Name: quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies
Uploaded: 2022-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies at JoVE.com

Vi tackar Carlos Mas, María Pilar Crespo och Cecilia Sampedro från CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) för hjälp med konfokal mikroskopi, till Soledad Miró och Victoria Blanco för särskild djurvård och Laura Gatica för histologisk hjälp. Vi tackar också Victor Diaz (pro-sekreterare för institutionell kommunikation i FCQ) för videoproduktion och utgåva och Paul Hobson för hans kritiska läsning och språkrevision av manuskriptet.
Denna artikel finansierades genom bidrag från Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alla till M.C.S.).

C57BL/6J möss hanterades enligt riktlinjer i ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Experimentella förfaranden utformades och godkändes av institutional animal care and use committee (CICUAL) vid fakulteten för kemiska vetenskaper, National University of Córdoba (Res. HCD 1216/18).
1. Beredning av buffertlösningar och reagenser
<ol><li>Beredning av 1x fosfatbuffertsaltlösning (PBS): Tillsätt 8 g natriumklorid (NaCl), 0,2 g kaliumklor...

<ol>
	<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease.">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li><li>McDougal, D. H., Gamlin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+control+of+the+eye.">Autonomic control of the eye.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).</li><li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease.">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+alterations+in+the+retinal+microvasculature,+microcirculation,+and+microstructure.">Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).</li><li>Lavia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vessel+density+in+the+superficial+and+deep+plexuses+in+diabetic+retinopathy+is+associated+with+structural+changes+in+corresponding+retinal+layers.">Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers.</a> PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).</li><li>Rosenblatt, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+in+a+rigorous+longitudinal+image-based+assessment+of+retinopathy+of+prematurity.">Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).</li><li>Edwards, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Funduscopic+examination+of+patients+with+diabetes+who+are+admitted+to+hospital.">Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital.</a> Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).</li><li>Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+associated+with+diabetic+retinopathy.">The pathology associated with diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 7-14 (2017).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=angiography+metrics+predict+progression+of+diabetic+retinopathy+and+development+of+diabetic+macular+edema:+A+prospective+study.">angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study.</a> Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+coherence+tomography+angiography+of+vascular+abnormalities+in+the+living+human+eye.">Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).</li><li>Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+vascular+changes+in+macular+telangiectasia+type+2:+comparison+between+SD-OCT+and+OCT+angiography.">Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).</li><li>Gammons, M. V., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+oxygen+induced+retinopathy+in+rodents.">Models of oxygen induced retinopathy in rodents.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-203a-3p+inhibits+retinal+angiogenesis+and+alleviates+proliferative+diabetic+retinopathy+in+oxygen-induced+retinopathy+(OIR)+rat+model+via+targeting+VEGFA+and+HIF-1&#945;.">MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1&#945;.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).</li><li>Paz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+syndrome+triggered+by+fructose+diet+impairs+neuronal+function+and+vascular+integrity+in+ApoE-KO+mouse+retinas:+Implications+of+autophagy+deficient+activation.">Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li><li>Zarb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ossified+blood+vessels+in+primary+familial+brain+calcification+elicit+a+neurotoxic+astrocyte+response.">Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response.</a> Brain. 142 (4), 885-902 (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+autophagy+modulators+on+vascular,+glial,+and+neuronal+alterations+in+the+oxygen-induced+retinopathy+mouse+model.">Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).</li><li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye.">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li><li>Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+mouse+model+of+oxygen-induced+retinopathy.">Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy.</a> Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).</li><li>Guaiquil, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+retinopathy+of+prematurity+identifies+endothelial+cell+proliferation+as+a+potential+mechanism+for+plus+disease.">A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).</li><li>Mezu-Ndubuisi, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+angiography+quantifies+oxygen-induced+retinopathy+vascular+recovery.">In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery.</a> Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).</li><li>Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+vascular+tortuosity+as+an+early+outcome+measure+in+oxygen+induced+retinopathy+(OIR).">Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR).</a> Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microvascular+density+and+morphology+in+diabetic+retinopathy+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography+angiography.">Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 362 (2016).</li><li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ocular+angiogenesis:+from+development+to+pathologies.">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+diabetic+retinopathy:+Contribution+and+limitations+of+laboratory+research.">Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research.</a> Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).</li><li>Lorenc, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1R+regulates+the+extracellular+level+of+active+MMP-2,+pathological+neovascularization,+and+functionality+in+retinas+of+OIR+mouse+model.">IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model.</a> Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).</li><li>Ma, N., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+microglia+as+passenger+leukocytes+to+the+fate+of+intraocular+neuronal+retinal+grafts.">Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).</li><li>Mazzaferri, J., Larriv&#233;e, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+machine+learning+approach+for+automated+assessment+of+retinal+vasculature+in+the+oxygen+induced+retinopathy+model.">A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).</li><li>Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+in+3D:+quantification+of+vascular+growth+and+remodeling.">The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+indirect+contact+coculture+decrease+integrity+of+inner+blood-retina+barrier+model+in+vitro+by+upgrading+MMP-2/9+activity.">Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity.</a> Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).</li><li>Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDF-deficient+mice+exhibit+an+enhanced+rate+of+retinal+vascular+expansion+and+are+more+sensitive+to+hyperoxia-mediated+vessel+obliteration.">PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).</li><li>Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+D-amino+acid+oxidase+prevents+retinal+neurovascular+pathologies+in+diabetic+rats.">Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats.</a> Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).</li></ol>

