li><li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease.">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+alterations+in+the+retinal+microvasculature,+microcirculation,+and+microstructure.">Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).</li><li>Lavia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vessel+density+in+the+superficial+and+deep+plexuses+in+diabetic+retinopathy+is+associated+with+structural+changes+in+corresponding+retinal+layers.">Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers.</a> PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).</li><li>Rosenblatt, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+in+a+rigorous+longitudinal+image-based+assessment+of+retinopathy+of+prematurity.">Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).</li><li>Edwards, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Funduscopic+examination+of+patients+with+diabetes+who+are+admitted+to+hospital.">Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital.</a> Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).</li><li>Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+associated+with+diabetic+retinopathy.">The pathology associated with diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 7-14 (2017).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=angiography+metrics+predict+progression+of+diabetic+retinopathy+and+development+of+diabetic+macular+edema:+A+prospective+study.">angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study.</a> Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+coherence+tomography+angiography+of+vascular+abnormalities+in+the+living+human+eye.">Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).</li><li>Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+vascular+changes+in+macular+telangiectasia+type+2:+comparison+between+SD-OCT+and+OCT+angiography.">Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).</li><li>Gammons, M. V., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+oxygen+induced+retinopathy+in+rodents.">Models of oxygen induced retinopathy in rodents.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-203a-3p+inhibits+retinal+angiogenesis+and+alleviates+proliferative+diabetic+retinopathy+in+oxygen-induced+retinopathy+(OIR)+rat+model+via+targeting+VEGFA+and+HIF-1&#945;.">MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1&#945;.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).</li><li>Paz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+syndrome+triggered+by+fructose+diet+impairs+neuronal+function+and+vascular+integrity+in+ApoE-KO+mouse+retinas:+Implications+of+autophagy+deficient+activation.">Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li><li>Zarb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ossified+blood+vessels+in+primary+familial+brain+calcification+elicit+a+neurotoxic+astrocyte+response.">Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response.</a> Brain. 142 (4), 885-902 (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+autophagy+modulators+on+vascular,+glial,+and+neuronal+alterations+in+the+oxygen-induced+retinopathy+mouse+model.">Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).</li><li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye.">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li><li>Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+mouse+model+of+oxygen-induced+retinopathy.">Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy.</a> Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).</li><li>Guaiquil, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+retinopathy+of+prematurity+identifies+endothelial+cell+proliferation+as+a+potential+mechanism+for+plus+disease.">A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).</li><li>Mezu-Ndubuisi, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+angiography+quantifies+oxygen-induced+retinopathy+vascular+recovery.">In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery.</a> Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).</li><li>Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+vascular+tortuosity+as+an+early+outcome+measure+in+oxygen+induced+retinopathy+(OIR).">Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR).</a> Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microvascular+density+and+morphology+in+diabetic+retinopathy+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography+angiography.">Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 362 (2016).</li><li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ocular+angiogenesis:+from+development+to+pathologies.">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+diabetic+retinopathy:+Contribution+and+limitations+of+laboratory+research.">Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research.</a> Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).</li><li>Lorenc, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1R+regulates+the+extracellular+level+of+active+MMP-2,+pathological+neovascularization,+and+functionality+in+retinas+of+OIR+mouse+model.">IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model.</a> Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).</li><li>Ma, N., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+microglia+as+passenger+leukocytes+to+the+fate+of+intraocular+neuronal+retinal+grafts.">Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).</li><li>Mazzaferri, J., Larriv&#233;e, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+machine+learning+approach+for+automated+assessment+of+retinal+vasculature+in+the+oxygen+induced+retinopathy+model.">A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).</li><li>Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+in+3D:+quantification+of+vascular+growth+and+remodeling.">The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+indirect+contact+coculture+decrease+integrity+of+inner+blood-retina+barrier+model+in+vitro+by+upgrading+MMP-2/9+activity.">Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity.</a> Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).</li><li>Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDF-deficient+mice+exhibit+an+enhanced+rate+of+retinal+vascular+expansion+and+are+more+sensitive+to+hyperoxia-mediated+vessel+obliteration.">PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).</li><li>Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+D-amino+acid+oxidase+prevents+retinal+neurovascular+pathologies+in+diabetic+rats.">Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats.</a> Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).</li></ol>

