Name: quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies
Uploaded: 2022-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies at JoVE.com

Ceminco'dan Carlos Mas, María Pilar Crespo ve Cecilia Sampedro'ya (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Arjantin) konfokal mikroskopi yardımı için, Soledad Miró ve Victoria Blanco'ya özel hayvan bakımı için ve Laura Gatica'ya histolojik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca video prodüksiyonu ve baskısı için Victor Diaz'a (FCQ Kurumsal İletişim Sekreteri) ve paul Hobson'a makalenin eleştirel okuma ve dil revizyonu için teşekkür ederiz.
Bu makale Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (hepsi M.C.S.'ye).

C57BL/6J fareler, OFTALMIK ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Bildirimi'nin yönergelerine göre ele alındı. Deneysel prosedürler, Córdoba Ulusal Üniversitesi Kimya Bilimleri Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (CICUAL) tarafından tasarlanmış ve onaylanmıştır (HCD 1216/18).
1. Tampon çözeltilerinin ve reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>1x fosfat tampon salin (PBS) hazırlanması: 8 g sodyum klorür (NaCl), 0,2 ...

<ol>
	<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease.">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li><li>McDougal, D. H., Gamlin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+control+of+the+eye.">Autonomic control of the eye.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).</li><li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease.">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+alterations+in+the+retinal+microvasculature,+microcirculation,+and+microstructure.">Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).</li><li>Lavia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vessel+density+in+the+superficial+and+deep+plexuses+in+diabetic+retinopathy+is+associated+with+structural+changes+in+corresponding+retinal+layers.">Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers.</a> PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).</li><li>Rosenblatt, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+in+a+rigorous+longitudinal+image-based+assessment+of+retinopathy+of+prematurity.">Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).</li><li>Edwards, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Funduscopic+examination+of+patients+with+diabetes+who+are+admitted+to+hospital.">Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital.</a> Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).</li><li>Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+associated+with+diabetic+retinopathy.">The pathology associated with diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 7-14 (2017).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=angiography+metrics+predict+progression+of+diabetic+retinopathy+and+development+of+diabetic+macular+edema:+A+prospective+study.">angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study.</a> Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+coherence+tomography+angiography+of+vascular+abnormalities+in+the+living+human+eye.">Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).</li><li>Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+vascular+changes+in+macular+telangiectasia+type+2:+comparison+between+SD-OCT+and+OCT+angiography.">Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).</li><li>Gammons, M. V., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+oxygen+induced+retinopathy+in+rodents.">Models of oxygen induced retinopathy in rodents.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-203a-3p+inhibits+retinal+angiogenesis+and+alleviates+proliferative+diabetic+retinopathy+in+oxygen-induced+retinopathy+(OIR)+rat+model+via+targeting+VEGFA+and+HIF-1&#945;.">MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1&#945;.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).</li><li>Paz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+syndrome+triggered+by+fructose+diet+impairs+neuronal+function+and+vascular+integrity+in+ApoE-KO+mouse+retinas:+Implications+of+autophagy+deficient+activation.">Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li><li>Zarb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ossified+blood+vessels+in+primary+familial+brain+calcification+elicit+a+neurotoxic+astrocyte+response.">Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response.</a> Brain. 142 (4), 885-902 (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+autophagy+modulators+on+vascular,+glial,+and+neuronal+alterations+in+the+oxygen-induced+retinopathy+mouse+model.">Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).</li><li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye.">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li><li>Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+mouse+model+of+oxygen-induced+retinopathy.">Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy.</a> Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).</li><li>Guaiquil, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+retinopathy+of+prematurity+identifies+endothelial+cell+proliferation+as+a+potential+mechanism+for+plus+disease.">A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).</li><li>Mezu-Ndubuisi, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+angiography+quantifies+oxygen-induced+retinopathy+vascular+recovery.">In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery.</a> Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).</li><li>Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+vascular+tortuosity+as+an+early+outcome+measure+in+oxygen+induced+retinopathy+(OIR).">Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR).</a> Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microvascular+density+and+morphology+in+diabetic+retinopathy+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography+angiography.">Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 362 (2016).</li><li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ocular+angiogenesis:+from+development+to+pathologies.">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li><li>Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+diabetic+retinopathy:+Contribution+and+limitations+of+laboratory+research.">Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research.</a> Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).</li><li>Lorenc, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1R+regulates+the+extracellular+level+of+active+MMP-2,+pathological+neovascularization,+and+functionality+in+retinas+of+OIR+mouse+model.">IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model.</a> Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).</li><li>Ma, N., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+microglia+as+passenger+leukocytes+to+the+fate+of+intraocular+neuronal+retinal+grafts.">Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).</li><li>Mazzaferri, J., Larriv&#233;e, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+machine+learning+approach+for+automated+assessment+of+retinal+vasculature+in+the+oxygen+induced+retinopathy+model.">A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).</li><li>Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+in+3D:+quantification+of+vascular+growth+and+remodeling.">The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+indirect+contact+coculture+decrease+integrity+of+inner+blood-retina+barrier+model+in+vitro+by+upgrading+MMP-2/9+activity.">Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity.</a> Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).</li><li>Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDF-deficient+mice+exhibit+an+enhanced+rate+of+retinal+vascular+expansion+and+are+more+sensitive+to+hyperoxia-mediated+vessel+obliteration.">PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).</li><li>Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+D-amino+acid+oxidase+prevents+retinal+neurovascular+pathologies+in+diabetic+rats.">Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats.</a> Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).</li></ol>

