Name: live imaging and quantification of viral infection in k18 hace2 transgenic mice using reporter-expressing recombinant sars-cov-2
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2 at JoVE.com

Wir möchten den Mitgliedern unseres Instituts (Texas Biomedical Research Institute) für ihre Bemühungen danken, unsere Einrichtungen während der COVID-19-Pandemie voll funktionsfähig und sicher zu halten. Wir möchten uns auch bei unserem Institutional Biosafety Committee (IBC) und Spell (IACUC) für die zeiteffiziente Überprüfung unserer Protokolle bedanken. Wir danken Dr. Thomas Moran von der Icahn School of Medicine am Mount Sinai für die Bereitstellung des monoklonalen SARS-CoV-Kreuzreaktiv-1C7C7-Nukleokapsids (N)-Protein-Antikörpers. Die SARS-CoV-2-Forschung im Martinez-Sobrido-Labor wird derzeit durch die NIAID/NIH-Zuschüsse RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 und R43AI165089-01 unterstützt; das Verteidigungsministerium (DoD) gewährt W81XWH2110095 und W81XWH2110103; die San Antonio Partnership for Precision Therapeutic; das Texas Biomedical Research Institute Forum; das Health Science Center der University of Texas in San Antonio; die San Antonio Medical Foundation; und vom Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), einem NIAID-finanzierten Exzellenzzentrum für Influenza-Forschung und -Reaktion (CEIRR, Vertrag # 75N93021C00014).

Protokolle mit transgenen K18-hACE2-Mäusen wurden vom Institutional Biosafety Committee (IBC) des Texas Biomedical Research Institute (TBRI) und dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Alle Experimente folgen den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren des Nationalen Forschungsrats40. Bei der Arbeit mit Mäusen ist die entsprechende persönliche Schutzausrüstung (PSA) erforderlich.
1. Verwendung von ...

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Dieses Protokoll demonstriert die Machbarkeit der Verwendung dieser rSARS-CoV-2-exprimierenden Reportergene zur Überwachung von Virusinfektionen in vivo. Beide Reporter-exprimierenden rekombinanten Viren bieten ein hervorragendes Werkzeug für die Untersuchung von SARS-CoV-2-Infektionen in vivo. Die beschriebenen ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) und in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) Bildgebungssysteme stellen eine ausgezeichnete Option dar, um die Dynamik der SARS-CoV-2-Infektion, der viralen Pat...