Djurmodeller av retinopatier är kraftfulla verktyg för att studera kärlutveckling, ombyggnad eller patologisk angiogenes. Framgången för dessa studier inom området beror på enkel tillgång till vävnaden som gör det möjligt att utföra en mängd olika tekniker, vilket ger data från in vivo- och postmortemmöss26,27. Dessutom har stor korrelation hittats mellan in vivo-studier och klinisk analys, vilket ger solid spårbarhet oc...

Ögonen närs av två arterio-venösa system: choroidal vaskulatur, ett externt vaskulär nätverk som bevattnar retinal pigmenterat epitel och fotoreceptorer; och den neuro-retinala vaskulaturen som bevattnar ganglioncellernas lager och näthinnans inre kärnskikt1. Näthinnevaskulaturen är ett organiserat nätverk av kärl som levererar näringsämnen och syre till näthinnecellerna och skördar avfallsprodukter för att säkerställa korrekt visuell signaltransduktion. Denna vaskulatur har några distinkta funktioner, inklusive: bristen på autonom innervation, reglering av vaskulär ton av inneboende retinal mekanismer och innehav av en komplex retinal-blod barriär2. Därför har retinal vaskulatur varit i fokus för många forskare som har studerat inte bara vasculogenes under utvecklingen, men också de förändringar och patologiska angiogenes som dessa fartyg genomgår i sjukdomar3. De vanligaste vaskulär förändringarna som observerats i retinopatier är kärl dilatation, neovaskularisering, förlust av vaskulär arborization och deformation av näthinnan huvudkärl, vilket gör dem mer ziggaggy4,5,6. En eller flera av de beskrivna ändringarna är de tidigaste tecknen som ska upptäckas av kliniker. Vaskulär visualisering ger en snabb, icke-invasiv och billig screeningmetod7. Den omfattande studien av de förändringar som observerats i kärlträdet kommer att avgöra om retinopatin är icke-proliferativ eller proliferativ och den fortsatta behandlingen. De icke-proliferative retinopathies kan manifestera sig med avvikande vaskulär morfologi, minskad vaskulär densitet, acellulära kapillärer, pericytes död, makulade ödem, bland andra. Dessutom utvecklar proliferative retinopathies också ökad vaskulär permeabilitet, extracellulära ombyggnad och bildandet av vaskulär tufts mot glaskropp håligheten som lätt nedbrytning eller inducera retinal detachement8.
När upptäckts kan retinopatin övervakas genom dess kärlförändringar9,10. Patologins progression kan följas genom kärlens strukturella förändringar, som tydligt definierar stadier av sjukdomen11. Kvantifiering av vaskulär förändringar i dessa modeller tillåtet att korrelera fartygsförändringar och neuronal död och att testa farmakologiska terapier för patienter i olika faser av sjukdomen.
Mot bakgrund av ovanstående uttalanden anser vi att erkännande och kvantifiering av vaskulär förändringar är grundläggande i retinopathies studier. I detta arbete kommer vi att visa hur man mäter olika kärlparametrar. För att göra det kommer vi att använda två djurmodeller. En av dem är den syreinducerade retinopatimusen model12, som efterliknar retinopati av råttor och vissa aspekter av proliferativ diabetesretinopati13,14. I denna modell kommer vi att mäta avascular områden, neovaskulära områden och dilatation och tortuositet av huvudfartyg. I vårt laboratorium har en metabolisk syndrom (MetS) musmodell utvecklats, vilket inducerar en icke-proliferative retinopathy15. Här kommer vi att utvärdera kärldensitet och förgrening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminuim foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4503</td>
			<td>quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>9632.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope FV1200</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td>with motorized plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covers</td>
			<td>Paul Marienfeld GmnH &#38; Co.</td>
			<td>111520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>119753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L&#160; tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z316121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA5201090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker GyroMini</td>
			<td>LabNet International</td>
			<td>S0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>SANXIN</td>
			<td>PHS-3D-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Analysis Fiji software</td>
			<td>Mai Elfarnawany</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Vessel_Analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies

Retinopatier är en heterogen grupp av sjukdomar som påverkar ögats neurosensoriska vävnad. De kännetecknas av neurodegeneration, gliosis och en progressiv förändring i vaskulär funktion och struktur. Även om uppkomsten av retinopathies kännetecknas av subtila störningar i visuell uppfattning, är ändringarna i vaskulär plexus de första tecknen som upptäcks av kliniker. Frånvaron eller förekomsten av neovaskularisering avgör om retinopati klassificeras som antingen icke-proliferativ (NPDR) eller proliferativ (PDR). I den meningen försökte flera djurmodeller efterlikna specifika kärlegenskaper i varje steg för att bestämma de underliggande mekanismerna som är involverade i endotelförändringar, neuronal död och andra händelser som äger rum i näthinnan. I den här artikeln kommer vi att ge en fullständig beskrivning av de förfaranden som krävs för mätning av retinala kärlparametrar hos vuxna och tidiga födelsemöss vid postnatal dag (P)17. Vi kommer att beskriva protokollen för att utföra retinal vaskulär färgning med Isolectin GSA-IB4 i hela fästen för senare mikroskopisk visualisering. Viktiga steg för bildbehandling med Image J Fiji programvara tillhandahålls också, därför kommer läsarna att kunna mäta kärltäthet, diameter och tortuositet, vaskulär förgrening, liksom avaskådeliga och neovaskulära områden. Dessa verktyg är till stor hjälp för att utvärdera och kvantifiera vaskulär förändringar i både icke-proliferative och proliferative retinopathies.

Som beskrivs i protokollavsnittet, från en enda fluorescerande färgningsanalys kan du få kärlmorfologin och utvärdera flera parametrar av intresse kvantitativt. Sökningen av en specifik förändring beror på vilken typ av retinopati som studeras. I den här artikeln utvärderades avascular och neovascular områden, tortuositet och dilatation i en mus modell av proliferative retinopathy, medan vaskulär förgrening och densitet analyserades i en MetS mus modell, som inducerar en icke-proliferative retinopathy.
...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies at JoVE.com

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Denna artikel beskriver en väletablerad och reproducerbar lectin fläck analys för hela mount retinal preparat och protokoll som krävs för kvantitativ mätning av vaskulär parametrar ofta ändras i proliferative och icke-proliferative retinopathies.

Kvantifiering av kärlparametrar i hela mount näthinnor hos möss med icke-proliferativa och proliferativa retinopatier