Retinopatilerin hayvan modelleri vasküler gelişim, tadilat veya patolojik anjiogenez çalışmak için güçlü araçlardır. Bu çalışmaların sahadaki başarısı, in vivo ve ölüm sonrası farelerden veri sağlayan çok çeşitli tekniklerin gerçekleştirildiğini sağlayan dokuya kolay erişime dayanır26,27. Ayrıca, in vivo çalışmalar ve klinik analiz arasında, bu modellere katı izlenebilirlik ve güvenilirlik sağlayan...

Gözler iki arterio-venöz sistem tarafından beslenir: koroidal vaskülat, retina pigmentli epitel ve fotoreceptörleri sulayan harici bir damar ağı; ve ganglion hücreleri tabakasını ve retinanın iç nükleer tabakasını sulayan nöro-retinal vaskülat1. Retina vaskülatürü, uygun görsel sinyal transdüksiyonunun sağlanması için retina hücrelerine besin ve oksijen sağlayan ve atık ürünleri toplayan organize bir damar ağıdır. Bu vaskülatın bazı belirgin özellikleri vardır: otonom innervasyon eksikliği, damar tonunun içsel retina mekanizmaları tarafından düzenlenmesi ve karmaşık bir retinal-kan bariyerine sahip olması2. Bu nedenle, retinal vaskültür, gelişim sırasında sadece vaskülogenez değil, aynı zamanda bu damarların hastalıklarda geçirdiği değişiklikler ve patolojik anjiogenez üzerinde kapsamlı bir şekilde çalışmış birçok araştırmacının odak noktası olmuştur3. Retinopatilerde en sık gözlenen damar değişiklikleri damar genişlemesi, neovaskülarizasyon, damar arborizasyonu kaybı ve retina ana damarlarının deformasyonudur, bu da onları daha ziggaggy4,5,6 yapar. Açıklanan değişikliklerden biri veya daha fazlası klinisyenler tarafından tespit edilen en erken belirtilerdir. Vasküler görselleştirme hızlı, invaziv olmayan ve ucuz bir tarama yöntemi sağlar7. Vasküler ağaçta gözlenen değişikliklerin kapsamlı çalışması, retinopatinin proliferatif veya proliferatif olup olmadığını ve daha sonraki tedaviyi belirleyecektir. Proliferatif olmayan retinopatiler, diğerlerinin yanı sıra anormal vasküler morfoloji, azalmış vasküler yoğunluk, hücresel kılcal damarlar, perisit ölümü, makula ödemi ile kendini gösterebilir. Ek olarak, proliferatif retinopatiler ayrıca retina dekolmanını kolayca parçalayan veya indükleyen vitreus boşluğuna doğru artan vasküler geçirgenlik, hücre dışı yeniden şekillendirme ve vasküler tutamların oluşumunu geliştirir8.
Saptandıktan sonra, retinopati vasküler değişiklikleri ile izlenebilir9,10. Patolojinin ilerlemesi, hastalığın aşamalarını açıkça tanımlayan damarların yapısal değişiklikleri ile takip edilebilir11. Bu modellerdeki vasküler değişikliklerin nicelemesi, damar değişiklikleri ve nöronal ölümün korelasyona girmesine ve hastalığın farklı evrelerindeki hastalar için farmakolojik tedavilerin test edilmesine izin verdi.