Das Severe Acute RespiratorySyndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ist ein umhülltes, positiv-sense, einzelsträngiges RNA-Virus, das zur Betacoronavirus-Linie in der Familie der Coronaviridae 1 gehört. Diese virale Familie ist in Alpha-, Beta-, Gamma- und Delta-Coronavirus1 unterteilt. Alpha- und Betacoronaviren infizieren hauptsächlich Säugetiere, während Gamma- und Deltacoronaviren fast ausschließlich Vögel infizieren2. Bisher haben sieben Coronaviren (CoV) Artenbarrieren überschritten und sind als humane Coronaviren (HCoV) entstanden: zwei Alpha-CoVs (HCoV-229E und HCoV-NL63) und fünf Beta-CoVs (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Middle East respiratory syndrome coronavirus [MERS-CoV] und SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV und SARS-CoV-2 sind hochpathogen und verursachen eine schwere Infektion der unteren Atemwege7. Vor der Entstehung von SARS-CoV-2 gab es zwei durch CoVs verursachte epidemische Ausbrüche: SARS-CoV in Guangdong Providence, China, von 2002-2003, mit einer Todesfallrate (CFR) von etwa 9,7%; und MERS-CoV im Nahen Osten von 2012 bis heute, mit einem CFR von etwa 34%7,8. SARS-CoV-2 hat einen Gesamt-CFR zwischen 3,4% und 49%, wobei die zugrunde liegenden Bedingungen zu einem höheren CFRvon 8,9 beitragen. Seit seiner Entdeckung im Dezember 2019 in Wuhan, China, ist SARS-CoV-2 für über 242 Millionen Infektionen beim Menschen und mehr als 4,9 Millionen Todesfälle bei Menschen weltweitverantwortlich 7,10,11,12. Insbesondere seit Ende 2020 haben neue SARS-CoV-2-Varianten der Besorgnis (VoC) und Varianten von Interesse (VoI) die Virusmerkmale, einschließlich Übertragung und Antigenität 9,13, und die allgemeine Richtung der COVID-19-Pandemie beeinflusst. Für die Behandlung von SARS-CoV-2-Infektionen gibt es derzeit nur eine US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) therapeutisches antivirales (Remdesivir) und ein Emergency Use Authorization (EUA) Medikament (Baricitinib, in Kombination mit Remdesivir zu verabreichen)14. Es gibt auch 6 zugelassene monoklonale EUA-Antikörper: REGEN-COV (Casirivimab und Imdevimab, zusammen verabreicht), Sotrovimab, Tocilizumab und Bamlanivimab und Etesevimab, die zusammenverabreicht werden 15,16,17,18,19. Derzeit gibt es nur einen von der FDA zugelassenen prophylaktischen Impfstoff, Pfizer-BioNTech, und zwei weitere prophylaktische Impfstoffe (Moderna und Janssen) wurdenvon der EUA zugelassen 20,21,22,23,24. Mit der unkontrollierten Infektionsrate und dem Aufkommen von VoC und VoI stellt SARS-CoV-2 jedoch immer noch eine Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar. Daher sind dringend neue Ansätze erforderlich, um effiziente Prophylaxe- und Therapeutika zur Kontrolle der SARS-CoV-2-Infektion und der noch anhaltenden COVID-19-Pandemie zu identifizieren.
Die Untersuchung von SARS-CoV-2 erfordert aufwändige Techniken und sekundäre Ansätze, um das Vorhandensein des Virus in infizierten Zellen und/oder validierten Tiermodellen der Infektion zu identifizieren. Die Verwendung der umgekehrten Genetik hat es ermöglicht, rekombinante Viren zu erzeugen, um wichtige Fragen in der Biologie von Virusinfektionen zu beantworten. Zum Beispiel haben Techniken der umgekehrten Genetik Mittel zur Verfügung gestellt, um die Mechanismen von Virusinfektionen, Pathogenese und Krankheiten aufzudecken und zu verstehen. Ebenso haben Ansätze der Reverse Genetik den Weg geebnet, rekombinante Viren ohne virale Proteine zu entwickeln, um ihren Beitrag zur viralen Pathogenese zu verstehen. Darüber hinaus wurden Techniken der Umkehrgenetik eingesetzt, um rekombinante Viren zu erzeugen, die Reportergene für In-vitro- und In-vivo-Anwendungen exprimieren, einschließlich der Identifizierung prophylaktischer und/oder therapeutischer Ansätze zur Behandlung von Virusinfektionen. Fluoreszierende und biolumineszierende Proteine sind aufgrund ihrer Empfindlichkeit, Stabilität und einfachen Detektion aufgrund der Verbesserung neuer Technologien die am häufigsten verwendeten Reportergene25,26. In vitro hat sich gezeigt, dass fluoreszierende Proteine als bessere Option für die Lokalisierung von Viren in infizierten Zellen dienen, während Luciferasen für Quantifizierungsstudien bequemer sind27,28,29. In vivo werden Luciferasen gegenüber fluoreszierenden Proteinen für die Bildgebung ganzer Tiere bevorzugt, während fluoreszierende Proteine für die Identifizierung infizierter Zellen oder Ex-vivo-Bildgebung 30,31,32 bevorzugt werden. Die Verwendung von Reporter-exprimierenden rekombinanten Viren hat in vielen Familien als leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Viren gedient, darunter Flaviviren, Enteroviren, Alphaviren, Lentiviren, Arenaviren und Influenzaviren 28,33,34,35,36.
Um den Bedarf an sekundären Ansätzen zur Untersuchung von SARS-CoV-2 und zur Charakterisierung der Echtzeit-SARS-CoV-2-Infektion in vivo zu überwinden, haben wir replikationskompetente rekombinante (r)SARS-CoV-2-Proteine erzeugt, die biolumineszierende (Nanoluciferase, Nluc) oder fluoreszierende (Venus) Proteine unter Verwendung unserer zuvor beschriebenen bakteriellen künstlichen Chromosomen (BAC) -basierten umgekehrten Genetik exprimieren, die als eine einzige Kopie in E. coli beibehalten werden. um die Toxizität von Virussequenzen während ihrer Ausbreitung in Bakterienzu minimieren 37,38. Insbesondere rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus zeigten in vivo eine rSARS-CoV-2/WT-ähnliche Pathogenität. Die hohe Venusexpression von rSARS-CoV-2/Venus ermöglichte den Nachweis einer Virusinfektion in der Lunge infizierter transgener K18 hACE2-Mäuse mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS)39. Die Spiegel der Venusexpression korrelierten gut mit viralen Titern, die in der Lunge nachgewiesen wurden, was die Machbarkeit der Verwendung der Venusexpression als gültiger Ersatz der SARS-CoV-2-Infektion zeigt. Mit rSARS-CoV-2/Nluc konnten wir die Dynamik der Virusinfektion in Echtzeit verfolgen und die SARS-CoV-2-Infektion in vivo mit dem gleichen IVIS-Ansatz bei transgenen K18-hACE2-Mäusen longitudinal bewerten.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Triton X-100</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td>Store at room temperature (RT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% DEAE-Dextran</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin solution, neutral buffered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ami HT</td>
			<td>Spectral Instruments Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aura Imaging Software 3.2.0</td>
			<td>Spectral Instruments Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), 35%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia gas machine</td>
			<td>Veterinary Anesthesia Systems, Inc.</td>
			<td>VAS 2001R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism Version 9.1.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MARS Data Analysis Software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MB10 tablets</td>
			<td>QUIP Laboratories</td>
			<td>MBTAB1.5</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar FSX</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>PHERAstar FSX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precelleys Evolution homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tissue homogenizing CK14 &#8211; 7 mL</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000940-LYSK0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 EasYFlask</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4002</td>
			<td>ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging and quantification of viral infection in k18 hace2 transgenic mice using reporter-expressing recombinant sars-cov-2