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

I retinopatier är kärlförändringar det första tecknet som upptäcks av kliniker. De följer sjukdomsförloppet, och de väljer en behandling enligt dessa förändringar. Flera djurmodeller har utvecklats för att studera olika stadier av patologin.I detta arbete kommer vi att visa hur man mäter olika kärlförändringar. För det kommer vi att använda två djurmodeller. En av dessa är den syreinducerade Retinopathy musmodellen, som reproducerar retinopatin av råtthet och vissa aspekter av proliferative diabetiker retinopati.Här ska vi mäta avasulära områden, neovaskulära områden och dilatation och tortuositet av arterioles. I vårt laboratorium utvecklades en metabolisk syndrom mus modell, som inducerar en ickeproliferative retinopathy. Vaskulär densitet och förgrening utvärderades i detta arbete.På möss offer, enucleatize med sax. Fixera enucleated ögon med nyberedd paraformaldehyd i en timme vid rumstemperatur. Under det dissekerande mikroskopet tar du bort hornhinnorna med sax genom att skära längs limbus och dissekera hela näthinnan.Kassera det främre segmentet av ögat och separera sedan näthinnan från RPE-choroid. Placera näthinnan i 200 mikroliterrör. Blockera och permeabilisera näthinnan i 100 mikroliter TBS innehållande 5% bovin serumalbumin Triton under sex timmar vid fyra grader med mild agitation i shaker.Vänd sedan röret för att placera näthinnan i koppen och ta bort blockeringslösningen med pipetten. Tillsätt 100 mikroliterlösning som innehåller isolektin. Linda rören med aluminiumfolie för att skydda prover från ljus.Inkubera näthinnan med lektinlösning över natten vid fyra grader med mild agitation i shaker. Tvätta näthinnan med 100 mikroliter TBS-Triton i 20 minuter med mild omrörning i shaker. Upprepa det här steget tre gånger.Placera näthinnan i en bild och lägg till en droppe PBS. Under dissekerande mikroskop, utför fyra lika avlägsna snitt från näthinnans kanter mot synnerven. För att fälla ut näthinnans kronblad, använd tång eller små bitar filterpapper.Se till att fotoreceptorsidan är vänd nedåt. Ta bort den återstående PBS från bilden med filterpapper. Lägg sedan till en monterings median och täckslip.Låt det torka i en timme vid rumstemperatur. Förvara bilderna i fyra grader skyddade mot ljus. Placera bilden i plattan med framsidan nedåt vid det konfokala mikroskopet.Fokusera retinal vaskulaturens överlägsna plexus och välj ett område för att starta bildförvärvet. Ställ in allmänna laserparametrar i programvaran. Ställ in koordinaterna i X-, Y- och Z-axlar.Initiera skanningen. När skanningsprocessen är klar öppnar du bilden och sparar den med ett önskat tillägg. I ImageJ FIJI-programvaran går du till menyraden och klickar på Arkiv, Öppna.Välj den bild som ska bearbetas. I fönstret Importera bioformat väljer du Visa OME-XML-metadata och klickar på OK.In fönstret OME-metadata och söker efter pixelstorleksinformation. Kopiera dessa data.Om du vill ha bildkalibrering går du till menyraden och väljer Bildegenskaper. Kopiera informationen och klicka på OK. Tilldela en önskad lut till bilden. Om du vill visualisera alla staplar i en enda bild går du till menyraden och väljer Bild, Staplar, Z-projekt.I projektionsfönstret som visas markerar du alla staplar där kärl visualiseras. Välj Medelintensitet i Projektionstyp och klicka på OK. Gå till menyraden, Bild, Justera, Ljusstyrka/Kontrast. Klicka på Verkställ och spara ändringar.Kopiera de parametrar som valts för ljusstyrka och kontrast. Dessa måste vara identiska för alla bilder. Välj trollstavsverktyget i menyraden.Välj näthinnan som saknar bildade kärl. Tryck på T på tangentbordet för att spela in de valda områdena i ROI Manager. Klicka på Mät i ROI-hanteraren för att hämta information om det avascular området.Upprepa dessa steg för att mäta näthinnans totala yta. Välj trollstavsverktyget i menyraden. Zooma in bilden för att bättre visualisera neovessels.Välj neovessels en efter en med trollstavsverktyget. Tryck på T-bokstaven på tangentbordet för att spela in det markerade området i ROI Manager. Klicka på Mät i ROI-hanteraren för att hämta områdesdata.Välj verktyget Rak linje i menyraden. Zooma in bilden för att bättre visualisera kärlväggen. Utför tre tvärgående linjer till huvudkärlet före den första grenen.Tryck på T på tangentbordet för att spela in de markerade områdena i ROI Manager. Klicka på Mät i ROI-hanteraren för att hämta avståndsdata. Klicka på ikonen För verktyget Rak linje med musens högra knapp i menyraden och välj Segmenterad linje.Rita en linje inuti kärlet från synnerven tills den första kärlförgreningen, efter kärlformen. Tryck på T-bokstaven på tangentbordet för att spela in det markerade området i ROI Manager. Välj verktyget Rak linje i