Yukarıdaki ifadeler ışığında, retinopati çalışmalarında vasküler değişikliklerin tanınması ve nicelleştirilmesinin temel olduğunu düşünüyoruz. Bu çalışmada, farklı vasküler parametrelerin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Bunu yapmak için iki hayvan modeli istihdam edeceğiz. Bunlardan biri, Prematürite Retinopatisini ve proliferatif Diyabetik Retinopatinin bazı yönlerini taklit eden Oksijen kaynaklı retinopati fare modeli12'dir13,14. Bu modelde, avasküler alanları, neovasküler alanları ve ana damarların genişlemesini ve işkencesini ölçeceğiz. Laboratuvarımızda, proliferatif olmayan bir retinopatiye neden olan metabolik sendrom (MetS) fare modeli geliştirilmiştir15. Burada damar yoğunluğunu ve dallanmayı değerlendireceğiz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminuim foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4503</td>
			<td>quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>9632.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope FV1200</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td>with motorized plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covers</td>
			<td>Paul Marienfeld GmnH &#38; Co.</td>
			<td>111520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>119753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L&#160; tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z316121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA5201090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker GyroMini</td>
			<td>LabNet International</td>
			<td>S0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>SANXIN</td>
			<td>PHS-3D-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Analysis Fiji software</td>
			<td>Mai Elfarnawany</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Vessel_Analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of vascular parameters in whole mount retinas of mice with non-proliferative and proliferative retinopathies

Retinopatiler, gözün nörosensör dokusunu etkileyen heterojen bir hastalık grubudur. Nörodejenerasyon, glioz ve vasküler fonksiyon ve yapıda ilerleyici bir değişiklik ile karakterizedirler. Retinopatilerin başlangıcı görsel algıda ince bozukluklarla karakterize edilse de, vasküler pleksustaki değişiklikler klinisyenler tarafından tespit edilen ilk belirtilerdir. Neovaskülarizasyonun yokluğu veya varlığı, retinopatinin proliferatif olmayan (NPDR) veya proliferatif (PDR) olarak sınıflandırılıp sınıflandırılmadığını belirler. Bu anlamda, birkaç hayvan modeli endotel değişiklikleri, nöronal ölüm ve retinada meydana gelen diğer olaylarda yer alan alttaki mekanizmaları belirlemek için her aşamanın spesifik vasküler özelliklerini taklit etmeye çalıştı. Bu yazıda, doğum sonrası (P)17'de yetişkinlerde ve erken doğum farelerinde retinal vasküler parametrelerin ölçümü için gerekli prosedürlerin tam bir açıklamasını sunacağız. Daha sonra mikroskobik görselleştirme için tüm montajlarda Isolectin GSA-IB4 ile retinal vasküler boyama yapmak için protokolleri detaylandıracağız. Image J Fiji yazılımı ile görüntü işleme için önemli adımlar da sağlanmaktadır, bu nedenle okuyucular damar yoğunluğunu, çapını ve tortusitesini, damar dallanmasını ve ayrıca avasküler ve neovasküler alanları ölçebilecektir. Bu araçlar hem proliferatif olmayan hem de proliferatif retinopatilerdeki vasküler değişiklikleri değerlendirmek ve ölçmek için son derece faydalıdır.