Die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) Pandemie wurde durch das schwere akute Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht. Bis heute war SARS-CoV-2 weltweit für über 242 Millionen Infektionen und mehr als 4,9 Millionen Todesfälle verantwortlich. Ähnlich wie bei anderen Viren erfordert die Untersuchung von SARS-CoV-2 die Verwendung experimenteller Methoden, um das Vorhandensein von Viren in infizierten Zellen und / oder in Tiermodellen nachzuweisen. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir replikationskompetente rekombinante (r)SARS-CoV-2 erzeugt, die biolumineszierende (Nanoluciferase, Nluc) oder fluoreszierende (Venus) Proteine exprimiert. Diese Reporter-exprimierenden rSARS-CoV-2 ermöglichen die Verfolgung von Virusinfektionen in vitro und in vivo basierend auf der Expression von Nluc- und Venus-Reportergenen. Hier beschreibt die Studie die Verwendung von rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus zum Nachweis und zur Verfolgung einer SARS-CoV-2-Infektion im zuvor beschriebenen transgenen K18-Modell der Infektion mit humanem Angiotensin-Converting-Enzym 2 (hACE2) unter Verwendung von In-vivo-Bildgebungssystemen (IVIS). Diese rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus zeigen rSARS-CoV-2/WT-ähnliche Pathogenität und virale Replikation in vivo. Wichtig ist, dass die Nluc- und Venusexpression es uns ermöglicht, Virusinfektionen in vivo und ex vivo bei infizierten Mäusen direkt zu verfolgen. Diese rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus stellen eine ausgezeichnete Option dar, um die Biologie von SARS-CoV-2 in vivo zu untersuchen, Virusinfektionen und assoziierte COVID-19-Erkrankungen zu verstehen und wirksame prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen zur Bekämpfung der SARS-CoV-2-Infektion zu identifizieren.

rSARS-CoV-2/Nluc-Infektion in transgenen K18-hACE2-Mäusen (Abbildungen 1 und 2) Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung des rSARS-CoV-2/WT (oben) und rSARS-CoV-2/Nluc (unten), das zur Beurteilung von Infektionen in vivo verwendet wird. Abbildung 1B zeigt das schematische Flussdiagramm, das zur Bewertung der rSARS-CoV-2/Nluc-Infektionsdynamik in transgenen K18-hACE2-Mäusen ange...

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Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Dieses Protokoll beschreibt die Dynamik von Virusinfektionen unter Verwendung von Luciferase- und Fluoreszenz-exprimierenden rekombinanten (r)SARS-CoV-2 und einem in vivo Bildgebungssystem (IVIS) in transgenen K18 hACE2-Mäusen, um den Bedarf an sekundären Ansätzen zu überwinden, die zur Untersuchung von SARS-CoV-2-Infektionen in vivo erforderlich sind.

Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit Reporter-exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Unser Protokoll beschrieb die Verwendung von fluoreszierendem oder lumineszierend exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2 für die In-vivo- und Ex-vivo-Live-Bildgebung und das virale Tracking im transgenen K18-ACE2-Mausmodell der SARS-CoV-2-Infektion. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Anwendung und Durchführbarkeit des viralen Nachweises und Trackings für In-vivo- und Ex-vivo-Studien von SARS-CoV-2 im transgenen K18-Modell der transgenen ACE2-Maus. Die Verwendung der In-vivo-Bildgebung von SARS-CoV-2 im transgenen K18-Modell der humanen ACE2-Maus stellt eine ausgezeichnete Option dar, um Therapeutika zur Behandlung von SARS-CoV-2-Infektionen in vivo zu evaluieren.Die Implementierung von Reportern SARS-CoV-2 stellt eine ausgezeichnete Option dar, um Pathogenität, Virusreplikation und Trophismus in vivo zu bewerten. Für In-vivo-Studien mit Luciferase, die SARS-CoV-2 exprimieren, wird empfohlen, die Mäuse zu rasieren und nach der Substratinjektion eine sofortige Bildgebung durchzuführen, um das Biolumineszenzsignal zu verbessern. Beginnen Sie mit der Biolumineszenzüberwachung, indem Sie das In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) initiieren und die Parameter einrichten, klicken Sie auf den Bildmodus auf Biolumineszenz, öffnen Sie dann den Filter und stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto.Als nächstes entfernen Sie eine bereits rasierte und betäubte Maus aus der Isolationskammer und verwenden Sie eine 25-Gauge-Nadel, um 100 Mikroliter des 1 bis 10 in PBS verdünnten Luciferase-Substrats retro-orbital auf die Maus zu verabreichen. Legen Sie dann die Maus zurück in die Isolierkammer, übertragen Sie die Isolationskammer an die IVIS-Maschine, die mit einer Heizkomponente ausgestattet ist, um Unterkühlung zu verhindern, und schließen Sie die IVIS-Imager-Tür, um die Bildgebung zu initialisieren, indem Sie im Softwareprogramm Acquire auswählen. Um die aufgenommenen Biolumineszenzbilder zu analysieren, verwenden Sie das ROI- oder Region of Interest-Tool in der Software, um das genaue Signal zu bestimmen und den Fluss zu messen.Starten Sie die Imaging-Software und richten Sie die Parameter ein. Klicken Sie im Bildmodus auf Fluoreszenz, stellen Sie die Anregung auf 500 Nanometer und die Emissionsfilter auf 530 Nanometer ein und stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto ein. Führen Sie Nektroskopie durch und entfernen Sie Lungen von Mäusen.Legen Sie die ausgeschnittenen Lungen in eine 6-Well-Platte, die zwei Milliliter 1X PBS enthält, und spülen Sie sie ab, um überschüssiges Blut zu entfernen. Desinfizieren und reinigen Sie chirurgische Werkzeuge zwischen den Proben mit 70% Ethanol. Nachdem Sie das IVIS-Gerät initialisiert haben, legen Sie die Lungen auf ein schwarzes Blatt und trennen Sie die Gewebe voneinander.Legen Sie dann das Tablett in die Isolierkammer in der Biosicherheitskabine und übergeben Sie dann die Isolierkammer in das IVIS. Schließen Sie die Tür des IVIS-Imagers und klicken Sie auf Erfassen, um das Bildgebungssystem zu starten. Um die Fluoreszenz zu analysieren, verwenden Sie das ROI-Tool und zeichnen Sie ROIs um jede der einzelnen Lungen.Messen Sie jeden ROI manuell und verwenden Sie dann die angegebenen durchschnittlichen Strahlungseffizienzwerte und subtrahieren Sie von den Schein-infizierten Mäusen. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, legen Sie das Gewebe in eine Kryotube, um das Trockeneis einzufrieren, um es bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Verarbeitung zu lagern. Unter Verwendung des aus den Gewebehomogenaten erhaltenen Supernats führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung durch und infizieren konfluierende Monoschichten von Vero E6-Zellen mit einem Milliliter jeder überstehenden Verdünnung in Verdreifachungen.Lassen Sie das Virus eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%Kohlendioxid-Inkubator adsorbieren. Sobald dies erledigt ist, waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter 1X PBS und inkubieren Sie die Zellen dann in zwei Millilitern Postinfektionsmedien mit 1% Agar im befeuchteten 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 72 Stunden. Nach der Inkubation inaktivieren Sie die Platten in 10% neutralem gepuffertem Formalin für 24 Stunden bei vier Grad Celsius, um sicherzustellen, dass die gesamte Platte untergetaucht