menyraden.Dra en linje från synnerven tills det första kärlet förgrens. Tryck på T-bokstaven på tangentbordet för att spela in det markerade området i ROI Manager. Klicka på Mät på ROI-hanteraren för att hämta avståndsdata.Med menyradens ovala verktyg definierar du ett område som tillämpas lika på alla experimentella villkor. Det valda området måste vara en koncentrisk cirkel som dras runt synnerven. Tryck på T-bokstaven på tangentbordet för att spela in det markerade området i ROI Manager.Räkna manuellt antalet primära grenar som härrör från huvudfartyg inom urvalsområdet. Omvandla bilden till 8-bitarsläge. Gå till Plugins i menyraden, välj Kärlanalys, Kärltäthet.Definiera ett område med squareverktyget i menyraden där du vill mäta kärltätheten. Klicka på OK. Programmet visar ett nytt fönster med den information som krävs. I det första experimentella exemplet användes den syreinducerade retinopatimusmodellen.Intravitreal injektioner utfördes vid postnatala dag 12 för att bestämma effektiviteten av ett läkemedel som en antiangiogenic. Möss som injicerades med fordonet användes som kontroll. De avascular områdena definieras som zoner som saknar retinala blodkärl.Från de förvärvade bilderna kan avascular områden kvantifieras som summan av regionerna utan fartyg delade näthinnans totala yta. Områden med mekaniska skador visar också frånvaro av fartyg. För att identifiera skadade områden, analysera integriteten hos neuronala lager med Hoechst fläck.Neovessels är små kaliber fartyg som härstammar från befintliga fartyg av överlägsen vaskulär plexus. Vi beräknade området ockuperas av neovessels'tufts genom att kvantifiera neovaskulära området i näthinnan ockuperas av den totala ytan av näthinnan. Eftersom neovessels form och storlek varierar, kan de ibland se ut som skräp och artefakter.För att skilja neovessels, verifiera att tuften växer från ett moget kärl. För analys av dilatationen mätte vi huvudkärlets diameter på tre höjder före den första grenen. Forskare måste definiera ett förutbestämt avstånd för att mäta kärldiameter för att minska variationen mellan resultaten.Helst bör den längsta punkten från synnerven vara cirka 300 mikrometer. Vi föreslår att man utför analysen, och senare i genomsnitt minst sex djur per tillstånd. När det gäller tortuositet mäter vi avståndet som huvudkärlet färdas efter dess form, med avseende på det raka avståndet mellan synnerven och den första förgreningspunkten.Som vi kan se på bilden finns det heterogenitet i sinusiteten hos huvudkärlen. För att uppnå ett representativt resultat måste minst sex möss per tillstånd kvantifieras. De senaste parametrarna, vaskulär förgrening och densitet, analyserades i en metabolisk syndrom modell uppvisar icke-proliferative retinopathy.För mätning av kärlförgrening definierade vi kvantifieringsområdet genom att rita en koncentrisk cirkel, och sedan räknade vi, en efter en, de primära grenarna som härrör från ett huvudcentralkärl. Från de förvärvade bilderna kvantifierades kärltätheten som det område som upptogs av fartyg dividerat med roi-området, som var placerat på olika platser i varje mikrofotograf. Undvik att kvantifiera områden med mekaniska skador.Om det finns fler än två områden med punkteringar måste näthinnan kasseras. Sammanfattningsvis har vi i denna artikel visat klassiska, väletablerade och reproducerbara tekniker för att kvantifiera några av de mest relevanta parametrarna som tar hänsyn till i klinisk praxis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualisering av embryonala nervsystemet i hela-fäste Drosophila Embryon

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissekering av en mus Eye för en hel berget av pigmentepitelet

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissektion och Immunohistokemi av larver, pupal och vuxna<em&gt; Drosophila</em&gt; Näthinnor

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hela Mount immunomärkning av luktreceptor nervceller i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenn

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Hela-mount avbildning av Mouse Embryo Sensorisk Axon Projektioner

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

Hela Mount Märkning av Cilia i huvud Olfactory systemet Möss

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionstest av två näthinnor efter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hela Mount Dissekering och Immunofluorescence i vuxen mus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV-medierad transgenexpression av chimära konstruktioner för att studera Behavioral funktion GPCR Heteromers i möss

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel steg Dissection protokoll för hel-mount Framställning av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...