Protokol bölümünde açıklandığı gibi, tek bir floresan boyama testinden vasküler morfolojiyi elde edebilir ve çeşitli ilgi parametrelerini nicel olarak değerlendirebilirsiniz. Belirli bir değişikliğin araştırılması, çalışılan retinopatinin türüne bağlı olacaktır. Bu makalede, avasküler ve neovasküler alanlar, tortuozite ve dilatasyon proliferatif retinopatinin bir fare modelinde değerlendirilmiş, vasküler dallanma ve yoğunluk ise proliferatif olmayan bir retinopatiye neden olan mets fare ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies at JoVE.com

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Bu makalede, tüm mount retinal preparatları için iyi kurulmuş ve tekrarlanabilir bir lektin lekesi testi ve proliferatif ve proliferatif olmayan retinopatilerde sıklıkla değiştirilen vasküler parametrelerin nicel ölçümü için gerekli protokoller açıklanmaktadır.

Proliferatif Olmayan ve Proliferatif Retinopatilerle Farelerin Tüm Mount Retinalarında Vasküler Parametrelerin Nicelemesi

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

Retinopatilerde vasküler değişiklikler klinisyenler tarafından tespit edilen ilk işarettir. Hastalığın ilerlemesini takip ederler ve bu değişikliklere göre bir tedavi seçerler. Patolojinin farklı aşamalarını incelemek için çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir.Bu çalışmada, farklı vasküler değişikliklerin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Bunun için iki hayvan modeli çalıştıracağız. Bunlardan biri, prematüritenin retinopatisini ve proliferatif diyabetik retinopatinin bazı yönlerini yeniden üreten Oksijen Kaynaklı Retinopati fare modelidir.Burada, avasküler alanları, neovasküler alanları ve arteriyolların genişlemesini ve tortuositesini ölçeceğiz. Laboratuvarımızda, üretken olmayan bir retinopatiye neden olan metabolik sendromlu bir fare modeli geliştirilmiştir. Bu çalışmada damar yoğunluğu ve dallanma değerlendirildi.Farelerin kurban vermesi üzerine makasla enükleatize edin. Enükle olmuş gözleri oda sıcaklığında bir saat boyunca taze hazırlanmış paraformaldehit ile sabitlayın. Diseksiyon mikroskobu altında, limbüs boyunca keserek korneaları makasla çıkarın ve tüm retinaları parçalara çıkarın.Gözün ön kısmını atın ve retinayı RPE-choroid'den ayırın. Retinaları 200 mikroliter tüpe yerleştirin. Daha sonra retinaları 100 mikrolitre TBS'de bloke edin ve permeabilize edin% 5 sığır serum albümin Triton altı saat boyunca dört derecede shaker nazik ajitasyon ile.Daha sonra retinayı bardağa yerleştirmek için tüpü ters çevirin ve engelleme solüsyonını pipetle çıkarın. İzoliktin içeren 100 mikroliter çözeltisi ekleyin. Numuneleri ışıktan korumak için tüpleri alüminyum folyo ile sarın.Retinaları lektin çözeltisi ile bir gecede dört derecede çalkalayıcıda hafif ajitasyon ile kuluçkaya yatırın. Retinaları 100 mikrolitre TBS-Triton ile çalkalayıcıda hafif ajitasyonla 20 dakika yıkayın. Bu adımı üç kez tekrarlayın.Retinayı bir slayda yerleştirin ve bir damla PBS ekleyin. Mikroskobun diseksiyon altında, retinanın kenarlarından optik sinire doğru eşit derecede uzak dört kesik gerçekleştirin. Retinanın yapraklarını açılmak için, tokmaklar veya küçük filtre kağıdı parçaları kullanın.Fotoreceptör tarafının aşağı dönük olduğundan emin olun. Kalan PBS'yi filtre kağıdıyla slayttan