ist.Nehmen Sie die Platten aus der Biosicherheitsstufe drei und waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter 0,5% Triton X-100 für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes blockieren Sie die permeabilisierten Zellen mit einem Milliliter 2,5 Rinderserumalbumin oder BSA und PBS für eine Stunde bei 37 Grad Celsius, gefolgt von einer Inkubation in einem Milliliter von einem Mikrogramm pro Milliliter des SARS-CoV-Nukleokapsidproteins kreuzreaktiver monoklonaler Antikörper 1C7C7, der in 2,5 BSA für eine Stunde bei 37 Grad Celsius verdünnt wurde. Waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter 1X PBS und entwickeln Sie die Plaques mit den ABC- und Diaminobenzol- oder DAB-Peroxidase-Substrat-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers und berechnen Sie dann die viralen Titer als plaquebildende Einheiten pro Milliliter.In der Studie wurde beobachtet, dass die biolumineszente Nanoluciferase oder Nluc leicht nachgewiesen wurde und Mäuse mit dem rSARS-CoV-2 Nluc infiziert waren, aber nicht diejenigen, die mit rSARS-CoV-2 Wildtyp oder Mock infiziert waren. Die quantitativen Analysen zeigten die Nluc-Intensität an verschiedenen Tagen nach der Infektion. Die groben Läsionen auf der Lungenoberfläche von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2 Nluc infiziert waren, waren vergleichbar mit denen in der rSARS-CoV-2-Wildtyp-infizierten Gruppe.Darüber hinaus wurden virale Titer nachgewiesen und die rSARS-CoV-2 Nluc-infizierten Mäuse waren vergleichbar mit denen, die an verschiedenen Tagen nach der Infektion mit dem rSARS-CoV-2-Wildtyp in allen Organen infiziert waren. Gleichzeitig wurde die Nluc-Aktivität nur in den Organen von rSARS-CoV-2 Nluc-infizierten Mäusen nachgewiesen. Eine separate Gruppe von Schein- und Virus-infizierten Mäusen wurde 12 Tage lang auf Veränderungen des Körpergewichts und des Überlebens überwacht.Mäuse, die mit rSARS-CoV-2 Nluc und rSARS-CoV-2 Wild-Typ infiziert sind, verloren bis zu 25% ihres Körpergewichts und alle erliegen zwischen sieben und acht Tagen nach der Infektion einer Virusinfektion. Nach einer rSARS-CoV-2-Venusinfektion wurde die Venusexpression in allen Lungen von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2 Venus infiziert waren, leicht nachgewiesen, aber nicht von solchen, die mit rSARS-CoV-2 Wildtyp oder Scheininfektion infiziert waren. Die quantitativen Analysen zeigten, dass die Intensität der Venus zwei Tage nach der Infektion ihren Höhepunkt erreicht und im Verlauf der Infektion und der Lunge infizierter Mäuse abnimmt.Bilder der Lungenoberfläche zeigten, dass grobe Läsionen von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2 Venus infiziert waren, mit denen von rSARS-CoV-2-Wildtyp-infizierten Mäusen vergleichbar waren. Auch die Infektion mit rSARS-CoV-2 Venus führte zu vergleichbaren viralen Titern wie bei Mäusen, die in allen Organen mit dem Wildtyp rSARS-CoV-2 infiziert waren. Die mit rSARS-CoV-2 Venus und rSARS-CoV-2 Wildtyp infizierten Mäuse verloren bis zu 25% ihres Körpergewichts und erlagen am neunten Tag nach der Infektion einer Virusinfektion ohne Überleben.Die Ergebnisse von Reportern, die SARS-CoV-2 exprimieren, haben sich als gültige Surrogate einer Virusinfektion erwiesen. Dies könnte somit zu einer schnellen Identifizierung und Bewertung von Gegenmaßnahmen zur Behandlung der SARS-CoV-2-Infektion führen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Ein luziferasefluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisierung von SARS-CoV-2 mit Immuno-RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Nachweis von SARS-CoV-2 neutralisierenden Antikörpern mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzbildgebung von Pseudovirus-Infektionen

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Ein schneller Multiplex-Dual-Reporter-IgG- und IgM-SARS-CoV-2-Neutralisationsassay für ein multiplexed Bead-basiertes Durchflussanalysesystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Nachweis eines SARS-CoV-2-Rezeptor-bindenden Domänenantikörpers mit einem HiBiT-basierten Bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Effiziente SARS-CoV-2 quantitative Reverse Transkriptase PCR Speicheldiagnostikstrategie unter Verwendung von Open-Source-Pipettierrobotern

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Pseudotypisierte Viren als molekulares Werkzeug zur Überwachung humoraler Immunantworten gegen SARS-CoV-2 mittels Neutralisationsassay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...