Los modelos animales de retinopatías son herramientas poderosas para estudiar el desarrollo vascular, la remodelación o la angiogénesis patológica. El éxito de estos estudios en el campo se basa en el fácil acceso al tejido que permite realizar una amplia variedad de técnicas, aportando datos de ratones in vivo y postmortem26,27. Además, se ha encontrado una gran correlación entre los estudios in vivo y los análisis clínicos,...

Los ojos se nutren de dos sistemas arterio-venosos: la vasculatura coroidea, una red vascular externa que riega el epitelio pigmentado de la retina y los fotorreceptores; y la vasculatura neurorretiniana que irriga la capa de células ganglionares y la capa nuclear interna de la retina1. La vasculatura retiniana es una red organizada de vasos que suministran nutrientes y oxígeno a las células de la retina y cosechan productos de desecho para garantizar la transducción adecuada de la señalización visual. Esta vasculatura tiene algunas características distintivas, entre ellas: la falta de inervación autónoma, la regulación del tono vascular por mecanismos retinianos intrínsecos y la posesión de una compleja barrera retiniano-sanguínea2. Por ello, la vasculatura retiniana ha sido el foco de muchos investigadores que han estudiado ampliamente no solo la vasculogénesis durante el desarrollo, sino también las alteraciones y la angiogénesis patológica que sufren estos vasos en las enfermedades3. Los cambios vasculares más frecuentes observados en las retinopatías son la dilatación de los vasos, la neovascularización, la pérdida de arborización vascular y la deformación de los vasos principales de la retina, lo que los hace más ziggaggy4,5,6. Una o más de las alteraciones descritas son los primeros signos detectados por los médicos. La visualización vascular proporciona un método de detección rápido, no invasivo y económico7. El estudio exhaustivo de las alteraciones observadas en el árbol vascular determinará si la retinopatía es no proliferativa o proliferativa y el tratamiento posterior. Las retinopatías no proliferativas pueden manifestarse con morfología vascular aberrante, disminución de la densidad vascular, capilares acelulares, muerte de pericitos, edema macular, entre otros. Además, las retinopatías proliferativas también desarrollan una mayor permeabilidad vascular, remodelación extracelular y la formación de mechones vasculares hacia la cavidad vítrea que se descomponen o inducen fácilmente el desprendimiento de retina8.
Una vez detectada, la retinopatía puede ser monitorizada a través de sus cambios vasculares9,10. La progresión de la patología se puede seguir a través de los cambios estructurales de los vasos, que definen claramente las etapas de la enfermedad11. La cuantificación de las alteraciones vasculares en estos modelos permitió correlacionar los cambios de vasos y la muerte neuronal y probar terapias farmacológicas para pacientes en diferentes fases de la enfermedad.
A la luz de las afirmaciones anteriores, consideramos que el reconocimiento y cuantificación de las alteraciones vasculares son fundamentales en los estudios de retinopatías. En este trabajo, mostraremos cómo medir diferentes parámetros vasculares. Para ello, emplearemos dos modelos animales. Uno de ellos es el modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno12, que imita la retinopatía del prematuro y algunos aspectos de la retinopatía diabética proliferativa13,14. En este modelo, mediremos las áreas avasculares, las áreas neovasculares y la dilatación y tortuosidad de los vasos principales. En nuestro laboratorio se ha desarrollado un modelo de ratón con Síndrome Metabólico (SM), que induce una retinopatía no proliferativa15. Aquí, evaluaremos la densidad vascular y la ramificación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminuim foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4503</td>
			<td>quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>9632.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope FV1200</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td>with motorized plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covers</td>
			<td>Paul Marienfeld GmnH &#38; Co.</td>
			<td>111520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>119753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L&#160; tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z316121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA5201090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker GyroMini</td>
			<td>LabNet International</td>
			<td>S0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>SANXIN</td>
			<td>PHS-3D-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Analysis Fiji software</td>
			<td>Mai Elfarnawany</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Vessel_Analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies

Las retinopatías son un grupo heterogéneo de enfermedades que afectan al tejido neurosensorial del ojo. Se caracterizan por neurodegeneración, gliosis y un cambio progresivo en la función y estructura vascular. Aunque el inicio de las retinopatías se caracteriza por alteraciones sutiles en la percepción visual, las modificaciones en el plexo vascular son los primeros signos detectados por los médicos. La ausencia o presencia de neovascularización determina si la retinopatía se clasifica como no proliferativa (NPDR) o proliferativa (PDR). En este sentido, varios modelos animales intentaron imitar características vasculares específicas de cada etapa para determinar los mecanismos subyacentes involucrados en las alteraciones del endotelio, la muerte neuronal y otros eventos que tienen lugar en la retina. En este artículo, proporcionaremos una descripción completa de los procedimientos necesarios para la medición de los parámetros vasculares de la retina en adultos y ratones de nacimiento prematuro en el día postnatal (P)17. Detallaremos los protocolos para llevar a cabo la tinción vascular retiniana con Isolectina GSA-IB4 en monturas enteras para su posterior visualización microscópica. También se proporcionan pasos clave para el procesamiento de imágenes con el software Image J Fiji, por lo tanto, los lectores podrán medir la densidad de los vasos, el diámetro y la tortuosidad, la ramificación vascular, así como las áreas avasculares y neovasculares. Estas herramientas son de gran ayuda para evaluar y cuantificar las alteraciones vasculares tanto en las retinopatías no proliferativas como en las proliferativas.

Como se describe en el apartado de protocolo, a partir de un único ensayo de tinción fluorescente se puede obtener la morfología vascular y evaluar cuantitativamente varios parámetros de interés. La búsqueda de una alteración específica dependerá del tipo de retinopatía estudiada. En este artículo, las áreas avasculares y neovasculares, la tortuosidad y la dilatación se evaluaron en un modelo de ratón de retinopatía proliferativa, mientras que la ramificación vascular y la densidad se analizaron en un mod...

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Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Este artículo describe un ensayo de tinción de lectina bien establecido y reproducible para las preparaciones retinianas de montaje completo y los protocolos necesarios para la medición cuantitativa de los parámetros vasculares frecuentemente alterados en las retinopatías proliferativas y no proliferativas.

Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

En las retinopatías, las alteraciones vasculares son el primer signo que detectan los médicos. Siguen la progresión de la enfermedad y eligen un tratamiento de acuerdo con estos cambios. Se han desarrollado varios modelos animales con el fin de estudiar diferentes etapas de la patología.En este trabajo, vamos a mostrar cómo medir diferentes alteraciones vasculares. Para eso, vamos a emplear dos modelos animales. Uno de ellos es el modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno, que reproduce la retinopatía del prematuro y algunos aspectos de la retinopatía diabética proliferativa.Aquí, vamos a medir las áreas avasculares, las áreas neovasculares y la dilatación y tortuosidad de las arteriolas. En nuestro laboratorio se desarrolló un modelo de ratón con síndrome metabólico, que induce una retinopatía no proliferativa. La densidad vascular y la ramificación fueron evaluadas en este trabajo.Al sacrificar ratones, enucleatizar con tijeras. Fije los ojos enucleados con paraformaldehído recién preparado durante una hora a temperatura ambiente. Bajo el microscopio de disección, retire las córneas con tijeras cortando a lo largo del limbo y diseccione todas las retinas.Deseche el segmento anterior del ojo y luego separe la retina de la COROIDES RPE. Coloque las retinas en tubos de 200 microlitros. Luego bloquee y permeabilice las retinas en 100 microlitros de TBS que contienen 5% de albúmina sérica bovina Tritón durante seis horas a cuatro grados con agitación suave en el agitador.Luego invierta el tubo para colocar la retina en la copa y retire la solución bloqueadora con pipeta. Añadir una solución de 100 microlitros que contenga isolectina. Envuelva los tubos con papel de aluminio para proteger las muestras de la luz.Incubar las retinas con solución de lectina durante la noche a cuatro grados con agitación suave en agitador. Lave las retinas con 100 microlitros de TBS-Triton durante 20 minutos con agitación suave en el agitador. Repita este paso tres veces.Coloque la retina en un portaobjetos y agregue una gota de PBS. Bajo el microscopio de disección, realice cuatro cortes igualmente distantes desde los bordes de la retina hacia el nervio óptico. Para desplegar los pétalos de la retina, use fórceps o pequeños trozos de papel de filtro.Asegúrese de que el lado del fotorreceptor esté hacia abajo. Retire el PBS restante de la diapositiva con papel de filtro. A continuación, agregue una mediana de montaje y un deslizamiento de cubierta.Deja secar durante una hora a temperatura ambiente. Guarde los toboganes a cuatro grados protegidos de la luz. En el microscopio confocal, coloque el portaobjetos en la placa boca abajo.Enfoque el plexo superior de la vasculatura retiniana y seleccione un área para iniciar la adquisición de la imagen. Establezca parámetros generales del láser en el software. Establezca las coordenadas en los ejes X, Y y Z.Inicialice el escaneo. Una vez que finalice el proceso de escaneo, abra la imagen y guárdela con una extensión preferida. En el software ImageJ FIJI, vaya a la barra de menús y haga clic en Archivo, Abrir.Seleccione la imagen que desea procesar. En la ventana Opción de importación de bioformatos, seleccione Mostrar metadatos OME-XML y haga clic en OK.In la ventana Metadatos OME, busque información sobre el tamaño de píxel. Copie estos datos.Para la calibración de la imagen, vaya a la barra de menús y seleccione Propiedades de la imagen. Copie la información y haga clic en Aceptar. Asigne una lut preferida a la imagen. Para visualizar toda la pila en una sola imagen, vaya a la barra de menús y seleccione Imagen, Pilas, Proyecto Z.En la ventana de proyección que se muestra, seleccione todas las pilas donde se visualizan los recipientes. En Tipo de proyección, elija Intensidad media y haga clic en Aceptar. Vaya a la barra de menús, Imagen, Ajustar, Brillo / Contraste. Haga clic en Aplicar y guarde los cambios.Copie los parámetros seleccionados para el brillo y el contraste. Estos deben ser idénticos para todas las imágenes. En la barra de menús, elija la herramienta Varita.Seleccione el área de la retina que carece de vasos formados. Presione T en el teclado para grabar las áreas seleccionadas en el Administrador de ROI. Haga clic en Medir en el Administrador de ROI para obtener la información del área avascular.Repita estos pasos para medir el área total de la retina. En la barra de menús, elija la herramienta Varita. Amplíe la imagen para visualizar mejor los neovasos.Seleccione los neovasos uno por uno con la herramienta Varita. Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI. Haga clic en Medir en el Administrador de ROI para obtener los datos del área.En la barra de menús, seleccione la herramienta Línea recta. Amplíe la imagen para visualizar mejor la pared del recipiente. Realizar tres líneas transversales al buque principal antes del primer ramal.Presione T en el teclado para grabar las áreas seleccionadas en el Administrador de ROI. Haga clic en Medir en el Administrador de ROI para obtener los datos de distancia. En la barra de menús, haga clic en el icono de la herramienta Línea recta con el botón derecho del ratón y seleccione Línea segmentada.Dibuje una línea dentro del vaso desde el nervio óptico hasta la primera ramificación del vaso, siguiendo la forma vascular. Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI. En la barra de menús, seleccione la herramienta Línea recta.Dibuje una línea desde el nervio óptico hasta la ramificación del primer vaso. Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI. Haga clic en Medir en el Gestor de ROI para obtener los datos de distancias.Con la herramienta Oval de la barra de menús, defina un área aplicada por igual a todas las condiciones experimentales. El área seleccionada debe ser un círculo concéntrico dibujado alrededor del nervio óptico. Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI.Manualmente, cuente el número de ramas primarias que surgen de los vasos principales dentro del área de selección. Transforme la imagen en modo de 8 bits. Vaya a Plugins en la barra de menú, seleccione Análisis de vasos, Densidad vascular.Defina un área con la herramienta Cuadrado de la barra de menús donde desea medir la densidad del recipiente. Haga clic en Aceptar. El programa mostrará una nueva ventana con la información requerida. En el primer ejemplo experimental, se empleó el modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno.Las inyecciones intravítreas se realizaron en el día 12 postnatal para determinar la efectividad de un fármaco como antiangiogénico. Los ratones inyectados con vehículo se emplearon como control. Las áreas avasculares se definen como las zonas que carecen de vasos sanguíneos retinianos.A partir de las imágenes adquiridas, las áreas avasculares se pueden cuantificar como la suma de las regiones sin vasos dividido el área total de la retina. Las áreas con daños mecánicos también muestran ausencia de embarcaciones. Para identificar áreas dañadas, analice la integridad de las capas neuronales con tinción de Hoechst.Los neovasos son vasos de pequeño calibre que se originan en vasos preexistentes del plexo vascular superior. Calculamos el área ocupada por los mechones de neovasos cuantificando el área neovascular de la retina ocupada por el área total de la retina. Como la forma y el tamaño de los neovasos son variables, ocasionalmente, pueden verse similares a los escombros y artefactos.Para distinguir los neovasos, verifique que el mechón crezca a partir de un recipiente maduro. Para el análisis de la dilatación, medimos el diámetro del vaso principal a tres alturas antes de la primera rama. Los investigadores deben definir una distancia predeterminada para medir el diámetro del vaso con el fin de reducir la variabilidad entre los resultados.Idealmente, el punto más alejado del nervio óptico debe ser de alrededor de 300 micrómetros. Sugerimos realizar el análisis, y más tarde, el promedio de al menos seis animales por condición. En cuanto a la tortuosidad, medimos la distancia recorrida por el vaso principal siguiendo su forma, respecto a la distancia en línea recta entre el nervio óptico y el primer punto de ramificación.Como podemos ver en la imagen, existe heterogeneidad en la sinuosidad de los vasos principales. Para obtener un resultado representativo, se deben cuantificar no menos de seis ratones por condición. Los últimos parámetros, ramificación vascular y densidad, se analizaron en un modelo de síndrome metabólico que presenta retinopatía no proliferativa.Para la medición de la ramificación vascular, definimos el área de cuantificación dibujando un círculo concéntrico, y luego contamos, una por una, las ramas primarias que surgen de un vaso central principal. A partir de las imágenes adquiridas, se cuantificó la densidad vascular como el área ocupada por los vasos divididos por el área del ROI, que se posicionó en diferentes lugares en cada microfotografía. Evite cuantificar áreas con daños mecánicos.Si hay más de dos áreas con punciones, se debe descartar la retina. En resumen, en este artículo hemos mostrado técnicas clásicas, bien establecidas y reproducibles para cuantificar algunos de los parámetros más relevantes teniendo en cuenta en la práctica clínica.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

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Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Investigación

Neurociencias

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La disección e inmunohistoquímica de larva, pupa y adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

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Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

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Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

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HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV mediada por la expresión transgénica de constructos quiméricos para estudiar la función del comportamiento de los GPCR heterómeros en ratones

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...