çıkarın. Ardından bir montaj ortancası ve kapak kılıfı ekleyin.Oda sıcaklığında bir saat kurumasına izin verin. Slaytları ışıktan korunan dört derecede saklayın. Konfokal mikroskopta, slaydı plakaya yüzüstü yerleştirin.Retinal vaskülatın üstün pleksusunun odaklanması ve görüntü alımını başlatmak için bir alan seçin. Yazılımda genel lazer parametrelerini ayarlayın. Koordinatları X, Y ve Z eksenlerinde ayarlayın.Taramayı başlatın. Tarama işlemi tamamlandıktan sonra görüntüyü açın ve tercih edilen bir uzantıyla kaydedin. ImageJ FIJI yazılımında, Menü Çubuğu'na gidin ve Dosya, Aç'ı tıklatın.İşlenmek üzere görüntüyü seçin. Biyo-Biçimler İçe Aktarma Seçeneği penceresinde, OME-XML Meta Verilerini Görüntüle'yi seçin ve OME Meta Verileri penceresinin OK.In tıklatarak piksel boyutu bilgilerini arayın. Bu verileri kopyalayın.Görüntü kalibrasyonu için Menü Çubuğu'na gidin ve Görüntü Özellikleri'ni seçin. Bilgileri kopyalayın ve Tamam'ı tıklatın. Görüntüye tercih edilen bir lut atayın. Tüm yığını tek bir görüntüde görselleştirmek için Menü Çubuğu'na gidin ve Görüntü, Yığınlar, Z Projesi'ni seçin.Görüntülenen projeksiyon penceresinde, gemilerin görselleştirildiği tüm yığınları seçin. Projeksiyon Türü'nde Ortalama Yoğunluk'u seçin ve Tamam'ı tıklatın. Menü Çubuğu, Görüntü, Ayarla, Parlaklık/Kontrast'a gidin. Uygula'yı tıklatın ve değişiklikleri kaydedin.Parlaklık ve kontrast için seçilen parametreleri kopyalayın. Bunlar tüm görüntüler için aynı olmalıdır. Menü Çubuğu'nda Asa aracını seçin.Oluşan damarlardan yoksun retina bölgesini seçin. Yatırım Getirisi Yöneticisi'nde seçili alanları kaydetmek için klavyede T tuşuna basın. Araç alanı bilgilerini edinmek için Yatırım Getirisi Yöneticisi'nde Ölçül'ü tıklatın.Retinanın toplam alanını ölçmek için bu adımları tekrarlayın. Menü Çubuğu'nda Asa aracını seçin. Neovesselleri daha iyi görselleştirmek için görüntüyü yakınlaştırın.Asa aracı ile neovesselleri tek tek seçin. Seçili alanı yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyedeki T harfine basın. Alan verilerini elde etmek için Yatırım Getirisi Yöneticisi'nde Ölçü'nün üzerine gelenleri tıklatın.Menü Çubuğu'nda Düz Çizgi aracını seçin. Damar duvarını daha iyi görselleştirmek için görüntüyü yakınlaştırın. İlk daldan önce ana damara üç transversal hat gerçekleştirin.Seçili alanları yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyede T tuşuna basın. Mesafe verilerini elde etmek için Yatırım Getirisi Yöneticisi'nde Ölç'ü tıklatın. Menü Çubuğu'nda, farenin sağ düğmesiyle Düz Çizgi aracı simgesini tıklatın ve Parçalı Çizgi'yi seçin.Damar şeklini takip ederek, ilk damar çarpmasına kadar optik sinirden damarın içine bir çizgi çizin. Seçili alanı yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyedeki T harfine basın. Menü Çubuğu'nda Düz Çizgi aracını seçin.optik sinirden ilk damar çarpmasına kadar bir çizgi çekin. Seçili alanı yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyedeki T harfine basın. Mesafe verilerini elde etmek için Yatırım Getirisi Yöneticisi'ndeki Ölçü'nün üzerine gelenleri tıklatın.Menü Çubuğu'nun Oval aracıyla, tüm deneysel koşullara eşit olarak uygulanan bir alan tanımlayın. Seçilen alan optik sinirin etrafına çizilmiş eşmerkezli bir daire olmalıdır. Seçili alanı yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyedeki T harfine basın.Manuel olarak, seçim alanının içindeki ana damarlardan kaynaklanan birincil dalların sayısını sayın. Görüntüyü 8 bit moda dönüştürün. Menü Çubuğundaki Eklentiler'e gidin, Gemi Analizi, Damar Yoğunluğu'nı seçin.Menü Çubuğu'nun Kare aracıyla gemi yoğunluğunu ölçmek istediğiniz bir alan tanımlayın. Tamam'ı tıklatın. Program, gerekli bilgileri içeren yeni bir pencere görüntüler. İlk deneysel örnekte Oksijen Kaynaklı Retinopati fare modeli kullanıldı.İntravitreal enjeksiyonlar 12. Araç enjekte edilen fareler kontrol olarak kullanıldı. Avasküler alanlar retina kan damarlarından yoksun bölgeler olarak tanımlanır.Elde edilen görüntülerden, avasküler alanlar, damarları olmayan bölgelerin toplamı retinanın toplam alanını böldüğü için ölçülebilir. Mekanik hasar alan alanlar da damar yokluğu gösterir. Hasarlı bölgeleri tanımlamak için Hoechst lekesi ile nöronal tabakaların bütünlüğünü analiz edin.Neovesseller, üstün vasküler pleksusların önceden var olan damarlarından kaynaklanan küçük kalibreli kaplardır. Neovessels'tuftların kapladığı alanı, retinanın toplam alanı olan retinanın neovasküler alanını ölçerek hesapladık. Neovessellerin şekli ve boyutu değişken olduğundan, bazen enkaz ve eserlere benzer görünebilirler.Neovesselleri ayırt etmek için, tutamın olgun bir damardan büyüdüğünü doğrulayın. Dilatasyonun analizi için ilk daldan önce ana damar çapını üç yükseklikte ölçtük. Araştırmacılar, sonuçlar arasındaki değişkenliği azaltmak için damar çaplarını ölçmek için önceden belirlenmiş bir mesafe tanımlamalıdır.İdeal olarak, optik sinirden en uzak nokta yaklaşık 300 mikrometre olmalıdır. Analizi ve daha sonra durum başına ortalama en az altı hayvan yapmayı öneriyoruz. İşkence ile ilgili olarak, ana damarın şeklini takip ederek kat ettiği mesafeyi, optik sinir ile ilk dallanma noktası arasındaki düz çizgi mesafesine göre ölçüyoruz.Görüntüde gördüğümüz gibi, ana damarların sinüslüğünde heterojenlik vardır. Temsili bir sonuç elde etmek için, durum başına altı fareden az olmamak üzere ölçülmelidir. Proliferatif olmayan retinopati sergileyen metabolik sendrom modelinde en son parametreler, damar dallanma ve yoğunluk analiz edildi.Vasküler dallanmanın ölçümü için eşmerkezli bir daire çizerek nicelik alanını tanımladık ve daha sonra ana merkezi bir damardan kaynaklanan birincil dalları tek tek saydık. Elde edilen görüntülerden, damar yoğunluğu, her mikrofotoğrafçıda farklı yerlere konumlandırılmış olan yatırım getirisinin alanına bölünen damarların kapladığı alan olarak ölçüldü. Mekanik hasara sahip alanları ölçmekten kaçının.Delinmiş ikiden fazla alan varsa, retina atılmalıdır. Özetle, bu makalede, klinik uygulamada dikkate alarak en alakalı parametrelerden bazılarını ölçmek için klasik, köklü ve tekrarlanabilir teknikler gösterdik.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Larva, Pupa ve Erişkin diseksiyonu ve İmmünohistokimya<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinaları

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

Fareler Ana Koku Sistemde Cilia Whole Dağı Etiketleme

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

Kimerik Yapılar HSV-aracılı Transgen İfade Farelerde GPCR Heteromers Davranışsal Fonksiyon Eğitim için

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...